地黄炮制过程的光谱色谱关联分析研究

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摘 要：本文主要研究了地黄在炮制过程中发生的物理化学变化来确定地黄的炮制终点。本文考察了四个级别地黄在不同炮制时间点的组成成分的变化，即将地黄炮制过程不同采样点同时进行光谱测定与色谱分析，即光谱色谱关联分析（SCAA）。采用衰减全反射傅立叶变换红外光谱法（ATR -FT-IR）进行样品测定；采用反相C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），流动相：乙腈：0.1 %的磷酸溶液（V/V=1：99）混合液，检测波长为210 nm，流速1.0 mL/min进行HPLC法分析；采用核独立成分分析法（KICA）进行数据解析。

关键词：地黄炮制 傅立叶变换红外光谱法 高效液相色谱 关联分析 核独立成分分析

一、简介

1.傅立叶变换红外（FT-IR）的简介

红外光谱法不仅可以用于纯物质的分析，也可用于有固定组成混合物的鉴定。红外光谱法不仅可以用于纯物质的分析，也可用于有固定组成混合物的鉴定。对地黄中的各种成分进行红外分析[1]。

2.高效液相色谱法简介

液相色谱分离系统由固定相和流动相两相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子（即溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。

3.核独立成分分析简介

独立成分分析[2，3]（ ICA） 是一种在信号源和传输信道几乎完全未知的情况下，只依靠对信号源独立性和非高斯性的假设对源信号进行分离的方法。 由于其输出信号彼此独立并具有相同的能量。为解决 ICA 输出的分离信号具有无序性的问题。独立成分分析[4，5]（KICA） 是一种新的 ICA 方法，它利用重建核希尔伯特空间（RKHS） 内的非线性函数作为对比函数，将信号从低维空间映射到高维空间，并运用核方法[6]在该空间内搜索对比函数的最小值，与传统 ICA 方法相比具有更好的灵活性和鲁棒性。

二、实验部分

1.实验试剂及仪器

2.实验条件

FT-IR法实验条件：

光谱分辨率4cm-1，测量范围4000-400cm-，扫描信号累加32次；每个固体样品平行测定三次，液体样测一次。

HPLC法色谱条件：

色谱柱：反相C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相：乙腈： 0.1%的磷酸溶液（V/V=1：99）； 进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min； 检测波长：210 nm

3.地黄的炮制

地黄炮制前处理。闷润：把地黄洗净（先用自来水后用蒸馏水）平放在蒸锅里，盖上锅盖。用胶头滴管吸取少量的蒸馏水润湿地黄，隔一段时间润湿一次，要保证地黄不干且没有多余的蒸馏水流下，若有多余的蒸馏水流下，用胶头滴管吸取并滴到地黄上（避免成分流失），闷润24 h；切片：把闷润的地黄切成片状约1～3 mm厚。

方法：水蒸法，把市售焦作怀地黄大约300 g放入不锈钢双层锅上层（试验装置如图1）。在第二层放入两个小碟子接冷凝液，用电磁炉进行加热，100 ℃保持锅中的水微沸，并每隔1小时补充适量的水。

取样：前十二个小时每隔1个小时取一次样，每次取出地7-10片，取样要均匀，后十二个小时每隔半个小时取样。把取出的地黄切成小碎块，并放入干净的小瓷碟，加以编号依次为1#、2#、3#……。水样从小碟子里面取，每隔一个小时取一次，每取一次换一次小碟子。表面皿用小瓶子支着放在地黄上，覆盖地黄避免冷凝水浸泡地黄导致成分流失。地黄不接触锅壁避免冷凝水浸泡地黄。小碟子放在蒸锅下层，要对应地黄放置避免接不到地黄滴的液体或只接到水的冷凝液。

地黄样品的处理：

3.1干燥：把装着样品的编了号的小瓷碟放在通风橱进行初步干燥。一天后，再把初步干燥后的试样放入烘箱，调温至60 ℃，并保持这个温度，24 h后取出；

3.2粉碎：把干燥后的样品放入粉碎机中粉碎，此时样品成粉末状。过100目的筛后得粗样和细样；

3.3保存：把各试样同样用编号的办法依次装入编了号的试样袋中（粗样和细样要一一对应编号），并把封口试样袋放进干燥器，以保持在干燥的环境，待测分析。

四、实验

傅立叶变换红外光谱法（FT-IR）测地黄样品

高效液相色谱法测地黄样品

试样的处理

1.称量

称取各编号样品0.4000 g，分别置于100 mL典量瓶（或锥形瓶），分别贴上标签。

2.提取样品

加入25 mL甲醇（50%）至锥形瓶中，摇匀，盖上橡皮塞，置于超声波洗涤仪中。超声提取15 min两次，然后取出。

3.离心沉降

离心机8000 r/min，离心5 min，然后取出，用移液管移取15 ml放入编好号的对应的锥形瓶中。

4.挥干

将离心过的样品放入准备好的水浴锅中（水浴锅水温80 ℃为宜），直到溶液挥干为止，水浴锅应放在通风橱中，不但可以缩短挥干时间，还避免甲醇中毒。

5.溶解

用流动相溶解（流动相制备如下2.4.2），加入15 ml流动相溶液，摇动震荡至样品溶解。

6.样品过膜

用0.45 μm的微孔滤膜过滤样品，缓慢的将清液注入样品瓶中，盖上瓶盖，放置待进样（若放置时间过长，应放冰箱中以防变质）[7]。

三、实验数据及分析

1.以一级品为例进行分析

2.一级品地黄炮制24 h的光谱和浓度曲线图

3.KICA关联分析

由以上分析可知，在27-30号样品之间即对应炮制时间为19-20 h炮制达到了终点。

通过KICA法对地黄炮制过程的光谱色谱数据进行关联分析研究，初步建立了地黄炮制过程分析与炮制终点确定的新方法。KICA确立光色谱关联分析的方法能快速监控地黄炮制过程、解释炮制过程化学组分变化规律及确定炮制终点。

参考文献

[1]李清玉，司民真，董琴等.两种具有相同药效蕨类植物的红外光谱分析[J].光谱实验室，2007，24（2）：248～251.

[2]刘洋，吴新杰. 独立成分分析方法的研究和应用[J].沈阳教育学院学报，2006，8（1）：125～126.

[3]毕贤，李通化，吴亮.独立组分分析在红外光谱分析中的应用[J].高等学校化学学报，2004，25（6）：1023～1027.

[4]席聪，张太镒，刘枫.基于核独立成分分析的盲多用户检测算法[J].西安交通大学学报，2004，38（4）：373～376.

[5]Sch jlkopf B ， Smola AJ. Learning with kernels [M] . Cambridge ， MA： MIT Press ， 2001.

[6]Kevin M. Mc Evoy， Michel J. Genet， and Christine C. Dupont-Gillain. Principal Component Analysis： A Versatile Method for Processing and Investigation of XPS Spectra， Anal. Chem. 2008， 80： 7226–7238.

[7]雷敬卫， 白雁， 樊克锋. N IR和HPLC指纹图谱在熟地黄饮片质量稳定性考察中的对比研究[J]. 中国中药杂志，2008，33（18）.