五味子醇甲对KC介导肝纤维化抑制作用初步

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作者：王洋,戚好文，胡咏武,王胜春

【摘要】目的:观察五味子醇甲（SCH）对肝纤维化大鼠枯否细胞（kc）释放活性介质的影响.方法:分离、纯化大鼠KC细胞并建立脂多糖(LPS)诱导KC细胞释放细胞因子（TNFα，IL6,IL8）模型；制备及采用I125放射免疫法分别测定正常对照组、LPS模型组及SCH治疗组的细胞因子水平；酶谱法检测细胞培养上清谷草转氨酶(AST),谷丙转氨酶(ALT)的变化.结果:SCH治疗组可抑制KC细胞分泌TNFα(21.2±6.3),IL6(0.17±0.01),IL8(0.8±0.1)等细胞因子（P＜0.05）.结论:SCH甲具有治疗肝纤维化的作用.

【关键词】五味子醇甲；脂多糖；枯否细胞；细胞因子；抑制

【Abstract】AIM：Toobservetheeffectofschizandrin(SCH)oncytokinesreleasedbykupffercellsinratswithhepaticfibrosis.METHODS:Kupffercellswereseparated,purifiedandinducedtoreleasecytokines(TNFα,IL6,IL8)bylipopolysaccharide(LPS).Cytokinesofcontrolgroup，LPSgroupandSCHtreatmentgroupwerepreparedandseparatelymeasuredby125Iradioimmunoassay.Alanineaminotransferase(ALT)andaspartateaminotransferase(AST)ofhepatocytesupernatantweredeterminedwithzymography.RESULTS：SCHsignificantlyinhibitedkupffercellsfromdeliveringTNFα(21.2±6.3),IL6(0.178±0.01),IL8(0.8±0.1)(P<0.05).CONCLUSION：Schizandrincanbeusedtotreathepaticfibrosis.

【Keywords】schizandrin;lPS;kupffercell;cytokine;inhibiting

0引言

中药治疗肝炎、肝硬化具有其独到之处，因此长期以来是该领域的研究热点.五味子为木兰科植物五味子的干燥成熟果实.具有敛肺滋肾、生津敛汗、涩精止安、宁心安神的功效［1］.SCH（schizandrin，SCH）为五味子醇提取物，对化学毒物引起的动物肝细胞损伤有明显保护作用,在治疗急慢性肝炎方面具有显著疗效.但五味子醇甲对肝硬变的防治作用目前尚未见报道.已知细胞因子在肝硬变发生发展中起着重要作用,为此本研究针对肝硬变的特点，进行了体外五味子醇甲对大鼠肝枯否细胞（kupffercell，KC）分泌肿瘤坏死因子α(TNFα),白细胞介素6(IL6)与白细胞介素8(IL8)等活性细胞因子影响的研究.旨在初步揭示SCH抗肝纤维化的作用.

1材料和方法

1.1材料精密称取1mgSCH，加DMSO0.1mL（sigma公司）溶解后，用4mL含100mL/L小牛血清培养液混匀，过滤除菌，即为200mg/L溶液.受试药物浓度为100mg/L（预实验证实）.

1.2方法

1.2.1枯否细胞分离与培养参照文献［2］方法，取体质量150～200g，SD雌性大鼠3只（第四军医大学动物中心提供），250g/L乌拉坦麻醉后，小心游离摘取肝脏（勿使肝包膜破裂），置入Hanks液的培养皿中反复冲洗3次，剥离肝包膜，剪碎肝脏，过220目细胞筛，细胞用无血清培养液冲洗，混悬后1000r/min,离心5min，弃去上清；沉淀细胞用无血清培养液洗涤，1000r/min离心2次,每次5min，细胞重悬于200mL/L小牛血清培养液中，混匀后滴加于不连续梯度密度分离液上(1.053,1.058,1.080)，5200g（20℃）离心20min.小心吸取密度1.058以下分离液，收集的分离液3000r/min离心10min,沉淀细胞用200mL/L小牛血清培养液洗涤，3000r/min离心2次,每次10min，4g/L台盼蓝染色判断活性.细胞重悬于200mL/L小牛血清培养液中，调整细胞密度1×1011个/L后，接种于培养瓶内,37℃,50mL/LCO2孵箱内培养，经反复传代纯化后开始试验.

1.2.2建立脂多糖(LPS)诱导KC细胞释放细胞因子（TNFα，IL6,IL8）的模型4组KC细胞培养于96孔培养板中，37℃,50mL/LCO2饱和湿度的培养箱中培养12h使细胞贴壁，每组分别用100,80,60,40μg/L的脂多糖（lipopolysacchide，LPS，SIGMA公司）孵育6,12,18,24h，吸去培养液，用PBS洗涤细胞1次；每孔加浓度5g/L的MTT染液20μL（溶于PBS中，滤过除菌，4℃避光保存）于37℃，50mL/LCO2饱和湿度的培养箱中继续孵育细胞4～6h；加入新鲜配制的DMSO溶解MTT150μL/孔，水平摇床上摇10min，使还原产物充分溶解，酶标仪上570nm波长下测定光密度值.每试验点重复4孔，优选出LPS作用KC细胞的最佳浓度及培养时间，据此最佳条件建立LPS诱导KC细胞释放细胞因子的模型.

1.2.3实验分组及各组细胞因子（TNFα，IL6，IL8）检测取24孔培养板2块，每孔加入8mm×8mm玻片1张后接种纯化KC细胞悬液1mL（每mL含细胞数约1×108），置37℃，50mL/LC

O2孵箱内培养，待细胞长成单层后分设正常对照组、LPS模型组、SCH治疗组，每组8孔.正常组、LPS模型组加完全培养液；SCH治疗组加入浓度为100mg/L的供试液1mL，继续培养24h，弃去上清后正常组加完全培养液；LPS组、SCH治疗组各加60μg/LLPS的完全培养液1mL，继续培养8h，收集各组细胞上清至-80℃保存，I125测定各组细胞培养上清中细胞因子TNFα,IL6及IL8的含量.

1.2.4SCH对细胞因子介导的肝损伤的作用按“1.2.1”方法制备KC细胞，调整细胞密度1×1011/L，置双层培养小室下层，37℃,50mL/LCO2孵箱内培养，长至单层后进行实验.取生长良好细胞分成3组：正常对照组、LPS模型组及SCH组.正常对照组、LPS模型组.制备方法同1.2.3.SCH组制备方法为生长良好KC细胞,用SCH供试液（100mg/L）培养.培养12h弃上清，正常对照组加完全培养液，LPS模型组和SCH组每孔各加60μg/LLPS供试液1mL，培养3h后终止.制备鼠肝细胞（HC）悬液，按密度1×1011/L加入上述各组培养小室上层内，每组6孔，每孔0.5mL，继续培养8h后取上清液测定谷草转氨酶(AST),谷丙转氨酶(ALT).

统计学处理:使用SPSS10.0统计分析软件，实验结果以表示，组间比较采用单因素方差分析及LSDt检验，P＜0.05为差异具有统计学意义.

2结果

2.1不同浓度LPS对KC细胞活性的影响MTT结果显示使用浓度为60μg／L的LPS孵育KC细胞培养12h时，KC活性最佳(图1).

图1不同浓度LPS对KC细胞活性影响（略）

2.2SCH对KC细胞分泌TNFα，IL6，IL8的影响与正常对照组相比，LPS模型组KC细胞培养上清中细胞因子水平升高(P＜0.05)，SCH治疗组KC细胞培养上清TNFα和IL8水平较LPS模型组下降(P＜0.05,表1).

表1KC细胞上清中细胞因子的水平（略）

aP＜0.05vs正常对照；bP＜0.01vsLPS模型.

2.3SCH对肝细胞培养上清AST，ALT的影响与正常对照组相比，LPS模型组HC细胞培养上清AST和ALT水平升高（P＜0.05），SCH治疗组HC细胞培养上清TNFα和IL8水平较LPS模型组下降（P＜0.05），接近正常对照组水平(表2).

表2复层培养条件下HC细胞上清中AST,ALT水平（略）

aP＜0.05,bP＜0.01vsSCH.AST：谷草转氨酶；ALT：谷丙转氨酶；LPS：脂多糖；SCH：五味子醇甲.

3讨论

现有研究表明在多种因素诱发的肝损害过程中，均有激活的肝枯否细胞的介导及参与.KC细胞释放TNFα，IL和蛋白水解酶等细胞因子，是该过程中的重要病理机制.高水平的TNFα可以诱导肝细胞凋亡［3］与坏死，TNFα尚能诱导KC产生自由基，对肝窦内的中性粒细胞具有趋化作用而进一步加重肝细胞损伤［4］.此外，TNFα又可诱导单核细胞和巨噬细胞产生IL8和IL6［5-7］.IL-6刺激肝细胞、枯否细胞分泌多种细胞因子，引发这些细胞因子的致纤维化作用.在感染、局部缺血、创伤及其它肝组织内环境失衡条件下，IL8的重要诱导剂TNF增高，导致IL8产生增多，直接损害肝细胞和加速病情恶化.

SCH为五味子醇提取物，对化学毒物引起的动物肝细胞损伤有明显保护作用［8］，但对肝硬变细胞因子的影响尚未见报道.本研究首先建立脂多糖诱导大鼠肝枯否细胞释放细胞因子（TNFα，IL6,IL8）模型，通过测定并比较正常组、LPS组和SCH治疗组的细胞因子，结果发现与正常对照组相比，LPS模型组KC细胞培养上清TNFα和IL8水平升高（P＜0.05)，表明KC细胞经适宜浓度（60μg／L）LPS诱导12h后活性细胞因子的分泌增加，从而建立了本研究所需的细胞模型.另一方面，SCH治疗组KC细胞培养上清TNFα和IL8水平较LPS模型组下降（P＜0.05），IL6有下降趋势，提示SCH干预能减少KC细胞活性因子的释放，但IL6水平降低不具备统计学差异，可能与因子调控的不同步性及LPS作用KC时间和所选浓度（60μg／L）有关.在上述模型的基础上，进一步研究了细胞因子介导的肝细胞（HC）培养上清AST，ALT的变化.结果是LPS模型组HC细胞培养上清AST和ALT水平高于正常对照组，证实LPS诱导的KC释放活性介质确对体外培养肝细胞有损害作用.SCH治疗组HC细胞培养上清AST和ALT水平较LPS模型组下降，接近正常对照组水平，提示经SCH预处理的KC细胞具有抵抗LPS、减少肝纤维化因子损害及保护肝细胞的作用.

已有实验表明肝纤维化患者的纤维化程度改善与IL6,IL8血清水平降低成正相关［9］；Pena等［10］发现经过还原型谷胱甘肽治疗的肝纤维化患者血清中IL6和IL8水平明显下降；Sener等［11］研究指出银杏治疗胆梗阻大鼠肝纤维化时，相比于正常组，治疗组TNFα水平明显降低.本研究初步提示SCH通过抑制枯否细胞释放TNFα，IL6，IL8来保护肝细胞及减少肝损害的作用.鉴于肝硬化病变机制复杂，SCH对肝脏的保护作用有待深入探讨.

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