荷叶碱在大鼠体内的绝对生物利用度研究

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作者：谢水林，王翌尧，谭玉溪，卢沛枫，田春娟，戴仁科

【摘要】 目的 研究荷叶碱在大鼠体内的药动学特征及其绝对生物利用度。 方法 sd大鼠分别静脉注射 (5 mg·kg-1)和口服(20 mg·kg-1)荷叶碱，给药后不同时间点取血，分离血浆，lc?ms/ms法测定血浆中荷叶碱的药物浓度，用das软件处理数据并 计算 药动学参数，求其绝对生物利用度。结果 静脉注射荷叶碱的药动学参数： auc(0-∞)为(1 118.24±420.90) ng·h·ml-1,cmax为(1 213.17±359.29) ng·ml-1，t1/2为(1.30±0.69) h;口服荷叶碱的药动学参数：auc(0-∞)为(3 111.34±1 986.29) ng·h·ml-1，cmax为(1 257.50±942.37) ng·ml-1,t1/2为(4.89±2.88) h,tmax为(0.33±0.18) h;剂量归一法计算得荷叶碱在大鼠体内的绝对生物利用度为69.56%。结论 该方法专属性强，灵敏度高，可用于荷叶碱的体内定量分析。

【关键词】 荷叶碱;药动学;绝对生物利用度;lc?ms/ms法

abstract:objective to investigate the pharmacokinetic characteristics of nuciferine and its absolute bioavailability in rats.methods i.v.(5 mg·kg-1) and p.o. (20 mg·kg-1) administration were given to sd rats respectively, and the plasma concentration of nuciferine in rats was determined by lc?ms/ms.results the main pharmacokinetic parameters through i.v. and p.o. were as followed: respectively, auc(0-∞)(1 118.24±420.90) and (3 111.34±1986.29) ng·h·ml-1, cmax (1 213.17±359.29) and (1 257.50±942.37) ng·ml-1;t1/2 (1.30±0.69) and (4.89±2.88) h. tmax was (0.33±0.18) h via p.o.. the absolute bioavailability was 69.56% after dosage correction.conclusion this method is specific and sensitive, suitable for in vitro determination of nuciferine.

key words:nuciferine; pharmacokinetics; absolute bioavailability;lc?ms/ms

荷叶为睡莲科莲属植物莲(nelumbo nucifera gaertn)的叶，味苦，平，归肝、脾、胃经，具有清暑利湿、升发清阳、清心去热、止血利水的功效。荷叶碱(nuciferine)作为荷叶的主要活性成分，具有降脂减肥、抑菌、抗病毒等药理活性[1～3]。有关荷叶碱的绝对生物利用度的研究尚未见 文献 报道。本实验采用高效液相串联质谱法分别测定大鼠静脉注射和口服荷叶碱后的血药浓度，并对其体内药动学过程和绝对生物利用度进行了研究，为荷叶生物碱提取物进一步的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器 api3000型三重四极串联质谱仪(美国applied biosystem公司);lc?20ad高效液相色谱仪(岛津);lng?t83真空离心浓缩系统(国产);and微量 电子 天平(日本);3k15高速台式离心机(美国sigma公司)。

1.1.2 药品与试剂 荷叶碱对照品( 中国 药品生物制品检定所，批号：111566?200402);内标非那西丁(中国药品生物制品检定所，批号：100783?200401);甲醇、乙酸乙酯、乙腈均为色谱纯，其它试剂为分析纯。

1.1.3 实验动物 健康sd大鼠12只，雌雄各半，体质量(200+10)g，购自南方医科大学实验动物中心(证号为scxk粤2006-0015)，实验前12 h禁食不禁水。

1.2 实验方法

1.2.1 动物实验方案 12只sd大鼠，雌雄各半，体质量(210±5)g，称重后随机分成两组：一组静脉给药(5 mg/kg)，另一组口服给药(20 mg/kg)，给药后0.033、0.17、0.5、1、1.5、2、4、8、12、24 h 经眼眶静脉取血约0.3 ml，置于有肝素的1.5 ml的ep管中，分离血浆后置于-20 ℃保存。

1.2.2 对照品溶液及内标溶液的制备 精密称取荷叶碱对照品，用甲醇溶解配制成100 μg/ml的对照品贮备液。临用时采用流动相甲醇?水(体积比1∶1)按倍数稀释法配成一系列质量浓度为1、3、10、30、100、300、1 000、3 000 ng/ml的荷叶碱对照品溶液作为标准工作液备用。另取适量的非那西丁作为内标，用乙腈溶解并稀释成100 ng/ml的溶液备用。

1.2.3 血浆样品处理方法 取血浆样品100 μl，加入100 μl的甲醇?水(体积比1∶1)溶液，20 μl的非那西丁内标液，涡流混合1 min，然后加入800 μl乙酸乙酯，涡流5 min,离心10 min(14 000 r/min)，取上层有机相，置离心浓缩仪中吹干，残渣用甲醇?水(体积比1∶1)溶液定容至100 μl，取20 μl进样。

1.2.4 色谱条件[4,5] 色谱柱capcell c18(2.0 mm ×50 mm，5 μm); 流动相a为水?甲醇(体积比95∶5)，流动相b为甲醇?水(体积比95∶5)，流动相a和b均含0.5%甲酸，进行梯度洗脱，梯度条件见表1;流速0.2 ml/min;运行时间3 min;进样量20 μl。

1.2.5 质谱检测条件 采用电喷雾离子源(esi)正离子模式检测，辅助气化气流量：7 000 ml/min;雾化气流量(neb)：7 l/ min;气帘气流量(cur)：7 l/ min;碰撞气流量(cad)：7 l/ min;离子源喷雾电压(is)：4 500 v;离子源雾化温度(tem)：400 ℃;扫描时间：3 min;去簇电压(dp)：45 v;聚焦电压(fp)：150 v;管入口电压(ep)：10 v;q2出口电压(cxp)：12 v。在此质谱条件下，荷叶碱主要生成[m+h]+准分子离子峰，质荷比m/z为296.20，将上述母离子进行产物离子扫描，产生的主要碎片离子的质荷比m/z为265.30，用于分析的离子对为m/z 296.20265.30。表1 待测物和内标的色谱梯度表

2 结果与讨论

2.1 方法的专属性 依“1.2.3”项下进行操作，分别制备空白血浆样品、空白血浆加荷叶碱标准溶液和内标溶液样品、给药后大鼠血浆样品，检测结果分别见图1-图3。结果表明，荷叶碱和内标的保留时间分别为0.99 min和1.21 min，空白血浆中内源性物质和相应的代谢产物、降解产物均不干扰荷叶碱和内标的测定。

2.2 血浆中荷叶碱标准曲线的制备 取大鼠空白血浆100 μl，加入荷叶碱系列标准工作溶液100 μl，配制成质量浓度为1、3、10、30、100、300、1 000、3 000 ng/ml的血浆样品，然后加入20 μl的非那西丁内标液，按“1.2.3”项下操作，以荷叶碱峰面积(as)对内标峰面积(ai)比值(y)为纵坐标，以荷叶碱质量浓度(x)为横坐标作线性回归，得标准曲线的回归方程为：y=0.0197x+0.00597(r2=0.999 2)，表明荷叶碱在1～3 000 ng/ml范围内线性良好，最低定量质量浓度为1 ng/ml。

2.3 绝对回收率 分别配制荷叶碱质量浓度为3、100、1 000 ng/ml的血浆样品(n=3)，加入内标溶液20 μl，按“1.2.3”项下操作;另外用流动相配制3、100、1 000 ng/ml的标准品溶液，加入内标，直接进样，分别测得样品和对照品的峰面积，样品峰面积和对照品峰面积的比值即为荷叶碱的绝对回收率。结果上述3种浓度在大鼠血浆中的绝对回收率分别为(85.8±6.6)%、(89.0±4.8)%和(86.4±3.1)%。

2.4 准确度和精密度测定 分别配制荷叶碱质量浓度为3、100、1 000 ng/ml的血浆样品(n=3)，加入内标溶液20 μl，按“1.2.3”项下操作，连续测定3 d，用当日标准曲线 计算 样品的准确度以及日间和日内精密度。结果上述3种质量浓度的准确度分别为97.5%、103.0%和101%，日内精密度分别为6.6%、5.3%和1.4%，日间精密度分别为11.9%、11.6%和6.5%。

2.5 荷叶碱在大鼠体内的药动学参数和绝对生物利用度 6只大鼠单剂量静脉注射和口服荷叶碱后，大鼠体内荷叶碱平均血药浓度?时间曲线见图4，用das2.0软件处理血药数据，主要的药动学参数和绝对生物利用度见表2。表2 大鼠静脉注射(5 mg/kg)和口服(20 mg/kg)的荷叶碱后的主要药动学参数

【 参考 文献 】

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[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2005年版一部[m].北京:化学 工业 出版社,2005： 195.(责任编辑:陈翔)广东药学院学报