YB―1在低氧微环境诱导的宫颈癌EMT中的作用及机制研究
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摘要：目的 探讨Y-盒结合蛋白-1（Y-box binding protein-1，yb-1）在低氧诱导的宫颈癌上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，emt）发生中的作用及可能机制，为研究宫颈癌浸润转移机制提供理论依据。方法 应用二氯化钴（CoCl2）处理宫颈癌Hela细胞模拟细胞低氧微环境，MTT 法检测细胞的增殖活力，筛选CoCl2最适作用浓度及时间；倒置显微镜观察低氧6 h后细胞形态特征；细胞免疫荧光法检测低氧6 h后细胞中YB-1、Vimentin和MMP-2的蛋白表达及其相互关系。结果 模拟低氧微环境的CoCl2最适作用浓度为150 μmol/L，最适作用时间为6 h（P
关键词：Y-盒结合蛋白-1；上皮间质转化；宫颈癌；低氧微环境
中图分类号：R737.33 文献标识码：A
宫颈癌是涉及多因素、多基因共同作用的妇科常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率均居女性肿瘤第二位[1]。尽管宫颈癌筛查不断普及，但仍有大量未经筛查的中晚期患者因肿瘤的浸润、转移及对放化疗耐药，从而导致患者不良预后或死亡。近年研究表明，EMT是具有极性的上皮细胞转变成具有活动能力的间质细胞的过程，是多种肿瘤侵袭转移的重要环节[2]。目前体内、外实验均已证实，EMT在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌和宫颈癌等多种肿瘤的浸润和转移中起着重要的作用[3]。 因此，研究EMT与宫颈癌的关系及其调控机制，对寻找治疗宫颈癌浸润及转移的目标靶点有着重要的意义。
1资料与方法
1.1细胞株和主要试剂 宫颈癌Hela细胞由昆明医科大学云南省药理重点实验室周轶平老师馈赠。CoCl2购自广州金华大化学试剂有限公司；DMSO 、DAPI、兔抗人YB-1多克隆抗体购自碧云天生物技术研究所；单克隆小鼠抗人Vimentin、兔抗人MMP-2单克隆抗体购自武汉博士德生物公司；山羊抗兔-TRITC、山羊抗小鼠-FITC购自康为世纪。
1.2细胞培养 Hela细胞置于5%CO2、饱和湿度、37℃恒温培养箱内培养，取对数生长期的细胞进行实验。
1.3 MTT法检测CoCl2对Hela细胞活力的影响
1.3.1 MTT法检测CoCl2不同浓度对Hela细胞增殖活力的影响 Hela细胞接 种于96孔板，加含CoCl2（0、50、100、150、200、250 μmol/L）的培养基，6 h加MTT，4 h加DMSO，振荡、酶标仪测量OD值，计算细胞存活率。
1.3.2MTT法检测CoCl2不同时间对Hela细胞增殖活力的影响 Hela细胞接种于96孔板，0、3、6、12、24 h加入含150 μmol/LCoCl2的培养基，6 h加MTT 4 h加DMSO，振荡、酶标仪测量OD值，计算细胞存活率。
1.4低氧对Hela细胞形态学的影响 分低氧组、常氧组，低氧组用含终浓度为150 μmol/L的CoCl2溶液的培养基，常氧组用正常培养基培养，处理6 h后在倒置显微镜下观察细胞形态变化，镜检、拍照。
1.5免疫荧光法检测低氧对Hela细胞YB-1、Vimentin、MMP-2蛋白表达的影响 制备细胞爬片、固定、血清封闭、分别滴加YB-1、Vimentin、MMP-2、YB-1与Vimentin、YB-1与MMP-2混合一抗（1∶100），4℃过夜后分别滴加相应的荧光标记二抗，室温避光孵育、DAPI工作液染核、封片，观察、拍照。
1.6 统计学分析 计量资料以（x±s）表示，应用SPSS17.0软件对数据进行t检验；相关分析采用Pearson线性相关，P
2结果
2.1低氧对Hela细胞增殖的影响 MTT结果显示，以50、100、150、200、250 μmol/L 的CoCl2 处理Hela细胞6 h 后，细胞存活率分别为（117±16）%、（103±13）%、（96±17）%、（66±16）%、（55±16）%。CoCl2 对Hela 细胞的增殖具有抑制作用，且呈浓度依赖性，与未加用CoCl2的细胞相比，CoCl2浓度为150 μmol/L时显示显著的细胞抑制作用。用含150 μmol/L的 CoCl2培养基处理Hela细胞3 h、6 h、12 h、24 h后细胞的存活率分别为（109±11.9）%、（103±6.5）%、（88±4.7）%、（69±14.5）%，表明CoCl2作用时间越长，细胞存活率越低，与0 h相比，作用后6 h细胞存活率显著下降（P
2.2低氧对Hela细胞形态学的影响 浓度为150 μmol/L的CoCl2溶液刺激Hela细胞6 h后发现，Hela细胞获得了间质细胞形态特征，大部分细胞逐渐伸展、变形，细胞间空隙变宽，突起变得更为狭长，见图1。
图1 150 μmol /L CoCl2处理6h后细胞形态的变化
（倒置显微镜×100）
2.3低氧对Hela细胞YB-1、Vimentin、MMP-2蛋白表达的影响 荧光显微镜下观察，YB-1阳性表达呈红色荧光，主要定位在胞核或胞浆内，胞核为主。Vimentin的阳性表达呈绿色荧光，定位在细胞质。MMP-2阳性表达呈绿色荧光，主要定位于细胞质或细胞膜。与常氧组比较，低氧组Hela细胞中YB-1、MMP-2、Vimentin蛋白的表达显著增高（P