吗替麦考酚酯分散片在中国健康男性志愿者体内的药动学和生物等效性研究

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[摘要] 目的：研究吗替麦考酚酯分散片在中国健康男性志愿者体内的药动学和生物等效性。方法：采用双周期交叉试验设计，20名健康男性受试者随机交叉单剂量口服吗替麦考酚酯分散片（试验制剂）和吗替麦考酚酯胶囊（参比制剂）1 g，以高效液相色谱法测定给药后不同时间麦考酚酸的血药浓度，用DAS Ver 2.0软件计算药动学参数，评价两种制剂的生物等效性。结果：吗替麦考酚酯试验制剂和参比制剂的主要药动学参数Cmax分别为（19.88±3.55） μg/ml和（20.16±3.47） μg/ml；tmax分别为（0.74±0.19） h和（0.80±0.17） h；t1/2分别为（8.86±2.73） h和（8.77±3.00） h；AUC0-t分别为（48.63±16.53） μg/(h・ml)和（49.96±18.01） μg/(h・ml)，AUC0-∞分别为（54.34±16.63） μg/(h・ml)和（55.38±18.68） μg/(h・ml)；试验制剂的AUC0-t、AUC0-∞、Cmax的90%置信区间分别为参比制剂相应参数的91.03%～104.53%、92.91%～105.26%和94.92%～102.17%。以AUC0-t计算试验制剂中吗替麦考酚酯对参比制剂的相对生物利用度F为（99.25±17.02）%。结论：经方差分析及双单侧t检验结果显示，试验制剂和参比制剂具有生物等效性。

[关键词] 吗替麦考酚酯分散片；麦考酚酸；高效液相色谱法；药动学；生物等效性

[中图分类号] R969.1[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2009）05（a）-024-04

Pharmacokinetics and bioequivalence of Mycophenolate Mofetil Dispersible Tablets in Chinese healthy male volunteers

HUANG Haiwei1, LI Jianhe2, PENG Liubao2, CAO Junhua2, LUO Xia2, WAN Xiaomin2

(1.Department of Pharmacy, the Third Hospital of Changsha City, Hunan Province, Changsha 410015, China; 2.Department of Pharmacy, the Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410011, China)

[Abstract] Objective: To study the pharmacokinetics and bioequivalence of Mycophenolate Mofetil Dispersible Tablets in Chinese healthy male volunteers. Methods: 20 healthy male volunteers were orally administered with single dose of 1 g Mycophenolate Mofetil Dispersible Tablets (test preparation) and Mycophenolate Mofetil Capsules (reference preparation) by randomized crossover way, then the plasma concentrations of mycophenolic acid were determined by HPLC methods. The pharmacokinetic parameters and the relative bioequivalence of the two preparations of Mycophenolate Mofetil was calculated by DAS Ver 2.0 software. Results: The main pharmacokinetic parameters of test and reference preparations were as follows: Cmax were (19.88±3.55) μg/ml and (20.16±3.47) μg/ml respectively; tmax were (0.74±0.19) h and (0.80±0.17) h respectively; t1/2 were (8.86±2.73) h and (8.77±3.00) h respectively; AUC0-t were (48.63±16.53) μg/(h・ml) and (49.96±18.01) μg/(h・ml) respectively; AUC0-∞ were (54.34±16.63) μg/(h・ml) and (55.38±18.68) μg/(h・ml) respectively. The 90% confidential interval of AUC0-t, AUC0-∞ and Cmax of the test preparation were 91.03%-104.53%, 92.91%-105.26% and 94.92%-102.17% respectively. The relative bioavailability of Mycophenolate Mofetil was (99.25±17.02)%. Conclusion: The results of the statistic analysis of variance and two one side t test showed that the test and reference preparations of Mycophenolate Mofetil were bioequivalent.

[Key words] Mycophenolate Mofetil Dispersible Tablets; Mycophenolic acid; HPLC; Pharmacokinetics; Bioequivalence

吗替麦考酚酯（Mycophenolate Mofetil，MPM）是一种新型抗代谢类免疫抑制剂，是麦考酚酸（mycophenolic acid，MPA）的2-乙基酯类衍生物，为麦考酚酸的前体药，口服后在体内迅速水解为具有免疫抑制作用的活性代谢物麦考酚酸，通过选择性抑制T、B细胞的次黄嘌呤单磷酸脱氢酶，阻断细胞DNA和RNA的合成，抑制T、B细胞的分化和增殖；并能降低黏附分子的活性，抑制血管平滑肌细胞增殖，从而有效地预防和减少排斥反应的发生[1-2]。因此，临床上主要用于预防和治疗器官移植中的排斥现象。由于本品口服吸收完全，代谢迅速，在体内几乎检测不到原形药物吗替麦考酚酯，故通过测定血浆麦考酚酸浓度来研究其生物利用度和药动学特征。健康人体麦考酚酸药动学研究国内外已有报道[3-12]。本试验旨在采用HPLC法测定血浆中麦考酚酸的浓度，评价口服单剂量吗替麦考酚酯分散片（试验制剂）和吗替麦考酚酯胶囊（参比制剂）在健康中国男性受试者中的药动学特点和生物等效性，旨在为临床合理用药提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

美国Agilent 1100液相色谱仪，配备G1313A自动进样器和G1315B二极管阵列检测器；TGL16M台式高速冷冻离心机（长沙英泰仪器有限公司）；XW280A涡旋混合器（上海医科大学仪器厂）；AG285电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 药品和试剂

试验制剂（T）为湖南华纳大药厂研制的吗替麦考酚酯分散片；参比制剂（R）为上海罗氏制药有限公司生产的吗替麦考酚酯胶囊（商品名骁悉），两者规格均为250 mg。吗替麦考酚酯对照品（湖南华纳大药厂，含量99.4%），内标普罗帕酮（山东莒南制药有限公司，含量99.2%）。甲醇、乙腈（色谱纯，Tedia公司），醋酸铵等其他试剂均为国产分析纯，水为双重蒸馏水。空白血浆由中南大学湘雅二医院血液科提供。

1.3 受试者选择

20名健康男性志愿者，平均年龄（22.8±1.15）岁，体重（64.5±5.53） kg，身高（172±4.12） cm；受试前经询问病史、体格检查和实验室检查未发现异常。受试者既往体健，无药物过敏史，无吸烟、嗜酒及经常用药史。试验前2周内未服用任何可能影响本品吸收、代谢的药物。受试期间统一清淡饮食，不使用除试验（参比）制剂以外的任何药物，不接受烟、酒及含咖啡的饮料，避免剧烈运动。受试者试验前签署知情同意书，本试验方案经医学伦理委员会审核批准。

1.4 给药方法与样品采集

采用双周期自身随机交叉试验设计。20名受试者随机等分为A、B两组，每组受试者每次试验时分别服用试验制剂或参比制剂。受试者于试验前1 d晚餐后，禁食、不禁水12 h，次日清晨空腹分别单次口服1 g吗替麦考酚酯试验制剂和参比制剂，以250 ml温开水送服，并作记录。服药2 h后可自由饮水，服药4 h后进统一低脂肪、低蛋白标准餐。试验期间由医护人员进行监护。分别于服药前（0h）和服药后0.25，0.50， 0.75，1.00，1.50，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00，12.00，24.00 h由前臂肘静脉取血5 ml。经过7 d洗脱时间后交叉给药，同时间点取血。血样置于含有肝素的离心管中，立即离心（3 000 r/min）10 min，分离出血浆，置-20℃冰箱中保存备测。

1.5 血浆样品处理与血药浓度测定

1.5.1 色谱条件色谱柱：Kromsil-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇∶乙腈∶水（10 mmol/L醋酸铵调pH至5.0）＝25∶35∶40（V/V/V）；流速：1.0 ml/min；紫外检测波长：303 nm；进样量：20 μl；柱温：35℃。

1.5.2 血浆样品的处理精密吸取200 μl血浆，加入400 μl乙腈配制的25 μg/ml普罗帕酮内标溶液，涡流混合1 min，13 000 r/min离心10 min，得上清液400 μl，取20 μl进样。

1.6 线性范围及定量下限

用空白血浆将标准储备液稀释成不同浓度的混合液，按“1.5.2”项下方法操作，每一浓度进行3样本分析，进样20 μl，记录色谱图；以待测物浓度（X）为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值（Y）为纵坐标，用加权（W=1/X2）最小二乘法进行回归运算[13]，得麦考酚酸线性范围为：0.40～51.50 μg/ml，回归方程为：Y＝0.043 9X+0.022 6，r=0.999 5，定量下限为:0.20 μg/ml。

1.7 方法学考察与评价

1.7.1 色谱行为空白血浆、吗替麦考酚酯血浆标准以及健康受试者血浆样品，经HPLC分析测定得到的色谱图见图1。麦考酚酸和内标普罗帕酮的保留时间分别为5.4 min和7.5 min左右；空白血浆中的内源性物质不干扰麦考酚酸和内标普罗帕酮的测定。

1.7.2 准确度与精密度取空白血浆200 μl，按“1.6”项下的方法配制吗替麦考酚酸低、中、高三个浓度（0.80、6.44、51.50 μg/ml）的质控（QC）样本，每一浓度制备6个样品，当天进样分析，连续测定3 d，根据当天的标准曲线计算QC样本的测得浓度，并与理论浓度对比，计算测定方法的准确度及日内和日间精密度。结果得吗替麦考酚酸在血浆浓度为0.80、6.44、51.50 μg/ml时的测得量分别为0.81、6.57、52.79 μg/ml，日内RSD分别为6.08%、3.24%、2.43%，日间RSD分别为6.02%、4.43%、2.50%，符合生物等效性研究的方法学要求。

1.7.3绝对回收率取空白血浆200 μl，按“1.6”项下的方法制备麦考酚酸低、中、高三个浓度（0.80、6.44、51.50 μg/ml）的样品，每一浓度进行6样本分析，计算样品峰面积（As）和内标峰面积（Ai）的比值fx（fx=As/Ai）。另于相应浓度、不加空白血清的麦考酚酸溶液中加入内标测定，得fs（fs=As′/Ai′）。求fx和fs的比值，即可得到绝对回收率。结果得麦考酚酸在血浆浓度为0.80、6.44、51.50 μg/ml时的绝对回收率分别为（75.35±3.87）%、（80.21±2.35）%和（81.33±1.60）%，内标的绝对回收率为（65.79±1.91）%。其绝对回收率基本一致，表明测定数据精密，可重现。

1.7.4 稳定性试验考察吗替麦考酚酸血浆样品经历3次冷冻（-20℃）-解冻（室温）循环、室温放置24 h、-20℃存放20 d以及处理后的血浆样品室温放置24 h的稳定性。取空白血浆200 μl，配制相当于吗替麦考酚酸浓度0.80、6.44、51.50 μg/ml的血浆样品，每一浓度水平进行3样本分析测定。结果显示，所有室温放置试验、冰冻和冻融试验的测定值与添加值的相对偏差（RE）均小于15%，说明分析测试过程中的样品较为稳定。

1.8 数据处理

利用DAS Ver 2.0统计软件计算药动学参数，Cmax和tmax均以实测值表示。AUC0-t以梯形法计算；AUC0-∞按公式计算：AUC0-∞＝AUC0-t+Ct/λZ（t为最后一次可实测血药浓度的采样时间；Ct为末次可测样本药物浓度；λZ为对数血药浓度-时间曲线末端直线部分求得的末端消除速率常数）；t1/2用公式t1/2＝0.693/λZ计算。以各个受试者服用试验制剂和参比制剂的AUC0-t按下式分别计算其相对生物利用度（F）值：F=AUCT/AUCR×100%。Cmax、AUC经对数转换后进行方差分析，双单侧t检验和（1-2α）置信区间考察。

2 结果

2.1 药动学参数

20名健康受试者单次交叉口服1 g吗替麦考酚酯试验制剂或参比制剂后的平均血药浓度-时间曲线见图2，主要药动学参数见表1。

2.2 生物等效性评价

试验制剂和参比制剂的Cmax、AUC经对数转换后进行方差分析，并进一步采用双单侧t检验和（1-2α）置信区间法进行生物等效性评价，tmax采用非参数检验法。结果表明，吗替麦考酚酯的AUC0-t、AUC0-∞和Cmax均拒绝生物不等效假设（P＞0.05）；试验制剂的AUC0-t、AUC0-∞、Cmax的90%置信区间分别为参比制剂相应参数的91.03%～104.53%、92.91%～105.26%和94.92%～102.17%。非参数检验结果显示，两制剂的tmax差异无统计学意义（P＞0.05）。根据以上结果，判定两制剂具有生物等效性。

2.3 安全性评价

整个试验过程由经GCP培训的临床医师和护士进行观察，20名受试者在服用吗替麦考酚酯试验制剂或参比制剂1 g后，在观察期内均无不适主诉或亦未观察到不良事件，且均按要求完成试验,表明在所选择的给药剂量内，受试者能很好地耐受试验制剂和参比制剂。

3 讨论

吗替麦考酚酯分散片是一种应用前景广阔的新型片剂类型，与其他口服制剂相比，除了具有普通片剂稳定性好、便于携带、服用方便等优点外，还可直接吞服，也可投入水中或果汁中迅速崩解，形成均匀的混悬液后服用，特别适合于老人、小孩及咽喉病痛患者服用，其崩解快，崩解颗粒细，体内吸收迅速，生物利用度高，临床疗效更好。吗替麦考酚酯分散片的达峰时间略短于吗替麦考酚酯胶囊，说明前者的吸收比后者快，但无显著差异（P＞0.05），这完全符合分散片的剂型特点。

吗替麦考酚酯试验制剂和参比制剂的药品使用说明书中推荐用药剂量为两种给药方案：每次1 g，每天2次和每次1.5 g，每天2次。据文献[14]规定同时考虑到该药为免疫抑制剂，为尽量减少给健康志愿者可能带来的不良事件，故决定本试验给药方案为每人1 g，同时该剂量下的血药浓度可以满足检测需要。

吗替麦考酚酯口服后迅速水解代谢为吗替麦考酚酸，即使是服药早期，吗替麦考酚酯在循环系统中也低于检测限[15]。故应检测血浆中吗替麦考酚酸的浓度来进行吗替麦考酚酯的药动学参数和生物等效性研究。有关测定血浆中吗替麦考酚酸的HPLC方法文献报道较多，有采用HPLC-UV法检测活性代谢物MPA及酰基葡萄糖醛酸化麦考酚酸（AcMPAG）和非活性代谢物MPAG，样品处理有采用固相提取法，Zorbax Rx C8柱进行分析[3]；有采用乙酸乙酯提取[4]；有采用高效液相柱后衍生化荧光检测法[5-6]，需添加柱后衍生化装置将流动相碱化；但这些方法样品预处理操作繁琐、耗时、系统误差大。文献报道，还有HPLC-MS法；但要求较高的仪器，成本高，仪器普及率低，样品测定方法复杂，不太适用于MPA常规血药浓度监测[7]。本文建立的HPLC-UV方法，流动相构成比简单，血浆样品不经提取浓缩，直接用血浆加入乙腈沉淀后进样分析，预处理简便、快捷、系统误差小，该方法测定快速，灵敏度高，重现性好，麦考酚酸峰形良好，无杂峰干扰，建立的血药浓度测定方法各项指标均符合生物样品的分析要求，适用于吗替麦考酚酯的临床药动学研究或吗替麦考酚酸的血药浓度监测。

由于吗替麦考酚酸唯一的代谢产物葡萄糖苷酸结合物麦考酚酸葡萄糖苷酸存在肝-肠循环，在服用吗替麦考酚酯后的6～12 h，将出现第2个吗替麦考酚酸吸收峰[16-17]。该峰在个别志愿者的血药浓度-时间曲线中能明显观察到，但由于存在个体差异，此峰在平均血药浓度-时间曲线中不明显。用反相高效液相色谱法测定血浆中吗替麦考酚酸的浓度，对数据进行分析，得两制剂的体内过程基本相似，主要药动学参数基本一致，以方差分析和双单侧t检验，判定本吗替麦考酚酯试验制剂与参比制剂具有生物等效性。

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（收稿日期：2009-01-06）