运动疲劳对大鼠骨骼肌纤维GLUT4mRNA和蛋白表达的影响
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摘要：探讨运动疲劳引起大鼠骨骼肌纤维glut4mrna和蛋白表达的变化及其可能机制。方法：Wistar大鼠40只，S机选取10只为正常对照组（D组），其余采用多级递增负荷跑台运动建立运动疲劳模型，留其成功的20只为疲劳组（P组）；测试力竭运动后2组大鼠血糖、血尿素氮、血乳酸、血清胰岛素含量，采用逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）法测定股四头肌细胞GLUT4mRNA的表达，运用免疫组化法观测该部GLUT4蛋白的表达。结果：力竭运动后即刻，实验组大鼠血糖、血清胰岛素含量均显著低于（P
关键词：运动疲劳；骨骼肌纤维；GLUT4mRNA和蛋白表达；RT-PCR；免疫组化；大鼠
中图分类号：G 804.2 文章编号：1009-783X（2017）02-0182-06 文献标志码：A
在运动性疲劳外周机制的研究中，骨骼肌糖代谢是重要的聚焦点，其主要限速步骤是葡萄糖运载体4（GLUT4）介导的葡萄糖跨膜转运。有研究显示，GLUT4的表达从根本上决定了其转运葡萄糖的能力；而这种葡萄糖转运能力的高低，又直接影响骨骼肌纤维糖氧化供能的底物水平。巫菲等研究表明，慢性心力衰竭可致大鼠骨骼肌GLIT4mRNA表达显著降低。龚豪杰等的研究显示：2周低氧及低氧训练均能引起野生小鼠骨骼肌GLUT4表达的增多；1 h不同强度跑台运动后，野生小鼠骨骼肌GLUT4基因表达量显著增加。唐艳婕等研究结果显示，游泳训练使T2DM大鼠腓肠肌GLUT4蛋白表达增强。杨晓冰的研究认为，运动可以提高胞膜内GLUT4转运速率，且能够增加大鼠骨骼肌细胞内GLUT4的含量，并促进骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取和利用。运动性疲劳能量衰竭学说认为，运动疲劳时骨骼肌纤维葡萄糖几近耗竭、ATP生成减少，运动能力下降而不能维持预定的运动强度。造成这种结果的原因是否与骨骼肌纤维GLUT4的表达有关，相关报道尚不多见。本文通过递增负荷跑台运动建造大鼠运动性疲劳模型，测试力竭后即刻血糖、血尿素氮、血乳酸及血清胰岛素的变化，并运用RT-PCR技术和免疫组化法检测大鼠骨骼肌GLUT4基因和蛋白表达水平，旨在从分子水平上探讨机体适应性变化规律及其可能机制，为运动性疲劳外周机制研究积累有益的资料。
1.材料与方法
1.1实验动物及其饲养环境
选取8周龄健康雄性Wistar大鼠（SPF级）40只，购自甘肃中医药大学实验动物中心（合格证号：SCXK-（甘）-2011-0001），体质量175-200 g。采用国家标准啮齿类饲料喂养，自由饮食。室温23-25℃，相对湿度40%～60%，自然光照，安静无噪声。饲养室、用具等每周紫外灯照射消毒。
1.2建模及分组
所有大鼠适应环境1周后，在动物跑台（BCPT-96型，中国杭州钱江科技工贸公司）上行3 d适应性训练，淘汰体重过轻或过重及不适应跑台训练的大鼠，后随机选取10只为对照组（D）；剩余大鼠以Bedford的方法为基准，对常用的多级递增负荷跑台运动方案加以改良，以此建立大鼠运动疲劳模型：坡度为0、三级负荷：I级负荷（15 m/min，30 min），Ⅱ级负荷（20 m/min，30 min），Ⅲ级负荷（25 m/min，60 min），前6 d每天按不同等级跑一遍，第7天由Ⅲ级负荷跑至力竭（跑姿由蹬地式转为伏地式，滞留在跑道上不动，声、光、电刺激及棍棒驱赶均无效），留取建模成功大鼠20只为疲劳组（P）。
1.3取材及指标测试
力竭后即刻将每只大鼠准确称重并尾静脉取血测试尿素氮（全自动生化分析仪，总医院安宁分院检验科）和血乳酸（便携式血乳酸仪）。后在深麻醉下（0.4%戊巴比妥钠腹腔注射）腹主动脉取血测定血糖（葡萄糖检测试剂盒，己糖激酶法）及血清（4℃下3 000 r/min离心10 min，取血清于-20℃冰箱保存）胰岛素（放射免疫分析试剂盒，购自潍坊三维生物工程集团有限公司）含量。同时迅速分离两侧股四头肌，并切取相同位置5mm3组织2块，将右侧股四头肌块置于10%甲醛溶液固定后，行常规免疫组织化学法观测细胞膜上GLUT4蛋白含量。将左侧股四头肌块置预冷生理盐水中冲洗积血多次，滤纸吸干水分。用标记好的锡纸包裹，置于液氮中冷冻过夜，然后置于-20℃低温冰箱保存，用RT-PCR法测定GLUT4mRNA表达情况。
1.4GLUT4mRNA表达的RT-PCR测定
1.4.1总RNA提取及检测
将左侧股四头肌块从液氮中取出并复温，采用UNIQlO柱式Trizol总RNA提取试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）并严格按要求进行操作。提取后采用紫外分光光度法、1.5%琼脂糖凝胶电泳进行纯度、浓度及完整性检测。
1.4.2引物
GLUT4引物序列如下：
Primer 1：5'-GCTTCCTTGGGTTGTGGCAG-3'；Primer 2：5'-CTGGAAACCCGAOGGCATCTTG-3'。
以B-aetin为内参照，其引物序列如下：
Primer 1：5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'；Primer 2：5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。
1.4.3RT方法
采用Promega公司试剂盒（具体方法详见产品说明书）。
1.4.4PCR法
采用上海鼎国生物工程公司试剂盒（西班牙进口分装）并严格按要求操作。循环条件：94℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，循h35次，最后一次可延长至7 min。
1.4.5结果分析
扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，经JS-380C全自动凝胶成像分析系统观察并拍照，使用ImageJ图像分析软件分析灰度值（统一设定面积294，乘以灰度值面密度即得），将同组GLUT4基因扩增产物与B-actin内参进行比较得基因相对表达量，因反色而求其倒数得最终值，以此比较P组与D组大鼠基因表达量的差异。
1.5GLUT4蛋白袁迭的免疫组化观测
随机选取2组大鼠右侧股四头肌各5块，切片隔5选1，每块制成石蜡切片5张、2组共计50张，常规脱蜡至水；微波抗原修复后，按照常规免疫组化方法制片。在Motic数码显微镜（BA400/450，麦克奥迪实业集团有限公司）下观察上述免疫组化切片，发现股四头肌肌纤维呈现棕色，示阳性染色，提示有GLUT4蛋白表达。在1 000倍视野下，每张切片随机选择1张图像拍照，每张照片选择2个细胞轮廓清晰且阳性反应较明显的部位，用Mofie Images Advanced 3.1图像处理软件测量该部位周长和面积。共计测量阳性反应部位100个。
1.6数据处理
采用SPSS 13.0统计软件对所测数据进行统计学处理，所有数据均以平均数加减标准差（X±SD）表示。组问差异比较采用t检验，其中差异显著水平为P
2.结果
2.1力竭运动后即刻大鼠部分指标测试
实验结束后即刻，2组大鼠体重、血尿素氮及血乳酸测试结果见表1。
力竭后即刻，疲劳组大鼠跑姿由蹬地式变为伏地式，滞留在跑道末端不能继续运动，且声、光、电刺激以及驱赶无效。由表1可以看出：体质量在2组之间无明显变化（P>0.05）；与对照组相比，疲劳组大鼠BLa、BUN显著升高（P
2.2力竭运动后即刻大鼠血糖及血清胰岛素测试
力竭运动后即刻，2组大鼠血糖及血清胰岛素测试结果见表2。与D组比较，力竭运动后即刻，疲劳组大鼠血糖及血清胰岛素水平显著降低（P
2.32组大鼠股四头肌肌纤维GLUT4 mRNA表达的RT-PCR测试
2.3.1GLUT4mRNA纯度、完整性检验
本实验通过紫外可见光分光光度计，在波长260 nm及280nm下测得大鼠A260/A280的比值，具体结果见表3。A260/A280的比值均在2.0～2.1，提示所提取的RNA无降解，且无残余的蛋白质或者酚类物质存在，没有被碳水化合物、盐、有机溶剂污染，无需纯化。同时，还检测了各组大鼠总RNA浓度，发现无显著性差异，提示提取RNA的过程中加样误差较小。
另外，通过琼脂糖凝胶电泳，还检测了2组大鼠骨骼肌纤维GLUT4mRNA的完整性，如图1所示。RNA样品电泳后条带无杂质，且可以显示28 s、18 s和5 s的小分子条带。通过紫外线成像系统观察，电泳条带28 s和18 s的比值约为2：1，表明所提取的RNA无降解，完整性较好。
2.3.2内参引物B-actin电泳检测结果
经琼脂糖凝胶电泳可见内参引物B-actin条带清晰，无杂质，在100～250 bp，如图2所示，与经过PCR扩增的GLUT4mRNA相比较，可以清晰地看到扩增出来内参引物B-actin与GLUT4mRN段长度都控制在200 bp左右，如图2和3所示，说明扩增效率较为一致，可供后续进行实验。
2.3.32组大鼠股四头肌肌纤维GLUT4 mRNA的表达
单链的GLUT4mRNA经逆转录形成了等量且相对较稳定的双链cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统观察并拍照，如图4所示。
从图4可以看出，B-actin在4组中的表达基本一致，而P1、P2组GLUT4基因表达亮度均强于D1、D2组；用Image J软件做灰度值扫描，结果见表4。
由表4可知，大鼠P1和P2组的GLUT4基因表达最终值分别比D1、D2组显著（P
2.4 2组大鼠股四头肌肌纤维GLUT4蛋白表达的免疫组化测定
力竭运动后即刻，随机选取2组大鼠右侧股四头肌各5块行常规免疫组化实验，后用数码显微镜观察大鼠股四头肌GLUT4蛋白的表达，可见其免疫反应产物呈棕黄色，阳性细胞轮廓清晰。在1 000倍视野下拍照，用Motic Image advanced3.1图像分析系统随机对阳性部位进行面积和周长测定，结果见表5和图5。
从免疫组化切片可以看出，2组大鼠骨骼肌细胞膜上GLUT4均呈阳性表达。用Motic数码显微镜可观察到骨骼肌细胞中均有大量棕黄色反应团块。在1 000倍下可见免疫阳性反应产物呈棕黄色或棕褐色。与对照组相比，疲劳组大鼠骨骼肌细胞膜上GLUT4蛋白阳性反应产物面积显著（P
3.讨论
当机体的生理过程不能持续其机能在一特定水平或不能维持预定的运动强度时，将发生运动性疲劳。根据其发生部位，可分为中枢疲劳和外周疲劳2类。外周疲劳主要体现为骨骼肌非有效收缩；然而，有效收缩须依赖充足的能量供应，葡萄糖是机体能量的重要来源，葡萄糖稳态是维持机体诸多生理功能的重要保障。现已知，葡萄糖的跨膜转运是骨骼肌细胞利用葡萄糖的主要限速步骤。这一过程需依靠细胞膜上的特殊转运蛋白_葡萄糖运载体（glucose transporters，GLUTs）介导完成。骨骼肌细胞中存在2种GLUT，分别为GLUTl和GLUT4，前者主要位于骨骼肌细胞外膜上，只在基础状态下参与细胞对葡萄糖的摄取和转运；而后者在基础状态下主要位于细胞内的微粒体和某些特定的囊泡等各种内膜结构上，对胰岛素和收缩刺激敏感，是骨骼肌细胞主要的GLUT。对GLUT4基因敲除小鼠的研究显示，无论在基础状态下、还是胰岛素刺激或运动刺激下，GLUT4对维持正常葡萄糖转运速率是必不可少的。在小鼠、大鼠和人类骨骼肌中，GLUT4是主要的亚型。可见，研究运动疲劳对骨骼肌细胞GLUT4mRNA及蛋白表达的影响及调控机制是十分有意义的。
本实验以Bedford早年的方案为基准略加改造，坡度固定、强度递增，在行为学观察的同时佐以体重、BUN及Bla指标综合判定疲劳状态。结果发现：疲劳组大鼠BUN、Bla浓度显著高于对照组（P
有关运动与血糖关系的研究结果不尽相同。郑陆等研究发现，大鼠负重游泳至力竭时血糖水平升高。朱亚林等在其力竭运动试验中发现，血糖浓度几乎没有发生改变。杨东升等的实验揭示，力竭运动过程中大鼠外周血糖浓度随时间延长而显著降低。本实验结果显示：大鼠末次跑台运动至力竭，血糖浓度显著降低（P
显然，低葡萄糖、低胰岛素不可能作为信号因子弓I发级联反应而上调GLUT4mRNA及蛋白表达。有研究显示：运动和胰岛素刺激肌肉葡萄糖转运存在不同的机制。与胰岛素效应相比，运动并不增加胰岛素受体、IRSl、IRS2酪氨酸磷酸化或P13K活性。对AMP活化蛋白激酶（AMPK）的研究发现，AMPK参与调解具有收缩活性的骨骼肌多种代谢和生长过程。AIVIPK是代谢产物传感蛋白激酶家族成员之一，并作为燃料计量器监控细胞能量水平。当骨骼肌收缩、缺氧、氧化磷酸化解偶联和渗透压休克时，AMPK被迅速激活嘲。一方面它能切断ATP消耗通路并打开ATP再生旁路途径，以此延缓能量迅即衰竭；另一方面，激活的AMPK可能通过调节基因转录影响GLUT4mRNA表达上调，并间接影响其翻译水平。有关后者的证据来自对酵母AMPK同系物SNF-1的研究，发现AMPK在基因转录中发挥重要作用。贾维娜等的研究显示，长期高脂肪酸饮食可致大鼠骨骼肌GLUT4mRNA表达显著下降。施曼莉等的研究结果表明，进行8周高强度间歇跑台运动后，SD大鼠骨骼肌总GLUT4及肌膜GLUT4蛋白表达显著增高。⑾嫉鹊难芯肯允荆长期的有氧运动可显著增强T2DM大鼠脂联素-AMPK-GLUT4信号通路，单纯的膳食控制对改善T2DM大鼠脂联素-AMPK-GLUT4信号通路的作用不大，有氧运动联合膳食控制对增加T2DM大鼠骨骼肌AIVIPK和GLUT4有显著交互作用。张茁等的研究结果显示，6周的山柰酚灌胃能显著上调KKAy小鼠骨骼肌GLUT4基因及蛋白的表达，其作用机制可能和上调P13K-AKT-GLUT4信号通路有关。这样就可以解释本实验中，运动疲劳引起骨骼肌GLUT4mRNA及蛋白表达上调的部分机制，但进一步阐明收缩刺激引发的葡萄糖转运的具体路径和环节将是今后骨骼肌生物学研究的主要目标。
4.结论
1）本实验通过改良而建造的运动性疲劳大鼠模型是成功的。2）运动性疲劳引起大鼠血糖、血清胰岛素浓度均显著下降，却使血乳酸、血尿素氮浓度显著增高。3）运动性疲劳引起大鼠骨骼肌GLUT4mRNA和蛋白表达增强。对于第2、3条之间的内在生理机制和逻辑关联，我们可以理解为：本实验通过递增负荷跑台运动建造运动疲劳大鼠模型，力竭只是运动性疲劳的终极阶段，疲劳的发生是动态的累积过程。大鼠跑台运动至力竭，作为能量底物的葡萄糖已基本耗竭，这种低葡萄糖负荷反馈调节胰岛素分泌减少；此时，机体通过非胰岛素依赖途径，即运动肌肉收缩刺激使AMPK激活，进而激发相关信号转导通路而致骨骼肌细胞GLUT4mRNA表达上调、促使GLUT4蛋白合成增多并积极转位，以此提高葡萄糖的转运速率，延搁由能量衰竭引发的级联反应，从而延缓运动性疲劳的发生。