棕榈酸对胰岛素抵制的影响

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引 言

肥胖是Ⅱ型糖尿病的重要风险因素之一[1]，有统计显示，美国 80%的Ⅱ型糖尿病患者都存在肥胖现象。因此，阐明肥胖与胰岛素抵抗的关系成为急需解决的医学问题。文献显示，许多肥胖相关因素可以引起胰岛素抵抗，其中包括：脂肪组织分泌的TNF-α[2]和 IL-6[3]等炎症因子，肥胖引起的应激反应(包括氧化应激[4]和内质网应激[5,6])，以及肥胖症患者血液中高浓度的游离脂肪酸等。这些因素可能单独起作用，也可能协同作用。随着进食情况、营养状况和生理活动的变化，游离脂肪酸在机体循环系统中的浓度是随时间呈周期性变化的[7]。在正常情况下，血液中这种游离脂肪酸浓度的变化受到复杂而精确的调控，从而保持动态的平衡。但是如果某些非正常因素，如脂肪细胞持续分泌大量的游离脂肪酸，导致维持脂肪酸稳态平衡的机制被破坏，并使血液中游离脂肪酸的浓度升高，就有可能成为诱发Ⅱ型糖尿病的初始因素之一，其具体的分子机理尚不清楚。作为血液中含量最丰富的饱和脂肪酸，棕榈酸对胰岛素敏感性的影响受到了广泛重视[8,9]。而在所有胰岛素相关的靶组织和器官中，骨骼肌消耗的血糖最多，约占 70%，因此，研究棕榈酸在机体循环系统及骨骼肌组织中的代谢及其作用就显得尤为重要。我们通过大鼠颈静脉置管输注实验，研究了棕榈酸在大鼠体内的吸收及代谢分布，同时，利用 C2C12 骨骼肌细胞模型来研究棕榈酸对骨骼肌胰岛素敏感性的影响。

材料与方法

材料

实验动物及饲料

SPF级雄性 SD 大鼠从北京大学医学部实验动物中心获得，体重 500 g 左右。分笼饲养，自由摄食，自由饮水，室温控制在 18～25℃，湿度控制在 40%～55%，保证通风。大鼠平衡饲料购自北京科澳协力饲料有限公司。

主要试剂

3H标记棕榈酸是 Perlkin Elmer 公司的产品；棕榈酸钠、肝素和中性脂标准品从 SigmaAldrich公司购买。p-Akt 和 p-PERK 抗体为 Cell Signaling 公司产品，GAPDH 抗体购买自Upstate 公司 。 TLC ( thin layer chromatography) 板为英国 Whatman 公司产品，型号为LD6K。其它试剂均为国产分析纯。

方法

细胞培养

C2C12细胞培养在含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基中，并添加 100 U/mL 青霉素和100 U/mL链霉素，于 37℃、5% CO2和饱和湿度条件下培养。

脂肪酸吸收测定

C2C12 细胞培养在 12 孔细胞培养板中，待其完全铺满后，加入3H 同位素示踪棕榈酸(300 μmol/L棕榈酸 +1.9 μCi3H标记的棕榈酸)，孵育不同时间(1、3、6、9、12 h)。孵育结束后，用 4℃预冷的 PBS 洗细胞 3 次，然后每孔用 0.5 μl 含 1% Triton X-100 的 PBS 裂解细胞。萃取总脂组分，然后加入 1 ml 闪烁液测定3H放射性强度。

大鼠颈静脉置管术

参照1999 年 Mason 的方法[10]，过程简述如下：1)体重为500 g 的雄性 SD 大鼠，用 10%水合氯醛腹腔注射 (1 ml/200 g) 麻醉，麻妥固定在手术操作台上。2)消毒大鼠右侧颈部，在颈部右锁骨中线中下2/3 处剪开皮肤。钝性分离皮下组织和筋膜，暴露出右侧颈静脉。3)游离静脉，并用外科显微剪剪开血管壁。置钢丝，在钢丝的引导下将硅胶导管置入血管中。4)将硅胶导管用丝线固定，导管在皮下走行，从背部皮肤引出并用丝线缝合固定，然后用生理盐水冲洗导管，防止导管口有血凝块堵塞，用灭菌的牙签封堵导管口，防止血液逆流进入导管。5)术后精心护理，注意保持导管的固定。

输注放射性 3H标记棕榈酸

颈静脉置管手术后，大鼠恢复一天，然后进行 3H 标记棕榈酸的输注实验。先用无菌注射器回吸，直到将导管腔内的生理盐水全部抽出，然后输注0.5 ml (约2.5 mCi)3H 标记的棕榈酸，输注速度为0.1 ml/min，根据大鼠状态随时调整输注速度，输注结束再输注与导管腔等体积的生理盐水，保证管腔内的棕榈酸全部进入大鼠血液循环。

薄层层析法(TLC)测定组织中放射性脂组分

组织样品中脂组分的萃取

取相应的组织块 50 mg，加入 0.5 ml PBS 后，在冰上进行超声破碎，超声设置为：200 W，停 9 s，超声 9 s。至组织块破碎完全，加入 1 ml 脂萃取试剂 (氯仿∶甲醇∶乙酸 =50∶50∶1)，强烈震荡 15 s，然后进行高速离心 (20 000 g×10 min, 4℃)，小心地将管底的有机相转移到新的 1.5 μl 离心管内，并吹干，加入 50 μl 溶剂重新溶解。

利用 TLC 体系进行脂层析

取10 μl细胞总脂样品或者中性脂标准品，小心地将其点于TLC 层析板的浓缩带中间，上样完毕后，将 TLC 层析板置于空气中晾置挥发溶剂。然后将 TLC 板置于含 100 ml展开剂(中性脂展开剂：正己烷∶乙醚∶乙酸 =80∶20∶1) 的层析缸中进行层析。待展开剂前沿接近距 TLC 板顶端 1 cm 左右时，停止层析，取出 TLC 板，并充分晾干展开剂，最后将TLC 层析板置于密闭容器中进行碘蒸气染色 1 h。

利用同位素标记测定细胞中脂肪酸代谢各组分含量

经TLC 分离的脂条带，参照标准样品的条带位置，将实验组与之对应位置条带处的硅胶粉刮下，加入 1 ml 闪烁液，并经剧烈震荡后进行液体闪烁计数。

免疫印迹分析

参照Liu 等人的方法[11]：在12 孔板中培养的细胞经处理后，先用 PBS 洗 2 遍，然后加入 2 倍稀释后的上样缓冲液 150 μl，裂解 5 min，并经超声、加热变性和高速离心获得上清后，直接进行蛋白电泳。蛋白样品经 10%的 SDS-PAGE 进行分离，然后电转移到 PVDF 膜上，再经5%脱脂奶粉封闭 1 h 后，加入一抗，并在 4℃进行摇动孵育。经洗涤后加入 HRP标记的二抗，在室温下孵育1 h，经洗涤、曝光、显影和定影后获得免疫印迹条带。

结 果

棕榈酸在大鼠血液中的动态代谢

按第 46 页中 “脂肪酸吸收测定”的方法，从大鼠颈静脉输注3H棕榈酸( 0.5 ml，2.5 mCi)后，每隔 10 min 抽取 0.1 ml 血液，以检测其所含的放射性棕榈酸的强度。检测结果如图 1 所示：血液中的放射性强度迅速降低，在 20 min 的时间点上，其放射性强度比10 min 时间点的强度要降低 50%以上，表明棕榈酸在血液中的半衰期在 20 min 以内；而到70 min以后，放射性强度降低到基线水平，表明在 70 min 后，棕榈酸即可被组织完全吸收，达到稳态平衡。

棕榈酸代谢物在各组织中的分布

如上节所示，棕榈酸可以迅速被组织吸收(70 min以内)，那么其代谢产物在各组织是如何分布的? 为此，对注射棕榈酸后不同时间 (200 min 和 48 h) 的多只大鼠进行组织提取并分析放射性强度。图 2 和图 3 分别对应200 min 后和 48 h 后，大鼠各主要组织(大脑、心脏、骨骼肌、肝脏和脂肪)中放射性棕榈酸代谢产物的分布。从图 2A 和图 2B 的比较可见，200 min 与 48 h 后，棕榈酸代谢产物的组织分布大体类似，在这些主要组织中均有分布，肝脏单位重量所含的棕榈酸代谢物最高，脂肪中则最低；而换算成棕榈酸代谢产物的绝对量进行比较，则在骨骼肌中分布最多，按大鼠各组织平均重量换算后，其大约占总代谢产物的比例为 45%。

C2C12骨骼肌细胞中的棕榈酸吸收

鉴于骨骼肌对棕榈酸代谢的重要作用，本文以 C2C12 骨骼肌细胞系为模型，进行分子机制方面的研究。首先检测了 C2C12 细胞对棕榈酸的吸收，结果如图 3 所示，可见，C2C12细胞可以高效地吸收棕榈酸。

棕榈酸代谢产物的累积可以影响内质网应激和胰岛素敏感性

棕榈酸会导致骨骼肌发生内质网应激，降低骨骼肌的敏感性[12]。那么，棕榈酸在骨骼肌细胞内是以哪些代谢产物引起胰岛素抵抗的? 脂肪酸的中间代谢产物神经酰胺和 DAG(diacylglyceride)等都可以引起胰岛素抵抗[13,14]。本文通过两组经不同处理过程的棕榈酸，验证脂肪酸中间代谢产物对胰岛素信号以及内质网应激的作用：一组直接用棕榈酸处理C2C12细胞 6 h，另一组则先用棕榈酸处理 6 h，然后用含血清的培养基将棕榈酸去除，继续培养12 h。免疫印迹的结果如图4 所示：单独加入 500 μmol/L 棕榈酸处理 C2C12 细胞 6 h 后，胰岛素刺激下的Akt磷酸化没有发生明显的下降，而且内质网应激指标 PERK 的磷酸化也不明显(图 4，第 3、4 道)，说明棕榈酸经过6 h处理后，还不足以通过内质网应激引起胰岛素抵抗；然而，当细胞经 6 h 棕榈酸处理后，再经过无棕榈酸培养12 h，其在胰岛素刺激下的 Akt 磷酸化发生了明显的下降，而且导致 PERK 发生了明显的磷酸化(图4，第 7、8 道)，说明此种棕榈酸处理情况下的C2C12细胞发生了明显的内质网应激和胰岛素抵抗。这两种方式处理的细胞从外界吸收的棕榈酸应该是同样多的，唯一的区别是外源棕榈酸在细胞内的代谢时间，这暗示着棕榈酸进入细胞后需要经过一定的时间的代谢，累积到足够量的代谢中间产物才能引起内质网应激，从而降低胰岛素敏感性。同时对两种方式处理下的脂代谢产物进行放射性TLC 分析，结果如图 5 所示：同仅用棕榈酸处理组的细胞相比，用棕榈酸处理后继续培养的细胞，其标记的棕榈酸总量无显著性变化，而同位素标记的DAG 占同位素标记总脂的比例上升 (图 5)；与此同时，同位素标记的 TAG (triglyceride)占同位素标记总脂的比例出现明显下降，而磷脂所占比例显著上升(图 5)。

讨 论

游离脂肪酸在血液中的异常增高，是导致机体发生胰岛素抵抗的重要原因，而引起胰岛素抵抗的游离脂肪酸中，又以长链饱和脂肪酸棕榈酸最为典型。为了更好地模拟棕榈酸在体内的代谢过程，我们采用颈静脉输注的方法，直接将 3H 标记的棕榈酸输注到血液中，然后通过监测血液中放射性的变化来获知棕榈酸在血液中的动态代谢变化。这种方法可以直接有效地将脂肪酸引入到血液中，相对于高脂喂食等间接的脂肪酸摄入方式而言，更加直接有效，且放射性标记棕榈酸的检测灵敏度高，化学性质也与天然脂肪酸完全一致。骨骼肌消耗全身 70%的血糖，其对全身能量代谢的重要性不言而喻。同时，糖脂代谢是相互影响的。Randle Cycle 理论认为，当脂肪酸的氧化能力上升时，葡萄糖的氧化能力会下降[15]。这种由于脂肪酸氧化增加所抑制的葡萄糖氧化过程会降低胰岛素的敏感性。因此，骨骼肌对棕榈酸的代谢调控也就与糖代谢密切相关。与此相一致的是，我们的组织样品脂分析结果也显示，骨骼肌所吸收的棕榈酸所占比例最大，因此，骨骼肌对棕榈酸的代谢调控，对全身胰岛素敏感性的调节意义重大。棕榈酸进入骨骼肌细胞后会被迅速代谢，形成棕榈酰辅酶 A，进而合成各种代谢中间产物，而这些中间代谢产物可能是造成胰岛素抵抗的重要原因。脂分析结果也显示，单独加入棕榈酸相同的时间，撤去棕榈酸后继续孵育一段时间(12 h)，其中间代谢产物的比例发生变化，磷脂和 DAG 的比例上升，而 TAG 的比例明显下降。在这些中间代谢产物中，磷脂和 DAG 的化学性质活泼，也是细胞内的信号分子，因此可能调控胰岛素信号通路的某些过程，从而导致胰岛素抵抗；而TAG 的性质相对稳定，一般都被存储在脂滴中[16]，通常不被认为是细胞信号分子。随着棕榈酸进入细胞的代谢进程，化学性质活泼的 DAG 和磷脂比例上升，而化学性质稳定的TAG 所占比例出现下降，此时细胞出现内质网应激和胰岛素抵抗。这也暗示棕榈酸本身并不能直接影响胰岛素敏感性，而是在代谢成某些性质活泼的中间代谢产物后才会影响胰岛素敏感性。联系到体内脂肪酸的分泌时相也呈波浪型这个事实，可以推测，脂肪酸的每个分泌高峰的影响是一个持续的过程，如果每个脂肪酸的分泌高峰都比正常值高，则可能产生累积效应，持续生成大量的中间代谢产物，从而影响某些信号通路出现异常，最终引发胰岛素抵抗。