3种桂枝汤苯丙烯类化合物对oxLDL诱导人脑微血管内皮细胞氧化应激损伤的保护作用お
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[摘要] 该研究主要探讨3种桂枝汤苯丙烯类化合物（桂皮醇、桂皮醛和桂皮酸）对氧化低密度脂蛋白（oxldl）诱导人脑微血管内皮细胞（HBMEC）氧化应激损伤的保护作用。实验通过MTT活力试验确定3种桂枝汤苯丙烯类化合物和oxLDL对HBMEC的增殖和损伤浓度，将处于对数生长期HBMEC分为空白对照组（DMSO）、模型对照组（oxLDL）、叔丁基对苯二酚（tBHQ）组、桂皮醇组、桂皮醛组和桂皮酸组。模型对照组予以终浓度50 mg・L-1的oxLDL，孵育24 h造成细胞损伤模型，再予以终浓度20 μmol・L-1的tBHQ，桂皮醇，桂皮醛和桂皮酸，孵育24 h后，MTT法检测细胞存活率，激光共聚焦扫描显微镜观察活性氧族（ROS）荧光强度，ELISA测定各组细胞内内源性氧化应激指标（SOD， MDA， NO， eNOS）的含量，qRTPCR检测Nrf2 mRNA 表达量。实验结果发现：oxLDL能够诱导HBMEC内源性氧化应激损伤，3种桂枝汤苯丙烯类化合物对正常HBMEC细胞活性无抑制作用。与模型对照组比较，3种桂枝汤苯丙烯类化合物可显著或极显著的改变HBMEC氧化应激状态，上调损伤细胞Nrf2 mRNA表达量（P桂皮酸>桂皮醇，表明3种桂枝汤苯丙烯类化合物（20 μmol・L-1）对oxLDL（50 mg・L-1）诱导的HBMEC氧化应激损伤有较好的保护作用，其机制可能与核转录因子Nrf2调控其下游抗氧化酶基因表达相关。
[关键词] 桂皮醇； 桂皮醛； 桂皮酸； 人脑微血管内皮细胞； 氧化应激
Protective effects of three phenylallyl compounds from Guizhi decoction
oxLDLinduced oxidative stress injury of human brain
microvascular endothelial cells
LI Xiaodong1， GU Liwei1， RAN Qingsen1， ZHOU Pan2， ZHAN Xiaoling1， LI Canghai1*， JIANG Tingliang1
（1Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；
2School of Biomedical Science， Huaqiao University， Quanzhou 362021， China）
[Abstract] The main objective of this research is to observe protective effects of three phenylallyl compounds（cinnamyl alcohol，cinnamaldehyde and cinnamic acid）from Guizhi decoction against oxLDLinduced oxidative stress injury on human brain microvascular endothelial cells（HBMEC）In this study，the toxicity and optimal protective concentration of three phenylallyl compounds from Guizhi decoction were determined by MTT assayThe HBMEC were divided into control group（DMSO），model group（oxLDL），tertbutylhydroquinone （tBHQ） group，cinnamyl alcohol group， cinnamaldehyde group and cinnamic acid groupThe model group were treated with oxLDL （50 mg・L-1）for 24 h，other groups were separately treated with tBHQ， cinnamyl alcohol， cinnamaldehyde and cinnamic acid of 20 μmol・L-1， and exposed to oxLDL （50 mg・L-1） for 24 h at the same timeThe survival rate of HBMEC was detected by MTT assay，reactive oxygen species（ROS） production of injured cells were detected using laser scanning confocal microscope （LSCM），the content of SOD， MDA， eNOS and NO in HBMEC was determined by ELISA， and the expressions of Nrf2 mRNA were detected by quantitative Realtime PCR（qRTPCR）The results shows that oxidative stress injury of HBMEC could be induced by oxLDL， the three phenylallyl compounds from Guizhi decoction did not affect morphology and viability of normal HBMECCompared with model group， the three phenylallyl compounds from Guizhi decoction could improve the above oxidative stress status and upregulate Nrf2 mRNA expressions in injured HBMEC（P cinnamic acid>cinnamyl alcohol），the protective mechanism maybe related to regulation of antioxidant enzymes gene expression in HBMEC by Nrf2
[Key words] cinnamyl alcohol； cinnamaldehyde； cinnamic acid； human brain microvascular endothelial cells； oxidative stress
doi：10.4268/cjcmm20161224
机体细胞不断受到外源性应激因子（亲电子物质、药物和紫外线等）及内源性应激因子（活性氧族、过氧化氢物和醌类化合物等）的刺激，导致机体氧化应激（氧化与抗氧化系统的失衡），引起众多疾病，包括皮肤病（皮炎、牛皮癣、灼伤等）、肾病（肾衰、肾小球肾炎等）、眼科疾病（视网膜损伤、白内障）、心血管疾病（慢性心力衰竭、高血压、动脉粥样硬化等）、肺病（高氧症、哮喘、急性呼吸窘迫综合征等）癌症、关节病（风湿性关节炎）、肝病（肝损伤、缺血性肠病）、脑病（脑卒中、帕金森综合征、阿尔茨海默病）、多器官病（糖尿病、癌症、衰老等）[1]。
桂皮醇、桂皮醛和桂皮酸是从桂枝汤中分离得到的3个主要的苯丙烯类化学成分，三者之间可以通过丙烯基末端的氧化或还原反应相互转化[2]。现代药理研究表明，桂皮醇有解热抗炎作用[3]，桂皮酸有抗肿瘤、抗菌、抗突变等作用[45]，桂皮醛有抗炎、解热镇痛、抗肿瘤、抗菌、降糖、抗肥胖和神经保护等多重作用[5]。本研究根据课题组前期实验结果，体外建立内源性脑微血管内皮细胞氧化应激损伤模型，探讨3种桂枝汤苯丙烯类化合物对其内源性氧化应激指标的改变及关键调控蛋白核转录因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2， Nrf2）的影响。
1 材料与方法
11 材料
111 药品 桂皮醇，桂皮醛，桂皮酸由北京大学药学院提供，纯度均在 98% 以上；叔丁基对苯二酚 （tBHQ）购自美国Sigma公司。
112 细胞株 人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells，HBMEC）由中国人民军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室馈赠。
113 试剂 氧化低密度脂蛋白（oxLDL，北京协生生物科技有限责任公司）；RPMI640培养基干粉（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT，美国AMRESCO公司）；二甲基亚飒（DMSO，美国Sigma公司）；活性氧族（ROS，南京建成生物工程研究所）；丙二醛（MDA），超氧化物歧化酶（SOD），一氧化氮（NO），内皮型一氧化氮合酶（eNOS）ELISA试剂盒（美国R&D公司）；总RNA提取试剂盒（离心柱型），第一链cDNA合成试剂盒和SuperReal荧光定量预混悬试剂（SYBR Green）购自天根生化科技（北京）有限公司。
114 仪器 FV1000激光共聚焦扫描显微镜（日本Olympus公司）；BB16型CO2 培养箱（德国Heraeus公司）；OLYMPUSCK光学显微镜（日本Olympus公司）；5417C/R 型高速冷冻离心机（德国Eppondorf公司）；RT6000酶标仪（美国Rayto公司）；JY92IIN超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；NanoDrop ND1000微量分光光度计（美国Thermo公司）；2720 Thermal Cycler（美国Applied Biosystems公司）；7500荧光定量PCR仪（美国 Applied Biosystems公司）。
12 方法
121 细胞培养及处理 复苏冻存的HBMEC加入含10%胎牛血清、青霉素（100 U・mL-1）、链霉素（100 g・L-1）的RPMI640完全培养基，置于5%CO2，37 ℃恒温培养箱中。待细胞生长融合率达80%～90%时，弃去培养液，PBS缓冲液洗1～2次，用025%胰蛋白酶液消化进行传代。
122 oxLDL诱导HBMEC氧化应激损伤 按121项下法制备消化细胞，吹打成细胞悬液，计数，以4×104个/mL接种96孔培养板中，每孔200 μL，于CO2培养箱正常培养。24 h后，显微镜镜下观察细胞，其融合率达80%左右，弃去培养液，加入无血清RPMI640培养液180 μL，每孔加入不同浓度oxLDL稀释液20 μL，使oxLDL终浓度分别为0， 125， 25， 50， 100， 200 mg・L-1，6个复孔，置CO2培养箱中培养24 h后，显微镜观察细胞的形态及生长状况，每孔加入05% MTT溶液，孵育4 h，倾去上清，每孔加200 μL DMSO，振荡5 min，于酶标仪490 nm处测定吸光度（A），计算各组细胞存活率。
123 3种桂枝汤苯丙烯类化合物对正常HBMEC活性的影响 按121项下法制备消化细胞，以4×104个/mL接种96孔培养板，培养干预。实验分为以下几组，①空白对照组：正常细胞培养，不加药物； ②给药组：桂皮醇、桂皮醛、桂皮酸和tBHQ组，各组分别设5个终浓度200，100，50，25，125 mmol・L-1，6个复孔，培养24 h后，显微镜下观察细胞的形态及生长状况，MTT法测定各组的A，计算各组细胞存活率。
124 3种桂枝汤苯丙烯类化合物对oxLDL诱导HBMEC氧化应激损伤的影响 按121项下法制备消化细胞，以4×104个/mL接种96孔培养板，培养干预。实验分为以下几组，①空白对照组：正常细胞培养，不加药物和oxLDL组； ②模型组：加oxLDL组； ③给药组：桂皮醇+ oxLDL组、桂皮醛+ oxLDL组、桂皮酸+ oxLDL和tBHQ+ oxLDL组，各组分别设5个终浓度200，100，50，25，125 mmol・L-1，6个复孔，oxLDL造模终浓度根据121项下结果来确定。培养24 h后，显微镜下观察细胞的形态及生长状况，MTT法测定各组A，计算各组细胞存活率。
125 ROS激光共聚焦扫描显微镜荧光观察 按121项下法制备消化细胞，以1×105个/mL接种Φ35 mm共聚焦小皿，每皿2 mL，置于CO2培养箱中培养。约24 h时，细胞融合率达80%左右，弃去培养液，同上进行实验分组，给药，培养24 h后，吸取上清液置EP管-80 ℃保存备用；各组细胞用PBS轻洗2次，加入终浓度10 μmol・L-1的DCFHDA 500 μL，于37 ℃培养箱孵育30 min，弃去上清，加1 mL PBS，于激光共聚焦扫描显微镜（激发波长488 nm，吸收波长525 nm）下观察细胞荧光并拍照。
126 SOD，MDA，NO，eNOS含量测定 按121项下法制备消化细胞，以8×104个/mL接种96孔培养板，每孔2 mL，置于CO2培养箱中培养。约24 h时，细胞融合率达80%左右，弃去培养液，同上进行实验分组，给药，培养24 h后，消化收集细胞，超声波碎裂细胞，用BCA定量试剂盒检测细胞匀浆的总蛋白含量，按SOD，MDA，NO，eNOS检测试剂盒说明书于酶标仪进行含量测定，计算含量。
127 Realtime PCR法检测Nrf2 mRNA的表达 按121项下法制备消化细胞，以8×104 个/mL接种96孔培养板，每孔2 mL，置于CO2培养箱中培养。约24 h时，细胞融合率达80%左右，弃去培养液，同上进行实验分组，给药，培养24 h后，消化收集细胞，总RNA提取试剂盒（离心柱型）裂解提取总RNA，NanoDrop ND1000微量分光光度计测定RNA含量，第一链cDNA合成试剂盒逆转录制备cDNA，使用SYBR Green试剂盒在荧光定量PCR仪上进行定量分析（2-ΔΔCt法）。
本实验采用Primer 50 软件设计GAPDH和Nrf2引物序列，并由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，引物参数见表1。
128 统计学分析 采用SPSS 190软件进行统计学处理。所有数据均以±s表示，多组间均数比较用单因素方差分析，P
2 结果
21 诱导HBMEC氧化损伤的oxLDL浓度确定
倒置相差显微镜下观察发现，与空白对照组细胞比较，oxLDL各剂量组随着浓度的等倍量增加，HBMEC在形态上呈现收缩、变圆，胞体变小，细胞间隙增宽，以及部分细胞空泡脱落现象。尤其是oxLDL 100，200 mg・L-1损伤组，HBMEC则出现胞膜边缘不清晰，胞膜不完整，呈现大片碎裂脱落，见图1。
MTT法细胞活力测定结果表明，与空白对照组相比，oxLDL对HBMEC增殖抑制率细胞成活率随着剂量的增加反向降低。25 mg・L-1 oxLDL组即可明显抑制内皮细胞的增殖细胞形态学的观察，本实验以终浓度为50 mg・L-1的oxLDL作为诱导HBMEC氧化应激损伤模型浓度，其抑制率约30%左右，见表2。
22 3种桂枝汤苯丙烯类化合物对正常HBMEC活性的影响
MTT法细胞活力测定结果表明，与正常对照相比，3种桂枝汤苯丙烯类化合物在其浓度低于40 μmol・L-1对HBMEC无明显的毒性作用，见表3。
23 3种桂枝汤苯丙烯类化合物对oxLDL诱导HBMEC氧化应激损伤的影响
MTT法细胞活力测定结果表明： 3种桂枝汤苯丙烯类化合物和tBHQ对oxLDL（50 mmol・L-1）诱导HBMEC氧化应激损伤的增殖产生促进作用的最低浓度略有不同，但均对HBMEC表现出较好的保护作用，当各药物剂量在20 μmol・L-1，其对HBMEC的保护作用最佳，因此，本实验以20 μmol・L-1作为药物的干预浓度，见表4。
24 3种桂枝汤苯丙烯类化合物对oxLDL诱导HBMEC氧化应激损伤的ROS的影响
荧光共聚焦观察发现，与空白对照组相比较，模型组细胞呈现出大量绿色荧光，提示ROS含量极高，而3种桂枝汤苯丙烯类化合物组细胞荧光强度略有增加；于模型对照组比较，3种桂枝汤苯丙烯类化合物组和tBHQ组细胞荧光强度明显降低，其程度为桂皮醛>tBHQ>桂皮酸>桂皮醇，见图2。
A1 空白对照组； A2 模型对照组； A3 桂皮醇组； B1 桂皮醛组；B2 桂皮酸组； B3 tBHQ组。
图2 3种桂枝汤苯丙烯类化合物对oxLDL损伤HBMEC内ROS的影响（×200）
Fig 2 Effects of three phenylallyl compounds on ROS fluorescence in HBMEC injured by oxLDL（×200）
25 3种桂枝汤苯丙烯类化合物对oxLDL诱导HBMEC氧化应激损伤的SOD， MDA， NO， eNOS含量影响
ELISA实验结果表明，与空白对照组比较，模型组细胞内SOD，NO，eNOS含量均降低，MDA含量升高（P
26 3种桂枝汤苯丙烯类化合物对oxLDL诱导HBMEC氧化应激损伤的Nrf2 mRNA表达的影响
RTPCR实验结果表明，与空白对照组比较，桂皮醇、桂皮酸和tBHQ组细胞Nrf2 mRNA的表达量下调 （P
3 讨论
血脑屏障（bloodbrain barrier， BBB）是维持脑内环境稳定和避免有害物质入侵脑组织所必需的结构，是机体参与固有免疫的内部屏障之一。BBB是由脑微血管内皮细胞（BMEC）的紧密连接（tight junction，TJ）、中枢神经系统的血管内皮细胞、血管周围胶质细胞突起和基膜组成，而BMEC的TJ是构成BBB的基础结构[6]，是脑血管疾病发生的基础靶器官，可特异性地转运蛋白或者药物通过BBB，并非特异性地阻断血液中亲水分子以及白细胞的通过[7]。
oxLDL通过刺激激活BMEC上的NADPH氧化酶（Nox）而产生大量的ROS，导致内皮细胞纤维形肌动蛋白微丝明破坏断裂、稀疏紊乱，使内皮细胞通透性增加，有利于脂质成分通过内皮质进入内皮下，引起脂质过氧化，加重细胞的损伤；同时，oxLDL抑制内皮细胞中NOS的活性，加速NO降解，致使内皮细胞功能失调；而ROS和oxLDL二者相互作用加重了内皮细胞损伤和诱导内皮细胞促炎性因子表达，最终减弱了机体抗氧化系统的防御作用[89]。MDA是反映机体脂质过氧化的主要标志物，SOD则是机体清除氧自由基的主要抗氧化酶，NO是内皮依赖性血管舒张功能的主要介质，BMEC的NO由eNOS催化氧化的 L精氨酸生成，它可稳定溶酶体膜、保护细胞免受超氧阴离子（O2-）的损伤及抑制脂质过氧化和自由基的产生[810]。
Nrf2是内源性抗氧化防御系统的关键调节蛋白，在氧化应激条件下核转录因子Nrf2发生核转位，与抗氧反应元件（ARE）结合，启动下游大量的抗氧化酶和Ⅱ相解酶基因的转录，提高机体的抗氧化应激能力，是许多脑及中枢神经系统疾病的治疗靶标[1112]。
本研究采用oxLDL诱导的HBMEC内源性氧化应激损伤模型，观察3种桂枝汤苯丙烯类化合物（桂皮醇、桂皮醛和桂皮酸）抗HBMEC氧化应激损伤的保护作用，以期为其防治脑及中枢神经系统疾病提供一定的科学依据。综合本研究细胞活力试验、形态学观察和细胞内氧化特异性指标及其关键调控蛋白Nrf2 mRNA表达发现，3种桂枝汤苯丙烯类化合物呈现出不同的抗内源性氧化应激的作用，能消除细胞内ROS含量，降低细胞内MDA产生，提高细胞NO含量，改善细胞内抗氧化酶活性和调节细胞功能，其效用以桂皮醛最佳、桂皮酸次之，桂皮醇较弱，其机制可能与核转录因子Nrf2的调控抗氧化酶基因表达相关。
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