核酸杂交酶联桥接分析系统定量分析寡核苷酸

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摘 要 建立了基于核酸杂交及连接酶和核酸内切酶的酶联桥接分析（ELBA）系统，用于生物基质中反义寡核苷酸（ODN）药物的定量分析。对ELBA系统中的亲和素包被、俘获探针/检测探针浓度、T4 DNA 连接酶及S1核酸酶用量、碱性磷酸酶底物反应时间等条件进行了优化，确定使用中性亲和素包被的酶标板, 俘获探针与检测探针浓度比为2∶3，S1酶为40 U/孔，显色15 min为最优条件，并考察了生物基质效应和稀释效应对方法的影响，建立了猕猴血浆中反义寡核苷酸的定量方法,并进行方法学确证，方法学定量范围为0.10～6.25 nmol/L。本方法成功应用于反义硫代寡核苷酸药物在低剂量（1 mg/kg）静脉滴注后的药代动力学研究，成为生物基质中寡核苷酸类药物定量分析的有效手段。

关键词 寡核苷酸； 药代动力学； 定量； 核酸杂交； 酶联桥接分析系统

1 引 言

反义（Antisense，AS）寡核苷酸（Oligodeoxynucleotide，ODN）、免疫刺激基序（CpG）ODN等分子，在抗肿瘤、抗病毒治疗等基因治疗领域中占据重要地位。迄今，ASODN与CpG ODN类药物经美国FDA批准上市，已有多种该类药物处于临床前和临床试验阶段\。

目前，生物样品中ODN药物的定量分析方法最为成熟，其中应用最多的是非放射性同位素标记定量分析方法， 包括毛细管电泳（Capillary electrophoresis， CE）和高效液相色谱法（High performance liquid chromatography， HPLC）。CE方法对于ODN的检测具有高分辨率、可分辨相差一个核苷酸的ODN，其在血浆基质中对ODN的最低定量限（Lower limit of quantification， LLOQ）约在70 g/L（约12 nmol/L）\水平。本课题组曾利用改良的毛细管非胶筛分电泳方法对硫代修饰ASODN进行药代动力学研究\，可描述5 mg/kg以上剂量给药后猕猴的血浆动力学行为，但该方法对于末端消除相数据的获得不甚理想，对于更低剂量下（如1 mg/kg）给药后的药时曲线描述更是无能为力。HPLC方法的分辨率和灵敏度与CE方法相比略低。目前ODN类药物通常在较低剂量下（≤1 mg/kg \）给药即能发挥药效，这对定量分析方法学的灵敏度提出越来越高的要求。上述方法的灵敏度难以达到对ODN在血浆和组织中药代动力学（Pharmacokinetics，PK）终末消除相的定量能力（浓度通常低于10 nmol/L） \。此外，上述两种主流分析方法还有一个共同的缺陷，即样品前处理过程相当复杂，绝对回收率低，分析周期长、成本高，应用受限\。

核酸分子杂交的酶联桥接（Enzymelinked bridging assay，ELBA）法基于核酸杂交原理，利用一个锚定的、3′端与待测反义寡核苷酸（Test ODN）序列互补的俘获探针俘获生物基质中的Test ODN，再通过连接酶将检测探针（序列与俘获探针5′端互补，3′端偶联酶标显色系统）与上述核酸杂交复合物相连，建立桥接体系。S1核酸内切酶是单链特异性的核酸内切酶，可以降解双链核酸中的单链或缺口处切割双链 DNA，在上述桥接体系中，可以通过酶切将不能与检测探针连接从而构成完整双链的差减ODN序列（即ODN的降解产物，其3′端与检测探针5′端之间有1个以上的碱基缺口）去除，以保证桥接系统的序列长度特异性。最终利用检测探针3′端偶联的酶标显色系统，对Test ODN原形进行定量。酶联桥接分析系统的的原理如图1所示。该方法在灵敏度、特异性以及适用性上均较传统的定量分析方法具有优势\，因此，基于核酸杂交的ELBA系统在寡核酸类药物PK研究中具有巨大的应用前景。本研究对所建立ELBA系统中的诸多条件，包括亲和素包被、俘获探针与检测探针浓度比、T4连接酶及S1核酸酶用量、生物基质效应、稀释效应以及显色系统等进行了细致的优化，使系统更具稳定性与通用性。

图1 酶联桥接分析系统的原理

Fig．1 Principle of enzymelinked bridging assay （ELBA）

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

HeraeusBB5060培养箱（上海贺利氏公司）；超纯水系统（美国MILLIPORE公司）；微量振荡器（国华电器有限公司）；微量加样器（美国Gilson公司）；电热恒温水浴锅（北京长风公司）；MK 3酶标仪（德国Thermo公司）。

链霉亲和素（Streptavidin，SA, Promega公司）；链霉亲和素包被酶标板（StreptavidinCoated 96well plate, Cayman Chemical公司）；T4 DNA 连接酶（NEB公司）；S1核酸酶（Invitrogen公司）；酶标抗地高辛抗体（Antidigoxigeninalkaline Phosphatase，ADAP, Roche公司）；中性亲和素包被的酶标板（ReactiBind NeutrAvidin Coated），封闭液（SuperBlock Blocking buffer）和显色液（pNitrophenyl phosphate，PNPP）均购自Pierce公司。

本研究中采用ODN及其核酸探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，其序列结构见表1。其它生化试剂：TrisHCl, HCl, Na2HPO4，NaCl, NaHCO3, Tween20, EDTA和曲拉通等均为分析纯试剂。

L，加入反应孔中，18 ℃过夜连接。洗涤后加入一定酶活单位的S1核酸内切酶，37 ℃酶切1.5 h后洗板。

2.2.3 显色反应 封闭液在37 ℃反应30 min后，加入酶标抗体（1∶1500稀释于2%牛血清白蛋白中），室温振荡反应30 min。洗涤后加入新鲜配制PNPP显色液，37 ℃反应15～30 min。加入2 mol/L NaOH终止，用酶标仪检测405/630 nm处光吸收值（Optical density，OD）值。

2.3 实验条件的优化

2.3.1 亲和素包被的条件选择 100 nmol/L Test ODN经二次蒸馏水（ddH2O）倍比稀释至0.39 nmol/L，随行零对照，各浓度复孔，重复3次。考察了4种亲和素包被条件对灵敏度和响应值的影响：（1）Pierce公司中性亲和素包被酶标板；（2） CAYMAN CHEMICAL公司链霉亲和素包被酶标板；（3） 链霉亲和素25 mg/L和50 mg/L包被的96孔板（包被缓冲液：15 mmol/L Na2CO3，35 mmol/L NaHCO3，pH 9.6）。

2.3.2 优化探针浓度 从两个角度优化俘获探针和检测探针浓度: （1）Test ODN浓度为5 nmol/L时，考察俘获探针在100 nmol/L条件下，不同浓度（50，75，100，150和200 nmol/L）检测探针对应OD值变化曲线，反之考察俘获探针的最优浓度。（2）倍比稀释12.5 nmol/L Test ODN至0.78 nmol/L，检测探针与俘获探针比例分别为150∶100，150∶150 和 150∶200对方法线性的影响。

2.3.3 优化PNPP显色时间 猕猴血浆倍比稀释12.50 nmol/L Test ODN至0.39 nmol/L，按照优化后的反应条件，考察PNPP显色步骤中不同显色时间（15， 20和30 min）对定量曲线线性的影响。

2.3.4 S1酶用量的优化 猕猴血浆倍比稀释 Test ODN 12.50 nmol/L至0.39 nmol/L，加零对照，考察S1酶不同加入量（5，10，20，40，80和100 U/孔）对线性的影响。

2.4 生物基质的影响

分别以猕猴全血浆和ddH2O为基质倍比稀释12.5 nmol/L Test ODN至0.39 nmol/

L，并将另行配制的两份同浓度的血浆样品稀释1倍和10倍，对比考察生物基质对检测结果的影响。

2.5 利用ELBA和CE方法对猕猴体内低剂量给药PK研究

4只猕猴单次静脉滴注（v.d.）1 mg/kg Test ODN，30 min内恒速静脉滴注完毕，分别于给药前（0 min）以及滴注开始后0.2，0.3，0.5，0.35，0.75，1.0，1.25，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，6.0 和8.0 h，在给药部位对侧后肢静脉取血，血样均用EDTAK2抗凝管采集，3000 g 离心收集血浆样品于80 ℃保存待测。ELBA对样品测定时同板随行标线和质控样品，根据标线对生物样品中 Test ODN进行定量分析。

CE定量的样品前处理和测定方法参见文献\。单次静脉滴注5 mg/kg Test ODN，给药方式和血样采集同ELBA方法。

血浆样品中对Test ODN 原形、3′N1和5′N1降解产物进行12.5 nmol/L至0.39 nmol/L的倍比稀释，通过计算交叉反应性确定该方法针对原形药物测定的特异性，计算公式为：降解产物的半数效应浓度（EC50）/Test ODN 原形的半数效应浓度（EC50）。

2.6 数据处理

用EXCEL2007对所得数据进行整理并用ORIGIN 5.0对整理后数据进行拟合作图，药代动力学参数使用WinNonlin进行计算。3 结果与讨论

3.1 实验条件优化

3.1.1 不同包被条件对定量范围的影响

链霉亲和素包被酶标板（CAYMAN CHEMICAL公司）与自制两种链霉亲和素包被量的酶标板反应性能相同，在10 ～100 nmol/L较高浓度范围可呈良好线性，提示增加链霉亲和素包被量并不能提高灵敏度。与链霉亲和素包被相比，中性亲和素包被酶标板（Pierce公司）本底较低，灵敏度高；在0.5 ～7.5 nmol/L可呈线性递增趋势（图2A）。中性亲和素和链霉亲和素分子量相同，均可与生物素结合，但是前者与生物素结合时非特异性结合最低，可以大大提高特异性和灵敏度。本研究以建立高灵敏度的定量分析方法为目标，选择Pierce公司中性亲和素包被的酶标板进行后续实验。

3.1.2 优化探针浓度 固定 Test ODN浓度为5 nmol/L，检测探针浓度为100 nmol/L的条件下，俘获探针在100 nmol/L 以下信号值与浓度呈明显正相关，大于100 nmol/L呈饱和趋势，同样在固定 Test ODN为5 nmol/L，俘获探针在100 nmol/L的条件下，检测探针浓度在100 nmol/L以下信号值与浓度呈明显正相关，到达100 nmol/L后呈饱和趋势（图2B）。俘获探针与检测探针的不同浓度比例对该方法定量范围的影响结果表明，当两者比例为2∶3时， Test ODN浓度在0.78 ～12.5 nmol/L范围内与响应值呈正相关关系，且响应值较高（图2C）。

图2 实验条件的优化

Fig．2 Optimization of experiment conditions

A． 不同包被条件对响应值的影响 （Effect of different coating conditions on response）; B． 俘获探针和检测探针浓度的优化 （Optimization of concentrations of capture probe and detection probe）; C． 俘获探针和检测探针最佳比例 （Optimization of concentration ratio of capture probe and detection probe; D. PNPP显色时间的优化（Optimization of pnitrophenyl phosphate （PNPP） coloration time）。

3.1.3 优化PNPP显色时间 PNPP显色时间延长可以增强各浓度标准品下的信号强度，但是对标准曲线的线性影响较大，因此检测中将显色时间定为15 min（图2D）。

3.1.4 优化S1酶用量 S1 核酸酶的用量是影响所建方法的线性范围和特异性（原形和降解产物的区分）的关键因素。S1酶用量过少不能完全去除单链检测探针以及降解产物引起的背景信号，过多则会对结合的双链杂交分子非特异降解，原形ODN的信号值下降明显，且线性较差。根据优化结果，本研究在Test ODN在40 U/孔的酶量下，可以获得最优线性范围（图3），并具有良好的特异性，能区分原形和降解产物。S1酶对3′N1降解产物的作用更为特异，交叉反应性＜10%，对5′N1降解产物的交叉反应性＜25%（图4），而生物体内ODN的大部分降解产物均由3′外切核酸酶产生ODN，即以3′端降解产物为主。

图3 S1酶用量的优化

Fig．3 Optimization of S1 nuclease amount

图4 Test ODN原形与其3′N1 和5′N1降解产物的区分

Fig．4 Distinction between parent ODN and its 3′N1 and 5′N1degradation products

3.2 生物基质对定量分析的影响

生物样品中定量分析的难点在于生物基质的干扰效应，常规解决办法是对样品进行适当稀释以降低信噪比，提高响应值。本研究发现，低浓度生物样品进行稀释处理会导致灵敏度下降无法检测，与以ddH2O为基质相比，100%猕猴血浆中同浓度 Test ODN的响应值并未受到影响（图5），证明ELBA方法不受血浆基质干扰，反义寡核苷酸血浆样品不需任何样品前处理可直接应用ELBA方法进行定量分析。

3.3 方法学确证

3.3.1 定量范围、精密度、准确度 猕猴血浆中配制标准品（12.5， 6.25，3.13，1.56，0.78，0.39，0.20和0.10 nmol/L）制备标准曲线，批间重复5次。随行配制高（5 nmol/L）、中（0.50 nmol/L）、低（0.15 nmol/L）质控样品考察精密度和准确度。ELBA方法对Test ODN在猕猴血浆中的定量范围为0.10～6.25 nmol/L（R2＞0.99）（图6），较CE方法的灵敏度提高了近1000倍。 5批样品的批内和批间质控样品测定结

图5 生物基质对ODN定量分析的影响

Fig．5 Effect of biological matrix on quantitative analysis of ODN

图6 血浆中Test ODN定量标准曲线

Fig．6 Standard curve of quantification of Test ODN in plasma by ELBA

果表明ELBA对Test ODN的定量方法批内相对误差为10.6%～15.4%，精密度＜18.23%，批间相对误差为4.67%～8.23%（n＝5），精密度为＜7.91%。

3.3.2 稀释效应 考察样品稀释对样品浓度检测准确度的影响。根据实验需要分别用猕猴血浆配制浓度为1000，500，100，50和10 nmol/L的样品溶液并稀释至1 nmol/L，考察稀释倍数为1000, 500, 100, 50和10的稀释效应。实验结果见表2，验证样品的相对误差（RE）＜15%；结果表明，对血浆样品进行10～1000倍稀释后测定，结果仍准确可信。