猪C型产气荚膜梭菌的分离与鉴定
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摘要：为了摸清引起湖北某猪场3日龄内仔猪以出血性下痢、死亡率高的疾病病因，经病料涂片镜检、培养基接种、生化试验和血清型鉴定，诊断为C型产气荚膜梭菌感染，该菌厌气肉肝汤培养物上清0.001 mL可引起小鼠全部死亡，具有较强的毒力。
中图分类号：S852.61+6.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）23-6190-02
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.23.047
Abstract：For clearing the high mortality disease of Hemorrhagic dysentery in piglets with day 3 at a pig farm in Hubei，the samples were taken to smear test under microscope and medium culture. After biochemical test and serotypes identification，the isolated bacteria were diagnosed Clostridium perfringens type C. The culture fluid of anaerobic broth induced the death of all mice only by 0.001 mL which showed high toxicity. It indicated that the disease in the farm were caused by the infection of Clostridium perfringens type C.
Key words： piglet； Clostridium perfringens type C； isolation and Identification
湖北某i场发生1～3日龄仔猪出现急性死亡的病例，发病仔猪表现发病急，死亡快，排出含有灰色组织碎片及多量气泡的红褐色液状稀粪，发病猪死亡率很高，病理剖检表现为空肠外观呈深红色，肠管内容物呈红黄色或暗红色。经细菌分离、生化试验和血清型鉴定，诊断为C型产气荚膜梭菌感染，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 试验动物
昆明小鼠（16～20 g），购自湖北省医学科学院实验动物中心。产气荚膜梭菌A、B、C、D型标准定型血清购自中国兽药监察所。厌气肉肝汤和血液琼脂平板按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》制备。
1.2 方法
1.2.1 病料采集和接种 无菌采取病死猪的十二指肠和空肠内容物涂片，革兰氏染色后，在显微镜下观察。并取十二指肠和空肠内容物接种厌气肉肝汤，37 ℃培养10～18 h。
1.2.2 细菌的溶血性试验 取上述厌气肉肝汤培养基中的疑似产气荚膜梭菌接种于血液琼脂平板，37 ℃培养18～24 h，观察血平板上是否有产气荚膜梭菌特有的α、β双溶血环。
1.2.3 分离菌株的生化鉴定 挑取有清晰双溶血环的产气荚膜梭菌典型菌落进行纯化，然后将纯化的菌落接种生化培养基进行生化试验[1]。
1.2.4 分离菌株的血清型鉴定 将分离菌株厌气肉肝汤培养物用3 000 r/min离心30 min，取上清与产气荚膜梭菌A、B、C、D型定型血清进行中和，尾静脉接种昆明小鼠进行中和试验，确定菌株血清型[2]，同时用5只尾静脉注射生理盐水作为对照组。
1.2.5 分离菌株的产毒素能力试验 将分离菌株厌气肉肝汤培养物用3 000 r/min离心30 min，取上清0.000 1、0.000 5、0.001 0、0.001 5和0.002 0 mL，分别将其稀释成0.5 mL，各稀释度分别尾静脉注射昆明白鼠各5只，观察24 h内小鼠的死亡情况。
1.2.6 兔泡沫肝试验 取分离菌厌气肉肝汤培养物，3 mL静脉注射家兔，1 h后处死家兔，将家兔置37 ℃恒温箱 8 h，然后进行剖检，观察肝脏的组织病变并进行涂片镜检[3]。
2 结果与分析
2.1 涂片镜检结果
取病死猪的肠等内容物或黏膜抹片，革兰氏染色后，在显微镜下观察。可见革兰氏染色呈阳性、两端钝圆的粗大杆菌，有荚膜。
2.2 培养基接种结果
分离菌株在厌气肉肝汤中生长迅速，在培养过程中产生大量气体；在血液琼脂平板上，在厌氧条件下培养24 h，形成1～2 mm、半透明、灰白色、表面光滑、边缘整齐的圆形菌落，菌落周围呈现β、α双溶血环。
2.3 分离菌株生化鉴定结果
由表1可知，菌株纯培养物能使石蕊牛裂发酵，能够发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、山梨醇、果糖、甘油、半乳糖等，能使其产酸产气；不发酵甘露醇、鼠李糖和靛基质；M.R试验和V-P试验呈阴性，该菌株的生化试验结果与产气荚膜梭菌生化试验结果一致。
2.4 分离菌株的血清型鉴定
将分离菌株培养物的离心上清接种小白鼠，结果，C型标准血清能中和培养物上清液中的毒素，小白鼠全部存活，而A、D型血清中和的上清液注射的小白鼠全部死亡，B型血清可部分中和培养物上清液的毒素，小鼠40%（2/5）死亡，表明分离菌株的血清型为C型。
2.5 分离菌株的产毒素能力试验结果
不同剂量的分离菌株厌气肉肝汤培养物上清液静脉注射小鼠后，0.000 1 mL可分别致小鼠40%死亡（2/5）、0.000 5 mL可分别致小鼠60%死亡（3/5），0.001 0 mL以上可致小鼠在24 h内全部（8/8）死亡。