动物源食品中氟喹诺酮类兽药残留检测的研究进展
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摘 要：抗生素滥用现象在动物源食品的生产加工中较为严重，因此抗生素残留检测是食品质量安全的重要内容。该文综述了动物源食品中氟喹诺酮类兽药残留检测的研究进展，梳理了各类检测技术并对技术的适用性进行了分析，对检测技术的发展方向提出了建议。
关键词：兽药；抗生素；氟喹诺酮；检测
中图分类号 TS207.5 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）13-0038-04
氟喹诺酮类药物（Fluoroquinolones，FQs），又称吡啶酮酸类、沙星类，属于含氟第三代喹诺酮类化学合成抗生素。其抗菌作用机制是：抑制细菌DNA螺旋酶，阻碍DNA的正常复制、转录、转运与重组，对G-菌、G+菌均有抗菌活性，对衣原体、支原体也有一定抗菌作用。目前世界上已经有十几种FQs类药物上市（其中甲磺酸达氟沙星、盐酸二氟沙星、恩诺沙星、盐酸沙拉沙星是专门的兽用抗生素），并有数十种新型FQs类药物处于研发中[1]，在动物性食品的生产过程中，美国已经禁用氟喹诺酮类药物，日本、欧盟与我国虽未禁用，但规定了限用种类和最高残留限量[2]。虽然我国农业部先后了《兽药停药期规定》[3] 和《动物源性食品中兽药最高残留限量》等相关法规[4]，但是由于从业人员缺乏相应知识而造成药物的过量使用及不遵循休药期，甚至片面地追求经济利益，在饲料生产、动物养殖、食品加工等环节中滥用现象严重，其结果，一方面导致细菌耐药性产生，另一方面FQs药物残留可通过食物链进入人体，可损害内分泌系统、消化系统、皮肤系统、神经系统、生殖系统、泌尿系统[5]。由于我国对兽药滥用和危害的重视起步较晚，相关监管落实不严，需要通过检测技术的不断进步和完善，来构筑监测和防控抗生素滥用的健康防线。下面将氟喹诺酮类药物检测的相关技术进行梳理归纳。
1 我国现行的氟喹诺酮类兽药残留检测标准
查阅国标和农业部的现行相关标准，对我国现行的FQs残留检测标准分析如下：
（1）《GB/T 21312-2007动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法：液相色谱-质谱/质谱法》[6]，要求使用固相萃取方法（SPE）进行前处理，并使用液质联用（HPLC/MS/MS）进行检测。该法检测结果灵敏度高、检测限低、可定性、定量，但仪器要求高、过程耗时、步骤繁琐、影响回收率因素多、检测成本昂贵等问题，在日常检测过程中很难加以应用，适合作为残留验证参考。
（2）《农业部1025号公告-14-2008动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测―高效液相色谱法》提供的方法[7]，同样是使用SPE方法进行前处理，使用HPLC（配荧光检测器）进行检测。该法检测限低、灵敏度高，降低了仪器要求，但同样存在过程耗时、步骤繁琐、影响回收率因素多、需专用的一次性SPE柱，检测成本较高等问题。
（3）《农业部1025号公告-8-2008动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测―酶联免疫吸附法》[8]采用常规萃取分离方法进行前处理，使用酶联免疫法（竞争性Elisa）进行检测。该法检测的特异性强、仪器要求低，但存在交叉反应，无法准确定量、检测限、定量限高、试剂盒（条）质量批次差异大、竞争性Elisa容易出现假阳性现象等问题。
2 国内外氟喹诺酮类兽药残留检测方法及进展
2.1 微生物法 微生物法操作方便、设备简单、检测成本低，但是对FQs药物检测的灵敏度低，并且具有选择性，用微生物法检出的阳性样品，还需其他检测方法进行确认。同时，微生物的生长繁殖耗时较长，检测效率不高，仅适合大规模样品的现场初筛使用。
微生物法对FQs药物残留进行检测第一步就是要筛选合适的敏感菌，目前各国药典所收录的抗生素菌种主要有藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌等[9]。检测样品可以直接作用于敏感菌，或常规萃取方法获得样品提取液，再对其进行敏感菌生长抑制实验，具体的检测方法包括：杯碟法、FAST法、CAST法、STOP法、纸片法、亮黑还原试验法、delvotest法、TTC法等[10]。
Okerman等[11]报道了用改进欧洲四碟法检测零售肉中恩诺沙星和环丙沙星的残留，但检测限高于欧盟所规定的最高残留量（MRLs），只能检测高浓度 FQs残留，且不能准确定性。Maki等[12]采用对蜂蜜中的7种FQs进行残留分析，检测限（P/N>3）能达到2～9μg/kg；Nagel等[13]用3种抗生素高敏感型细菌（嗜热脂肪土芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌），以微滴板法（半定量）准确区分牛奶中包括氟喹诺酮类的4类抗生素残留，将传统培养皿法耗时24h缩短到6h；Kim等[14]运用纸片法测定了97头猪和83只鸡体内氟喹诺酮和四环素残留，其中猪肉阳性反应率为39%，鸡肉阳性反应率为13%；刑应寿等[15]以藤黄微球菌为敏感菌，用杯碟法测定环丙沙星在鸡肉组织中的残留，此法对环丙沙星在磷酸缓冲液、肌肉、肝脏和肾脏中的检测限分别为0.025、0.05、0.075μg/g；石颖[16]分离了青海弧菌Q67，以此为敏感菌检测猪肉浸提液，结果显示低浓度喹诺酮类兽药比磺胺类和呋喃类灵敏度高，最小检出限为0.002mg/L。
2.2 免疫分析法 免疫分析法是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析方法，其前处理简单、特异性强、灵敏度高、仪器要求条件低，但存在交叉反应、无法准确定量、容易出现假阳性现象等问题，且免疫试剂的质量差异大，使得该法不适合作残留确证，适用于快速筛选。
由于FQs药物分子量较小，不具备免疫原性，仅能以半抗原的形式与载体形成人工抗原，再以人工抗原免疫动物制备抗体，在体外检测中，研究应用较多的检测方法有酶联免疫法、免疫胶体金法、免疫荧光法、免疫亲和色谱、免疫传感器等[17]。
Duan等[18]制备了环丙沙星多克隆抗体，建立了环丙沙星兽药残留的竞争ELISA检测方法，检测了猪肉、鸡肉、牛乳中的环丙沙星残留，检测限为0.32ng/mL，加标回收率分别为75.58%、81.2%、84.50%，多克隆抗体与恩诺沙星和诺氟沙星的交叉反应率分别为69.8%和44.6%。邢广旭[19]在分析FQs类药物分子结构和免疫原性基础上，采用二环己碳二亚胺法将半抗原Nor（Nor结构是FQs类药物的母核结构）分别与牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）进行连接制备免疫抗原（Nor-BSA）和包被抗原（Nor-OVA），研制成功FQs药物的ELISA多残留检测试剂盒和FQs药物的mAb胶体金免疫试纸。结果表明，试剂盒的半抑制浓度（IC50）为4.61～6.27μg/L，试纸检测50份猪肉阴性样品的假阳性率为0，检测72份猪肉阳性样品假阴性率为0；不同批次的试纸批内变异系数和批间变异系数均小于10%。
3 结语
本文综述了微生物法、免疫分析法和理化检验法这三大类FQs兽药残留检测方法，分析了各类方法的优缺点和适用范围，在实际工作中应根据FQs兽药残留检测筛选、定量、确证等目的，选择合适的分析方法。随着经济发展和人民生活水平提高，动物源性食品消费量也在迅速增加，FQs类抗生素在动物源性食品生产中应用广泛，残留也较为严重，存在着重大的食品安全隐患。随着食品安全意识的提高，对兽药残留的防控意识也在不断的增强。目前，各国科技工作者对于FQs残留检测进行了大量的研究工作，一些新技术、新方法正积极尝试在兽药残留检测中的应用，如：QuEChERS方法[37]、分子印迹（MIT）、超临界流体萃取（SFE）等前处理方法，以及免疫传感器、生物芯片等检测技术，尤其各类前处理技术的创新和深入，必将推动FQs兽药残留检测技术的方向朝着快速、廉价、准确的方向不断迈进。
参考文献
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