巨峰葡萄籽抗氧化活性成分研究

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[摘要] 采用破碎、溶剂提取、萃取粗分离、硅胶和Sephadex LH-20凝胶柱色谱以及制备HPLC等纯化技术，从购自市场的巨峰葡萄籽中分离得到8个化合物。通过波谱分析并参考文献数据鉴定其结构分别为儿茶素（1）、表儿茶素（2）、槲皮素（3）、没食子酸乙酯（4）、rel-（2S，3R）-2-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-3-（羟甲基）-5-（3-羟丙基）-2，3-二氢苯并呋喃-7-醇（5）、rel-（2α，3β）-7-O-methylcedrusin（6）、rel-（1R，2S）-1-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-2-（4-（3-羟丙基）-2-甲氧基苯氧基丙烷-1，3-二醇（7）和（+）-isolariciresinol（8）。化合物5～8为首次从葡萄籽中分离得到的系列木脂素类化合物，其中，5和6为苯并呋喃-8，3′-新木脂烷型木脂素，7为8，4′-氧新木脂烷型木脂素，8为8，8′：2，7′-环木脂烷型木脂素。通过体外抗氧化细胞模型实验评价发现，与具有较强抗氧化能力的化合物1和2相比，木脂素类化合物6也能明显提高RAW264.7细胞超氧化物岐化酶的活性，显示出较好的抗氧化能力。

[关键词] 巨峰葡萄籽；木脂素；抗氧化

[Abstract] Taking application of some isolation and purification technologies， including crushing， solvent extraction， preliminary solvent isolation， column chromatographies over silica gel and Sephadex LH-20 gel and preparative HPLC， 8 compounds were obtained from the seeds of Jufeng grape sourced from market. Their structures were identified by spectroscopic methods and comparison with literature values as Catechin（1）， Epicatechin（2）， quercetin（3）， ethylgallate（4）， rel-（2S，3R）-2-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-3-（hydroxymethyl）-5-（3-hydroxypropyl）-2，3-dihydrobenzofuran-7-ol（5）， rel-（2α， 3β）-7-O-methylcedrusin（6）， rel-（1R，2S）-1-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-2-（4-（3-hydroxypropyl）-2-methoxyphenoxy）propane-1，3-diol（7）， and（+）-isolariciresinol（8）， respectively. Compounds 5-8 were serial lignans isolated from the seeds of grape for the first time. Structurally， 5 and 6 belong in benzofuran-8，3′-neolignans， 7 in 8，4′-oxyneolignan， and 8 in 8，8′：2，7′-cyclolignan. According to in vitro activity evaluation conducted in cell model， compound 6 showed significant anti-oxidative ability， with the activity of RAW264.7 cell superoxide dismutase being raised evidently in the test as compared with the positive anti-oxidative agents， compounds 1 and 2.

[Key words] seeds of Jufeng grape； lignans； anti-oxidation

doi：10.4268/cjcmm20152117

葡萄为古老且著名的水果，来源于葡萄科Vitaceae葡萄属Vitis多种植物的浆果，既可生食也可酿酒，具有很高的营养价值。葡萄籽为葡萄的种子，经分离葡萄皮和果肉后可得。目前，栽培和市售的食用葡萄多为人工培育或杂交品种，如巨峰葡萄是20世纪60年代开始在我国传播的杂交品种，其粒大、色艳、肉厚、酸甜适中，很受市场青睐。文献报道葡萄籽提取物对肿瘤、心脑血管疾病以及溃疡性疾病具有预防和治疗作用[1-2]；葡萄籽的化学成分主要为原花青色素类成分，有抗红血细胞膜蛋白氧化的生物活性[3]。因此葡萄籽提取物作为营养食品也深受消费者喜爱。此外，葡萄籽还含三萜类、脂肪酸及其酯类、甾体和酚酸等化学成分[4]。为了进一步揭示葡萄籽的化学成分和抗氧化活性基础，作者采用破碎、溶剂提取、萃取粗分离、硅胶和Sephadex LH-20凝胶柱色谱以及制备HPLC纯化等技术，对巨峰葡萄籽进行了化学成分研究，从中分离并鉴定了8个化合物。研究结果首次揭示了葡萄籽的系列木脂素类成分。对8个化合物的抗氧化活性评价结果显示，除儿茶素（1）和表儿茶素（2）外，与LPS模型组相比，一个苯并呋喃-8，3′-新木脂烷型木脂素类化合物（6）在1 μmol・L-1的浓度下能明显提高超氧化物歧化酶活性，具有较好的抗氧化作用。本文报道这些化学成分的分离、结构鉴定和抗氧化活性评价。

1 材料

Varian Mercury-300，400型、Varian INOVA-500型和Bruker AVANCE Ⅲ HD-600型核磁共振波谱仪；Agilent 1200型高效液相色谱仪；岛津LC-6AD制备型高效液相色谱仪（配有SPD-20A紫外检测器）；C18制备柱（YMC-Pack ODS-A， 20 mm×250 mm， 5 μm）为YMC公司生产；Sephadex LH-20为Pharmacia公司生产；Rp C18（40～60 μm）柱色谱材料为YMC公司生产；柱色谱硅胶（200～300目）和薄层色谱硅胶（GF254）均为青岛海洋化工厂产品；色谱纯试剂为Fisher公司生产；水为市售纯净水；分析纯试剂均为北京化工厂产品。细胞超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）Assay Kit试剂盒购自日本同仁化学研究所（Dojindo，JAPAN）。

实验材料为购于市场的商品葡萄籽，经中国医学科学院药物研究所马林副研究员鉴定为巨峰葡萄的种子。在破碎前，经仔细检查和挑选，除净杂质，保证实验材料的纯净和可靠。

2 提取分离

取干燥的葡萄籽22.0 kg，破碎，用80%乙醇回流提取3次，每次溶剂用量均以浸没过葡萄籽原材料为度。滤取并合并乙醇提取液，减压回收溶剂后将所得棕色浸膏混悬于70%乙醇溶液中，用石油醚萃取3次；醇溶液部分经减压回收溶剂再得棕色浸膏，经适量水混悬后，用乙酸乙酯充分萃取，至萃取液颜色变淡且非常澄明为度。将乙酸乙酯萃取液用5%NaHCO3水溶液萃取2次，再用纯净水洗涤至中性，减压浓缩有机相部分得到乙酸乙酯萃取物120 g。

取乙酸乙酯萃取物，首先用硅胶柱色谱进行分离，用氯仿-甲醇（25∶1～15∶1～10∶1～5∶1） 梯度洗脱，得到4个洗脱部分（Fr.1～4）。Fr.3（3.0 g）再经凝胶柱色谱分离纯化，以甲醇洗脱，TLC监测，分成4个洗脱部分（Fr.3.1～3.4）；其中，Fr.3.3部分直接析出化合物3（83 mg）。Fr.3.1（1 g） 部分经Rp C18反相柱色谱分离，以甲醇-水（50%～60%～80%）梯度洗脱，再得到4个洗脱部分（Fr.3.1.1～3.1.4）。Fr.3.1.2（280 mg）经制备高效液相色谱分离（以乙腈-水15∶85为流动相，流速6 mL・min-1，检测波长： 210 nm）得到化合物4（20 mg） 和化合物7（55 mg）；将制备高效液相色谱分离过程中收集的60 min洗脱部分再经制备高效液相色谱分离（以甲醇-水30∶70为流动相，流速6 mL・min-1，检测波长210 nm），得到化合物5（5 mg）和化合物6（2 mg）。Fr.3.1.3（165 mg）经制备高效液相色谱分离（以乙腈-水30∶70为流动相，流速6 mL・min-1，检测波长210 nm），得到化合物8（31 mg）。从Fr.4部分中取10g，经凝胶柱色谱分离纯化，以甲醇洗脱除去部分杂质，再经Rp C18反相色谱柱分离，以甲醇-水（25%～40%）梯度洗脱，由25%甲醇洗脱部分得到化合物1（1.1 g），由40%甲醇洗脱部分得到化合物2（1.0 g）。

3 结构鉴定

化合物1 白色针晶，1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：9.16（1H，s，OH），8.92（1H，s，OH），8.85（1H，br s，OH），8.80（1H，br s，OH），6.72（1H，d，J=1.8 Hz，H-2′），6.68（1H，d，J=7.8 Hz，H-5′），6.59（1H，dd，J=7.8，1.8 Hz，H-6′），5.88（1H，d，J=2.1 Hz，H-6），5.68（1H，d，J=2.1 Hz，H-8），4.85（1H，d，J=5.1 Hz，OH-3），4.47（1H，d，J=7.5 Hz，H-2），3.81（1H，m，H-3），2.65（1H，dd，J=16.5，5.7 Hz，H-4ax），2.34（1H，dd，J=16.5，8.4 Hz，H-4eq）；1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δ： 6.84（1H，br s，H-2′），6.76（1H，d，J=8.0 Hz，H-5′），6.71（1H，br d，J=8.0 Hz，H-6′），5.93（1H，br s，H-6），5.86（1H，br s，H-8），4.56（1H，d，J=7.6 Hz，H-2），3.97（1H，m，H-3），2.85（1H，dd，J=16.0，5.2 Hz，H-4ax），2.50（1H，dd，J=16.0，8.0 Hz，H-4eq）。以上数据与儿茶素结构相符，与文献[5]报道一致，因此鉴定为儿茶素。

化合物2 白色针晶，1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ： 9.08（1H，s，OH），8.87（1H，s，OH），8.77（1H，s，OH），8.69（1H，s，OH），6.88（1H，br s，H-2′），6.65（2H，ov，H-5′，6′），5.88（1H，d，J=2.5 Hz，H-8），5.71（1H，d，J=2.5 Hz，H-6），4.72（1H，s，H-2），4.64（1H，br d，J=4.5 Hz，3-OH），3.99（1H，m，H-3），2.67（1H，dd，J=16.5，4.5 Hz，H-4a），2.46（1H，dd，J=16.5，3.0 Hz，H-4b）；13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：156.5（C-8a），156.2（C-7），155.8（C-5），144.5（C-3′），144.4（C-4′），130.6（C-1′），117.9（C-6′），114.9（C-2′），114.7（C-5′），98.5（C-4a），95.1（C-8），94.1（C-6），78.0（C-2），64.9（C-3），28.2（C-4）。以上数据与表儿茶素结构相符，与文献[6]报道一致，因此鉴定为表儿茶素。

化合物3 黄色粉末，1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz） δ： 12.50（1H，s，5-OH），10.80（1H，s，7-OH），9.62（1H，s，4′-OH），9.41（1H，s，3-OH），9.34（1H，s，3′-OH），7.66（1H，br s，H-2′），7.52（1H，br d，J=9.0 Hz，H-6′），6.86（1H，d，J=9.0 Hz，H-5′），6.39（1H，s，H-8），6.17（1H，s，H-6）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz） δ：175.6（C-4），164.9（C-7） ，160.6（C-9），156.2（C-5），147.7（C-4′），146.5（C-2），145.0（C-3′），135.5（C-3），121.8（C-1′），119.8（C-6′），115.5（C-5′），114.9（C-2′），102.5（C-10），98.4（C-6），93.4（C-8）。以上数据与槲皮素的结构一致，并与文献[7]报道一致，因此鉴定为槲皮素。

化合物4 白色粉末，1H-NMR（CD3OD，400 MHz） δ： 7.04（2H，s，H-2，6），4.27（2H，q，J=7.2 Hz，OCH2CH3），1.34（3H，t，J=7.2 Hz，OCH2CH3）；13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz） δ：166.6（C=O），145.9（C-3，5），138.6（C-4），122.1（C-1），109.8（C-2，6），60.8（OCH2CH3），14.6（OCH2CH3）。以上数据与本课题组报道的没食子酸乙酯结构相符[8]，与文献[9]报道一致，因此鉴定为没食子酸乙酯。

化合物5 白色粉末，1H-NMR（CD3OD，400 MHz） δ：6.98（1H，br s，H-2），6.84（1H，br d，J=8.4 Hz，H-5），6.75（1H，br d，J=8.4 Hz，H-6），6.60（1H，br s，H-2′），6.56（1H，br s，H-6′），5.48（1H，d，J =6.0 Hz，H-7），3.82（1H，m，H-9），3.81（3H，s，OMe），3.75（1H，m，H-9），3.55（2H，t，J=6.4 Hz，H-9′），3.44（1H，m，H-8），2.56（2H，br t，J =7.6 Hz，H-7′），1.79（2H，m，H-8′）。13C-NMR（CD3OD，150 MHz） δ： 149.1（C-3），147.4（C-4），146.5（C-4′），141.9（C-3′），136.7（C-1′），135.1（C-5′），129.8（C-1），119.7（C-6），117.0（C-6′），116.7（C-2′），116.1（C-5），110.5（C-2），88.7（C-7），65.2（C-9），62.3（C-9′），56.4（OMe），55.8（C-8），35.8（C-8′），32.8（C-7′）。以上数据与文献[10]报道一致，因此，按系统命名法鉴定为rel-（2S，3R）-2-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-3-（羟甲基）-5-（3-羟丙基）-2，3-二氢苯并呋喃-7-醇。

化合物6 白色粉末，1H-NMR（CD3OD，400 MHz） δ： 6.95（1H，s，H-2），6.82（1H，br d，J=8.0 Hz，H-6），6.75（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），6.72（2H，s，H-2′，6′），5.48（1H，d，J=6.4 Hz，H-7），3.84（3H，s，5′-OMe），3.84（1H，ov，H-9a），3.81（3H，s，3-OMe），3.75（1H，m，H-9b），3.56（2H，J=6.4 Hz，H2-9′），3.46（1H，m，H-8），2.62（2H，J=7.2 Hz，H2-7′），1.81（2H，m，H2-8′）。13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ： 149.1（C-3），147.6（C-4′），147.5（C-4），145.2（C-5′），136.9（C-1′），134.8（C-1），129.9（C-3′），119.8（C-6），117.9（C-2′），116.2（C-5），114.2（C-6′），110.6（C-2），89.0（C-7），65.0（C-9），62.3（C-9′），56.8（5′-OMe），56.4（3-OMe），55.5（C-8），35.8（C-8′），32.9（C-9′）。以上数据与文献[11]报道一致，因此，按文献命名鉴定为rel-（2α，3β）-7-O-methylcedrusin。

化合物7 白色粉末，1H-NMR（CDCl3，600 MHz） δ： 6.96（1H，d，J=1.8 Hz，H-2），6.87（2H，m，H-5，5′），6.82（1H，dd，J=7.8，1.8 Hz，H-6），6.77（1H，d，J=1.8 Hz，H-2′），6.74（1H，dd，J=7.8，1.8 Hz，H-6′），4.95（1H，d，J=4.8 Hz，H-7），4.11（1H，m，H-9a），3.90（1H，ov，H-8），3.89（3H，s，3′-OMe），3.88（3H，s，3-OMe），3.68（2H，t，J=6.6 Hz，H2-9′），3.64（1H，dd，J=12.0，3.0 Hz，H-9b），2.68（2H，t，J=7.8 Hz，H2-7′），1.88（2H，m，H-8′）。13C-NMR（CDCl3，150 MHz） δ： 151.4（C-3′），146.6（C-4），145.1（C-3），144.9（C-4′），138.2（C-1′），131.8（C-1），121.3（C-6′），121.0（C-6），119.0（C-5′），114.2（C-2′），112.4（C-2），108.6（C-5），87.6（C-8），72.7（C-7），62.2（C-9′），60.7（C-9），56.0（3-OMe），55.9（3′-OMe），34.2（C-8′），31.9（C-7′）。13C-NMR（CD3OD，150MHz） δ： 151.9，148.7，147.3，147.0，138.1，134.2，121.9，121.0，119.7，115.7，114.0，111.8，86.7，74.2，62.2，62.2，56.5，56.4，36.6，32.7。以上数据与文献[12]报道一致，因此按系统命名鉴定为rel-（1R，2S）-1-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-2-（4-（3-羟丙基）-2-甲氧基苯氧基）丙烷-1，3-二醇。

化合物8 白色粉末，1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δ： 6.73（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），6.67（1H，br s，H-2），6.65（1H，s，H-2′），6.61（1H，br d，J=8.0 Hz，H-6），6.18（1H，s，H-5′），3.80（3H，3′-OMe），3.77（3H，3-OMe），3.80（1H，m，H-7），3.62～3.69（3H，m，H-9a，H2-9′），3.39（1H，dd，J=10.8，3.6 Hz，H-9b），2.77（2H，d，J=7.6 Hz，H-7′），1.98（1H，m，H-8′），1.76（1H，m，H-8）。13C-NMR（CD3OD，125 MHz） δ： 149.1（C-3），147.3（C-3′），146.0（C-4），145.3（C-4′），138.7（C-1），134.2（C-6′），129.1（C-1′），123.3（C-6），117.4（C-5′），116.0（C-5），113.9（C-2），112.4（C-2′），66.0（C-9′），62.3（C-9），56.44（3′-OMe），56.40（3-OMe），48.11（C-7），48.07（C-8），40.1（C-8′），33.6（C-7′）。以上数据与文献[13]报道一致，鉴定为（+）-isolariciresinol。

4 抗氧化活性评价

具有抗氧化活性的化合物能够稳定人体内正常细胞产生的自由基，阻止这些自由基在氧化过程中造成其它细胞的损伤，从而起到保护正常细胞的作用；抗氧化活性与多种疾病的治疗密切相关。超氧化物歧化酶（SOD）是机体内清除超氧阴离子自由基的一种重要抗氧化酶，能抗御氧自由基对机体造成的损伤。因此，能否提高SOD的活性是具有抗氧化活性化合物的一个重要的评价指标。

本文按如下实验方法评价各化合物的抗氧化活性：将RAW264.7细胞接种于48孔板，以常规培养细胞组作为正常对照，以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，1 mg・L-1）刺激组作为模型对照组；化合物1～8（1 μmol・L-1）分别与细胞共培养48 h后按试剂盒操作说明检测SOD活性。其中，化合物1和2可参比作为阳性对照组。结果表明，化合物6与LPS模型组相比较，具有显著的抗氧化活性（P

[致谢]长治医学院药学系刘秋梅、张智琪参加部分工作。

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