濒危植物珙桐种群遗传多样性分析
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《西南大学学报》2015年第三期
珙桐DavidiainvolucrateBaill．系珙桐科珙桐属落叶乔木，中国特有的单型属植物，天然分布在我国的7个省，即贵州、湖北、湖南、陕西、四川、云南及甘肃［1］．珙桐科仅一种一变种，即珙桐和光叶珙桐DavidiainvolucrateBaill．var．vilmoriniana．它们起源古老，是第三纪古热带植物的孑遗树种，属国家一级保护植物．珙桐具有极高的观赏价值，是世界上公认的著名观赏树种，开花时因其棕红色头状花序和洁白的苞片酷似展翅的白鸽，故有“中国鸽子树”的美称．自珙桐被人们发现之后，被国内外大量引种，目前的分布已远远跨越其天然保存的范围，而且引种的趋势是逐渐北移和海拔越来越低．但由于人为破坏和环境因素的影响，天然珙桐的种群数量和分布范围都在缩小，张清华等［8］认为到2030年，适宜珙桐分布的面积比当前气候条件下适宜珙桐分布的面积约减少20％．珙桐濒危的原因是多方面的，包括生境范围狭窄、自然更新困难、种子败育严重、人为砍伐破坏及挖掘野生苗等［9］．因此，加强珙桐的保护和研究，合理地开发和利用具有重要的意义．我国从20世纪70年代开始对珙桐进行研究，主要集中在珙桐群落学、地植物学、人工繁殖技术及引种栽培、种群生态学、生物学特性、组织培养技术、形态解剖学等方面．进入21世纪以来，对珙桐的研究有了一定的进展，主要集中在生理、生化、繁育及分子生物学等方面，但利用分子标记对不同种群珙桐的遗传多样性研究还是相对缺乏．本文利用ISSR技术对分布于贵州省内的3个珙桐自然种群、2个珙桐人工种群、1个光叶珙桐人工种群及分布在湖北省内的1个珙桐人工种群的遗传多样性、种群内和种群间的遗传变异进行分析，旨在揭示珙桐种群的遗传多样性和遗传背景，为濒危植物珙桐的保护和合理开发利用奠定基础．
1材料与方法
1．1供试材料供试材料选取珙桐的6个种群和光叶珙桐的1个种群，取其新鲜幼嫩的叶片放在自封袋中，用冰盒带回实验室置于－80℃冰箱中保存．样品的来源及编号见表1．
1．2方法
1．2．1珙桐DNA的提取选用幼嫩叶片，参照改良的CTAB法［22］提取珙桐基因组DNA，DNA浓度和纯度用紫外分光光度计检测，波长260～280nm，OD值在1．8～1．9之间，所提取的DNA纯度较高，可用于ISSR扩增反应．
1．2．2ISSR扩增反应ISSR扩增反应的引物参照哥伦比亚大学公布的引物序列，由北京赛百盛公司合成，在Bio－Rad梯度PCR扩增仪中扩增．ISSR扩增反应20μL体系中进行，反应体系如下：模板40ng、1．0UTaq酶、10×buffer2．0μL、ISSR引物（10μmol／L）1．2μL、dNTP（2．5mmol／L）2．1μL、MgCl2（25mmol／L）1．8μL、双蒸水补足至20μL．PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，43．8～57℃（不同引物退火温度不同）退火45s，72℃延伸1min，40个循环；72℃延伸7min．PCR产物在2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，凝胶中含有0．05％的溴化乙锭，以100bpMarkerDNA作为标准相对分子质量对照，在凝胶成像系统上观察并拍照记录．
1．2．3数据统计ISSR为显性标记，同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性．电泳图谱中的每一条带均视为一个分子标记，代表一个引物的结合位点．对凝胶上的带进行统计，按清晰易变、重复稳定的原则读带，有带或弱带记为1，无带的记为0，获得二元数据矩阵．用POPGENE软件进行数据处理，计算各群体间和群体内的遗传参数．根据Neis遗传距离，按不加权成对算术平均法（UPGMA）建立系统聚类分支树状图．为了检测群体间遗传距离和地理距离的相关性，运用TFPGA程序进行了Mantel测试．
2结果与分析
2．1ISSR遗传多样性分析从100条引物中筛选出12条能产生条带清晰、重复性好的ISSR引物，对7个群体的117个个体进行扩增，共产生199条条带（表2）．图1显示引物UBC881对贵州佛顶山（FDS）的扩增结果．在199条条带中，有177条具有多态性，多态百分率为（PPL）88．94％．每条引物平均产生16．58条条带，多态性百分率为85．0％～100％（表2），说明珙桐具有相对高的多态性．表3显示了不同群体的遗传多样性结果，在7个种群中，佛顶山（FDS）、梵净山（FJS）、湖北（HB）、宽阔水（KK）、林科院（LKY）、纳雍（NY）、植物园（ZWY）的多态百分率分别是39．20％，47．74％，40．70％，36．18％，48．74％，35．18％，35．68％，其中林科院（LKY）的多态百分率最高，而纳雍（NY）的多态百分率最低．Neis遗传多样性（He）在0．1260～0．1795之间，平均为0．1467．从表3还可以看出，各群体的Shannons信息指数（Ho）与多态百分率（PPL）和Neis遗传多样性（He）的大小变化趋势基本一致，即PPL高的群体其He和Ho也高．此外，还分析了物种水平的遗传多样性，在物种水平上PPL为88．94％，Ao，Ae，He和Ho分别为1．8894，1．4813，0．2784和0．4187．
2．2群体间的遗传变异分析POPGENE软件的分析结果显示，珙桐群体间存在一定的遗传分化．7个群体间总的遗传多样性（Ht）为0．2793，而群体内的遗传多样性（Hs）为0．1468．根据总的遗传多样性（Ht）和群体内遗传多样性（Hs）计算不同群体间的分化水平（Gst），所分析的7个珙桐群体间Gst为0．4745，表明总的遗传变异中有47．45％的变异存在于群体间，群体内的遗传变异为52．55％．群体间每代个体的基因流（Nm）为0．5537．
2．3群体间的聚类分析计算Neis遗传一致度（I）和遗传距离（D）（表4），从表4中可见I值的变化范围为0．7690～0．8681，平均为0．8191；D值变化范围为0．1415～0．2626，平均为0．2003．其中LKY与FJS的遗传一致度（I）最高，ZWY与FDS的遗传一致度最低．利用UPGMA法构建群体遗传关系聚类图（图2），以0．26为阈值，7个群体分为2支．FDS的单独一支，其余6个聚为一支，表明佛顶山的群体与其余群体的亲缘关系较远．从图2中还可看出，FJS，ZWY和LKY聚在一起，表明这几个群体的亲缘关系相对较近．Mantel测试表明，群体间的遗传距离与地理距离之间没有显著的正相关性（r＝0．1090，p＝0．5930），说明珙桐的遗传变异没有明显的地域趋势．
3讨论
3．1珙桐的遗传多样性采用ISSR分子标记技术，对濒危植物珙桐的6个种群和1个光叶珙桐种群进行分析，结果表明珙桐具有丰富的遗传多样性．Hamrick等［26］研究了220个属662个种林木中的物种遗传多样性平均水平（P＝64．7％，H＝0．257）．王静等［27］研究了濒危植物连香树的遗传多样性水平（P＝69．59％，H＝0．2313，I＝0．3514）．葛永奇等［28］研究了孑遗植物银杏的遗传多样性水平（P＝70．45％，H＝0．3599）．与珙桐7个种群的遗传多样性水平（P＝88．94％，H＝0．2784，I＝0．4187）相比，珙桐具有很高的遗传多样性水平．濒危植物珙桐在数百万年以前，曾在地球上广泛分布，经过第四纪冰川的影响，只在我国西南地区幸存下来．珙桐遗传多样性丰富的原因可能与幸存个体保留了其祖先丰富的遗传基础有关，使其现存物种具有较高水平的遗传多样性．
3．2珙桐群体的遗传结构群体的遗传结构是通过物种群体间和群体内的遗传分化来体现［29］．本研究得出珙桐种群间遗传分化参数即Neis种群间遗传分化系数（Gst）为0．4745，表明有47．45％的遗传变异存在于种群间，而种群内的遗传变异占总变异的52．55％，表明其种群间发生了较大程度的遗传分化．影响自然群体遗传分化的原因有多种，包括植物的繁育体系、基因突变、种子传播机制、自然环境的选择作用和基因流等．珙桐7个种群的基因流（Nm）仅为0．5537．Slatkin认为［30］，当Nm＜1时基因流就不足以抵制种群内因遗传漂变而引起的种群分化．由传粉和种子传播产生的基因流是导致种群内遗传分化的主要因素之一［31］．珙桐的基因流主要是通过虫媒传粉和果实迁移来实现的，珙桐基因流不足的原因可能与种子的生物学特性有关．珙桐的果实为核果，呈长椭圆形，具有肉质的果皮，内果皮骨质，表面有深沟，十分坚硬，不易萌发，种子的散布局限在树体1～10m环带附近［32］；种子休眠期长，败育现象严重且具有生理后熟期［16］等，这些原因阻碍了珙桐的自然更新，使种群难以扩张，同时也造成了珙桐群体间较低的基因流动．
3．3珙桐的保护策略珙桐是中国特有的珍稀濒危树种，具有极高的观赏价值、生态价值和科研价值．由于生境范围狭小、自然更新困难、种子败育现象严重和人们的肆意破坏等原因，珙桐的自然种群数量急剧减少．本研究表明珙桐具有丰富的遗传多样性，且种群内的遗传变异大于种群间的遗传变异．为了有效保护珙桐的遗传多样性，建议加强珙桐原产地的就地保护，同时人为推广种子繁殖的方式，达到尽可能保护珙桐丰富的遗传多样性的目的．
作者：关萍 张玉晶 石建明 陈业 单位：贵州大学 生命科学学院