HPLC-MS-MS法测定克拉霉素血药浓度的含量
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摘 要 建立一种用高效液相色谱-电喷雾离子化质谱（hplc-ms-ms）联用技术测定克拉霉素血药浓度的方法。以甲醇-水（1%甲酸溶液）-乙腈（80∶10∶10）为流动相，罗红霉素甲醇溶液为内标，血浆样品经C18柱分离后，以质谱为检测器，采用选择性离子检测（SIM）测定人体血浆中克拉霉素的含量。
关键词 高效液相色谱-质谱联用 克拉霉素 血药浓度
中图分类号：R927.11； O657.63 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2016）21-0076-04
Determination of clarithromycin in human plasma by HPLC-MS-MS
BIAN Baojun*， DING Liqin， JIN Jiahua**（Shanghai Zhonghua Pharmaceutical Co. Ltd.， Shanghai 200052， China）
ABSTRACT To establish a method for the determination of clarithromycin in human plasma by HPLC-MS-MS. The plasma samples were separated by C18 column and detected by the selective ion monitoring （SIM） with methanol-water （1% formic acid solution） -acetonitrile （80：10：10） as a mobile phase， methanol solution of roxithromycin as an internal standard and the mass spectrometer as a detector.
KEY WORDS HPLC-MS-MS； clarithromycin； plasma concentration
克拉霉素属大环内酯类抗生素，本公司产品为克拉霉素胶囊剂。为增加该品的溶出度，变更了辅料以及制备工艺，故拟进行新制剂的生物等效性评价。由于克拉霉素基本无紫外吸收，故本研究参照文献[1-5]，并作适当修改后，采用高效液相-二级质谱法测定血浆中克拉霉素的浓度。我们对HPLC-MS-MS法测定克拉霉素血药浓度的方法学进行了研究，并测定了18名健康志愿者口服克拉霉素胶囊后的血药浓度，为临床用药提供依据。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药
API 3000液相-质谱联用仪（美国ABI公司，包括：Agilent 1100 G1367A自动进样器；Agilent 1100 G1311A泵；Agilent 1100 G1316A柱温箱；API3000质谱仪及Analyst 1.4软件）。XW-80A微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）；TGL-16B台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；Millipore A超纯水系统。
克拉霉素标准品（每毫克相当于972单位）和内标罗红霉素标准品（每毫克相当于952单位），均由中国药品生物制品检定所提供；参比制剂为本公司生产的克拉霉素胶囊（每粒胶囊含克拉霉素250 mg），试验制剂1和2为经过变更药用辅料和生产工艺后本公司生产的克拉霉素胶囊（每粒胶囊分别含克拉霉素250 mg和125 mg）；甲醇、乙腈均为色谱纯；甲酸为分析纯。
1.2 液相色谱与质谱条件
1）色谱条件 流动相：甲醇-水 （1%甲酸溶液）-乙腈（80∶10∶10）；柱温：25 ℃；流速： 0.2 ml/min；进样量：2.5 μl；预柱：C18（ODS）（Phenomenex）。
2）质谱条件 扫描类型：MRM positive 选择性正离子检测；离子源：Turbo spray；电离模式：ESI；雾化气流速：8 L/min；Curtain gas：8 L/min；碰撞气流速：4 L/min；喷雾针电压：5 000 v；离子源温度：450 ℃。
1.3 克拉霉素和罗红霉素溶液的配制
精密称取克拉霉素对照品102.9 mg，用甲醇溶解并稀释成1 mg/ml 的溶液，再经系列稀释制备成0.2、 1、2、10、20和50 μg/ml 的克拉霉素对照溶液。所有溶液均在4 ℃条件下避光保存。
精密称取罗红霉素对照品10.5 mg，用甲醇溶解并稀释成含罗红霉素0.5 μg/ml的内标溶液。
1.4 血样预处理
精密吸取受试者血浆0.3 ml ，置于1.5 ml 离心管内，加入0.9 ml 蛋白沉淀剂，旋涡振荡2 min后，16 000 r/min离心10 min，取上清液2.5 μl进样分析。
1.5 方法学
1.5.1 标准曲线制备
取健康人空白血浆若干份，分别加入克拉霉素对照溶液，使其浓度分别为 10、50、100、500、1 000和2 500 ng/ml ，按“血样预处理”项下处理后进行HPLC-MS-MS分析。
以药物与内标峰面积比值（Y）对药物浓度（C，ng/ml），用线性回归方法拟合标准曲线（加权系数为1/C2），得回归方程为Y=0.006 695 C+ 0.006 649（r=0.998 5，n=6），线性范围为10～2 500 ng/ml，最低检测限为 5 ng/ml（S/N >10）。
1.5.2 质控点血样处理
按血样预处理方法操作，分别配制含10、500和2 500 ng/ml的克拉霉素标准血样，每一浓度配制3份，按血样预处理方法处理后进行HPLC-MS-MS分析，作为质量控制。质控样品测定结果的偏差应小于15%，低浓度偏差应小于20%。
1.5.3 绝对回收率
用流动相配制10 、100、2 500 ng/ml 的克拉霉素标准溶液，按血样预处理方法处理后进行HPLC-MS-MS分析，分别求得克拉霉素的峰面积（A1）；按照1.5.2方法配制含血样的上述浓度的克拉霉素标准溶液作HPLCMS-MS分析，分别求得克拉霉素的峰面积（A2）。将A2/A1即为绝对回收率。
配制上述浓度的克拉霉素标准血样各5管，按血样预处理方法处理后的样品进行HPLC-MS-MS分析，计算测定数据的相对标准差，即为批内精密度。以后连续5 d，每天测定一个批次内的上述各浓度样品，计算批间精密度。
1.5.4 样品稳定性考察
将上述克拉霉素标准血样，放置在-20 ℃的冰箱中，分别于第0天和第40天取样分析，考察其长期存放的稳定性。将放置在-20 ℃冰箱中的克拉霉素标准血样，反复冻融3次后测定其浓度，考察其冻融稳定性。将上述经血样预处理后的克拉霉素标准血样即时或在室温放置24 h后取样进行HPLC-MS-MS分析，记录峰面积比值，考察样品在预处理后的稳定性。
2 结果
2.1 绝对回收率
绝对回收率的结果见表1。
2.2 批内、批间精密度
批内、批间精密度的结果见表2、3。
2.3 样品稳定性
本研究配制的样品在-20 ℃的冰箱中至少能保存40 d仍稳定（表4），反复冻融3次及在室温保存24 h后血药浓度无明显变化（表5、6）。
2.4 试验制剂和参比制剂血药浓度平均值―时间曲线
18名男性健康受试者随机分成3组，采用三制剂三周期二重3×3拉丁方交叉试验设计[6]的给药方案，分别单剂量口服试验制剂或参比制剂250 mg，在一定时间点抽取静脉血，采用HPLC-MS-MS测定克拉霉素的血药浓度，结果表明试验制剂1和2与参比制剂生物等效[7]（图1）。
3 讨论
测定正常人体内克拉霉素的血药浓度通常多采用微生物法[8-9]，该方法测定的并非克拉霉素单一组分，而是所有具有抗菌活性的多组分复合物；亦有采用HPLC-UV方法[10-11]，紫外最大吸收波长约为210 nm，在此波长下血浆中内源性杂质干扰较多，其测定结果不够精确。目前国内有关克拉霉素HPLC法血样处理方法，都采用有机溶剂如苯、乙醚、乙酸乙酯等液-液萃取，亦有采用小柱活化[12-13]，双蒸水洗脱，甲醇过柱，过程繁琐、复杂，而且样品受杂峰干扰大，最终影响到样品检定的精密度和准确度。本研究建立了测定人血浆中克拉霉素的HPLC-MS-MS检测方法，该方法预处理简单、快速，专属性强且灵敏、准确，最低检测限度为5 ng/ml，应用此方法测定样品均能得到很好的结果，尤其适合于几乎没有紫外吸收的药物克拉霉素的血药浓度测定，能够满足人体药代动力学研究需要。
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