丹参中丹酚酸成分的ESI-MS(n)行为及LC-MS(n)特征图谱研究

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摘　要：目的：研究丹参中丹酚酸成分的ESI－MS规律，建立其LC－MS(n)特征图谱。方法：以丹酚酸B为代表，初步探讨丹酚酸成分的ESI－MS(n)规律。应用LC－MS(n)，ESI(-)模式，以O.5％甲酸水溶液－乙腈为流动相，检测波长287nm，梯度洗脱绘制丹参中丹酚酸成分的特征图谱。结果：得出丹酚酸成分的ESI－MS(n)可能的裂解途径，得到其LC－MS(n)特征图谱，对特征图谱中7种主要化合物进行了精确归属。结论：丹酚酸类成分具有相似的ESI－MS(n)行为，根据质谱提供的各流份的分子量信息及多级质谱的裂解信息，可用于鉴别丹酚酸类成分。所得到的丹参丹酚酸成分的Ms(n)，TTC图，可用于丹参药材中丹酚酸类成分的指纹鉴别。

关键词：丹参；丹酚酸；液相色谱－质谱联用；多级质谱

中图分类号：11285.5

文献标识码：A 文章编号：1673－7717(2007)07－1387－03

丹参为唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge．)的干燥根及根茎，为常用生药，其有效成分主要为脂溶性丹参酮类和水溶性丹酚酸类两大部位。现代药理研究表明，丹参水溶性成分具有改善冠状循环、抑制血栓疾病和抗氧化损伤之功效。除了熟知的丹参素、原儿茶醛外，含量较高的是丹酚酸B、A、迷迭香酸等丹酚酸类成分。本实验以丹酚酸B为代表初步探讨了丹酚酸类成分的ESI－MS(n)裂解规律，并借助LC－MS(n)和LC－UV对丹参中丹酚酸部位的7种化合物进行了精确归属，建立了相对简便快速的特征图谱。

1　仪器与试剂

所有实验都是在Agilent 1100 LC－MSD－Trap－SL－010456系统上进行的，整个系统由二元泵、真空在线脱气机、自动进样器、柱温箱(带柱切换阀)、二极管阵列检测器和质谱仪组成。由安捷伦化学工作站进行数据采集和分析。

Teida公司的色谱纯乙腈，超纯水，其余试剂均为分析纯。丹酚酸B对照品由中国药科大学中药分析教研室提供。

2　丹酚馥成分的ESI－MS(n)行为

Agilent 1100 LC－MSD－Trap－SL－010456系统上的Auto MS(n)可达5级，Manual MS(n)可达11级，笔者根据丹酚酸类化合物的性质，以丹酚酸B，用直接进样法，手动MS(n)对化合物进行裂解，母离子选择方式为Exclude；No．of precursor ions：1；Threshold Abe：200000；Threshold Rd：5％；Prec.Operation：SPS；裂解电压根据裂解图谱手动调整，原则为在可见母离子的情况下，子离子丰度最大。

2．1 样品溶液的制备样品以甲醇溶解，加入少量0.5％甲酸溶液即得。

2．2 ESI/MS(n)条件离子源：ESI(－)；干燥气流速：5.00 L/min；雾化气压力：15psi；干燥气温度：350℃；扫描范围：50-1000m/z。

2．3　丹酚酸B ESI－MS(n)解析见图1。

根据质谱图，得出丹酚酸B质谱碎片产生的可能机理。在ESI(－)条件下，化合物易失去一质子形成奇电子离子(OE－)，得到[M－H]－的基峰m/z 717；提取基峰为母离子进行MS(2)，得到基峰m/z519，及m/z 312，为母离子失去一(二)分子丹参素所致；继续对m/z 519进行MS(3)，得到m/z 321，339，多数母离子继续失去一分子丹参素，少数发生麦氏重排，－180，得到m/z 339；MS(4)提取m/z 339为母离子，得到295，277碎片，应为m/z 339侧链断裂，－44，得到m/z295，碎片中邻二酚羟基继续脱去一份子水成环，－18，得到m/z277碎片。

丹酚酸类化合物分子量较大，同系物较多，但同分异构体少，如丹酚酸E、A、C等，这些水溶性丹酚酸类成分具有相似的ESI－MS(n)行为，根据质谱提供的各流份的分子量信息及多级质谱的裂解信息，可用于鉴别丹参酚酸类成分。

3 丹参中丹酚酸成分的LC－MS(n)特征图谱

3．1　样品及样品溶液制备丹参S.miltiorrihiza，产地四川中江，品种经笔者鉴定。取样品药材粉碎为细粉，过80目筛，精密称取粉末0.2g，以二氯甲烷50mL于50℃索氏提取30min，药渣挥干溶剂后，加入15mL甲醇超声提取40min，残渣以甲醇洗涤两次，合并提取液减压浓缩定容至1.5mL，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液即得丹酚酸成分供试品溶液。

3．2　实验条件液相色谱条件：色谱柱：Zorbax SB－C18，(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：A=O.5％甲酸水溶液，B=乙腈；梯度：0－5min，10％B；5－10min，10％－20％B；10－50min；20％－35％B；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；进样量：1.5μL；λmax=287nm ESI/MS条件：离子源：ESI(－)；干燥气流速：12.00 L/min；雾化气压力：50psi；干燥气温度：350℃；扫描范围：50－1000m/z；Auto MS/MS；Precursion Se-lecfion：Exclude。

4　结果与讨论

4．1　正负离子模式的选择 丹酚酸部位因具较强酸性，质谱采用负离子模式采集信号，得到[M－H]-信号，流动相中加入甲酸主要为改善样品的分离及减少拖尾。

4．2　流速匹配一般而言，流动相流速增加则检出灵敏度降低。实际工作中，如采用2mm内径的液相柱，以0.20mL/min的流速进行分离和质谱测定，对于许多化合物可获得纳克级的检出，可以很好的兼顾良好的色谱分离和质谱测定，因此4.6mm内径的液相柱不大适用于液质联用分析。实际工作中，常采用柱后三通分流的方法实现。本实验采用柱后三通分流，以检出灵敏度控制分流比例。

4．3　丹参中丹酚酸成分的LC－MS特征图谱按上述条件，笔者建立了丹参中丹酚酸类成分的LC－MS特征图谱，得到其丹酚酸成分的MS(n)TIC(多级质谱－总离子流)图和UV色谱图(见图2，图3)。根据质谱提供的各流份的分子量信息及多级质谱的裂解信息，结合文献检索，色谱行为及对照品对照，选取12个特征峰，其中的7个进行了精确归属．分析结果见表1。

负离子模式得到[M－H]+信号，丹酚酸类(以丹参素为母核)的裂解模式是在一级质谱的基础上，脱去一分子丹参素(再脱去一分子丹参素)。脱水、脱CO。

峰2m/z 395，二级质谱脱去一分子丹参素，三级质谱脱去一分子水，可断定为丹参素的二聚体，因未查到俗名，暂且称为丹参素二聚物；峰3m/z 537，二级质谱脱去一分子丹参素，得m/z 339，三级质谱脱去一分子CO2，得m/z295,根据多级质谱数据与色谱行为，可归属为紫草酸；峰4m/z 359，多级质谱数据都符合酚酸类成分得裂解规律，根据色谱行为，归属为迷迭香酸；峰6、7的m/z均为717，多级质谱数据都符合酚酸类成分得裂解规律，可能为Yunna-neic acid G、丹酚酸B或E，根据色谱行为，可分别归属为丹酚酸B、E；峰8的m/z为493，多级质谱数据都符合酚酸类成分得裂解规律，归属为丹酚酸A；峰12m/z 491，多级质谱数据都符合酚酸类成分得裂解规律，可能为丹酚酸C或异丹酚酸C，在化学成分提取过程中。笔者提取得到丹酚酸C，以对照品对照，归属为丹酚酸C。

同样条件下作阴性对照样品，所得空白样品图与药材图对比，证实所选12峰所对应物质均来自于药材。根据对特征峰的精密度、稳定性及重现性考察，结果RSD值均小于5％。丹参丹酚酸成分的MS(n)TIC图的重现性与特征性较好，易于解析，可用于丹参药材中丹酚酸类成分的指纹鉴别。