顺铂对秀丽隐杆线虫的急性毒性研究
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摘要：目的 通过急性毒性实验确定顺铂对秀丽隐杆线虫24h的半数致死浓度（median lethal concentration，LC50），然后根据LC50确定亚致死暴露浓度，为进一步的亚急性毒性实验提供参考依据。方法 用K-medium溶液配制不同浓度的顺铂样品溶液，K-medium溶液作对照液，同步化后的秀丽隐杆线虫分别暴露于样品液和对照液，观察24h后秀丽隐杆线虫的死亡与存活情况，同时观察24h线虫的生长发育、繁殖和运动情况，用Probit方法计算秀丽隐杆线虫的24h LC50。结果 顺铂对秀丽隐杆线虫24h LC50为617 mg・L-1，95% 置信区间为580～647 mg・L-1；在实验过程可发现线虫的生长发育、繁殖和运动能力都受到抑制，随着顺铂浓度的升高，抑制越明显。结论 顺铂对秀丽隐杆线虫具有一定的毒性，特别是对线虫的生长发育、运动和繁殖能力都有不同程度的影响。关键词：顺铂；秀丽隐杆线虫；LC50
Abstract：Objective To determine the median lethal concentration（LC50）of cisplatin to Caenorhabditis elegans in the acute toxicity test of 24h，Then according to LC50 to determine the sublethal exposure concentration， which provides reference for further subacute toxicity experiments. Methods K-medium solution was used to prepare a series of concentrations of cisplatin as the experimental groups， K-medium solution as the control solution. Synchronized Caenorhabditis elegans exposure in experimental and control solutions 24h，then observe the mortality， growth， development，reproduction and movement of C. elegans. LC50 were derived through Probits analysis. Results The LC50 was 617mg.L-1， and its 95% confidence interval was 580～647 mg.L-1， the growth and development， reproduction and movement ability of the nematodes were inhibited in the experimental process. Increasing the concentration of cisplatin， the restrain more obvious. Conclusion Cisplatin has a certain degree of toxicity to the nematodes， especially，the effects on the growth and development， movement and reproduction ability of the nematode is different.
Key words：Cisplatin；Caenorhabditis elegans；LC50
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C.elegans）因其虫体小（成虫长1mm）、身体透明、世代和生命周期短（20℃，3.5d）、后代繁殖量大（一只雌雄同体的线虫可产下300多个后代，与雄性可产下1000多个后代）和易于实验室培养等诸多优点，自20世纪60、70年代开始成为模式生物，前期主要用于神经生物学、发育生物学、遗传学研究，现逐步用于基因组学、药物筛选、环境毒理学等众多研究领域[1-3]。随着COPAS系统的出现和微流控技术的快速发展，目前已建立了基于C.elegans的高通量筛选模型[4，5]，如抗感染药物模型[6-9]、抗衰老模型[10-12]和小分子化合物筛选模型[12，13]等。基于其与人类基因的同源性高达60%～80%，近期用于许多人类疾病模型，例如：阿尔茨海默病、帕金森病、糖尿病、脂肪代谢、杜氏肌营养不良和肿瘤等[6]。顺铂（cisplatin）为细胞周期非特异性的化疗药物，主要作用于癌细胞DNA的嘌呤和嘧啶碱基，从而抑制癌细胞的DNA复制，广泛用于生殖系统肿瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌等肿瘤的治疗，在临床应用中以恶心、呕吐、肾毒性、耳毒性及周围神经损伤等不良反应最为常见。在肿瘤治疗过程中，抗肿瘤药物的配置环境对医务人员的潜在毒性损害的相关报道少见，本文利用秀丽隐杆线虫作为模型探讨此问题。
1材料与方法
1.1药物试剂和仪器 顺铂（江苏豪森药业股份有限公司）、AIRTECH SW-CJ-1FD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、XTL-3400E连续变倍体视显微镜（上海思长约光学仪器有限公司）、SPX-70B型生化培养箱（上海邦西仪器科技有限公司）、DRP-9272型电热恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司）、Avanti J-26 XP型高效离心机（美国Beckman coulter）。酵母粉、胰蛋白胨均购自英国OXIDE公司，琼脂（Agar）购自美国Biosharp公司，其他化学药品及试剂均为国产分析纯。
1.2溶液的配置 NGM培养基：每升NGM培养基中含3g NaCl，17g琼脂，2.5g蛋白胨，975ml双蒸水，高温高压灭菌后冷却至55℃，再依次加入无菌的25ml 1M 磷酸钾缓冲液（PH=6.0），1ml 1M MgSO4，1ml 1M CaCl2，1ml 5mg・ml-1胆固醇乙醇溶液（用无水乙醇）。
LB培养基：每升溶液中含10g胰蛋白胨，5g NaCl，5g酵母粉，混匀后用1M NaOH调至PH=7.0。
M9缓冲液：每升溶液中含15.12g Na2HPO4・12H2O，3g KH2PO4，5g NaCl，0.12g 无水MgSO4。
K-medium溶液：每升溶液中含2.36g KCl，3g NaCl。
1.3 秀丽隐杆线虫的培养 N2野生型秀丽隐杆线虫（C.elegans， the Bristol strain N2）、埃希氏大肠杆菌OP50（E.coli OP50）均由中国科学院昆明动物研究所梁斌老师惠赠。N2型线虫饲养于涂有E.coli OP50的标准线虫生长培养基（Nematode Growth Medium，NGM）于20℃生化培养箱中培养。E.coli OP50采用 LB培养基于37℃电热恒温培养箱培养。
1.4线虫的同步化 将处于产卵阶段的线虫进行同期化处理[14]，将怀卵的成虫用M9缓冲液冲洗至无菌的15ml的离心管中，加M9缓冲液至3.5ml，随后加入1ml 5% NaCl和0.5ml 5mol・L-1 NaOH（NaOH：NaClO：线虫悬液的体积比为1：2：7），漩涡振荡约10min至虫体大部分溶解，然后1300g离心1min，弃掉上层清液，再用M9缓冲液清洗2次，收集同步化后的虫卵并置于涂有E.coli OP50的NGM培养基上，20±1℃培养52～54h，获得同步化的L4期幼虫 （ 不孕阶段），用于药物急性毒性实验。本实验全部采用处于L4期幼虫。
1.5急性毒性实验 依照Roh JY [15]等的实验方法：用K-medium溶液配制不同浓度的顺铂（900、810、720、630和540 mg・L-1 5个浓度组），每个浓度组所配溶液均大于2ml，并设K-medium溶液为对照组。每个浓度组设3个复孔，24孔板中每孔加入500ul不同浓度的顺铂，再挑入10±1条L4期同步化处理过的线虫。20℃暴露24h后，在体视显微镜下观察并记录存活和死亡的秀丽隐杆线虫的数目，计算秀丽隐杆线虫的率。秀丽隐杆线虫死亡判定方法为用铂丝针触碰秀丽隐杆线虫无反应即视为死亡。
1.6统计学分析 实验重复4次，LC50通过SPSS16.0软件， Probit方法进行分析。
2结果
2.1线虫的急性毒性实验的外观变化 在线虫给药24h后观察，死亡的线虫身体透亮，身体僵硬变直，并且身体较用药前长度变短，体型稍浮肿，存活的线虫随着药物浓度的升高，其运动能力明显下降，身体蜷缩，做非正弦运动或Ω形运动，身体摆动的幅度和频率明显下降，长势明显比对照组弱，线虫身体细短，用药组线虫几乎无虫卵及后代产生，对照组有少量的虫卵及L1期幼虫出现。
2.2顺铂对秀丽隐杆线虫24h LC50的计算 不同剂量顺铂对秀丽隐杆线虫24h 的死亡率见表1。
3讨论
秀丽隐杆线虫作为毒性评价的模式生物已得到重视，其LC50是常用的评价指标，目前已经成功的运用于重金属、药物和有机物的急性毒性效应。毒性试验中常用的参考指标还有：半数致死浓度、体长、后代数目、后代的产卵量、行为、运动能力等。曾迎新[16]等通过液体浸泡法评价各种金属元素的毒性效应，并且证实线虫LC50与大小鼠的LD50具有一定内在关联性，同理，可利用液体浸泡法验证药物对线虫的LC50与对大小鼠的LD50是否也存在一定的关联。
本文通过溶液浸泡的方法观察了顺铂对秀丽隐杆线虫的急性毒性反应和24h的死亡情况，结果显示顺铂对秀丽隐杆线虫具有一定的毒性，其24h的LC50为617 mg・L-1，95%的置信区间为580～647 mg・L-1，当顺铂浓度达到810mg・L-1以上时，线虫在药物加入后即出现死亡现象，同时出现肌肉萎缩痉挛的现象，身体变短。随着药物作用的浓度升高，线虫的运动能力、生殖能力、生长状况受抑制越明显。顺铂为细胞毒类化疗药物，在临床应用中，患者常会出现肢端周围神经症状。此症状在本文实验中也得到验证：线虫暴露于顺铂溶液后，表现为非正弦运动，运动能力下降（身体扭曲的幅度和频率下降、运动的距离变短等）。本文得到的线虫24h LC50可以为下一步的亚急性暴露实验提供参考依据，为细胞毒药物潜在毒性评价研究打下基础。
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