食源性诺如病毒疫情中PCR检测技术的运用探讨

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摘要：目的 对1起由诺如病毒引起的学校聚集性急性胃肠炎疫情进行实验室调查分析。方法 流行病学调查与实验室检测相结合，采集病例肛拭、粪便、食品、调味品、环境涂抹样、水样共40份样本，进行RT-PCR核酸检测及常规细菌学检测。结果 6名学生、1名保健教师、3名食堂厨师的肛拭样和1个粪便样、1个食品中检出诺如病毒核酸阳性。结论 RT-PCR检测技术能快速有效的检出肛拭、粪便、食物中的诺如病毒，从而为疫情的病因诊断提供科学依据。

关键词：诺如病毒；PCR；食源性疾病；检测技术

Abstract：Objective A laboratory investigation and analysis of school outbreaks of acute gastroenteritis caused by Norovirus was performed. Methods The method combined epidemiological investigation with laboratory testing was employed. A total of 40 samples includingswabs and feces of patients； food； condiments； smear samples of environment samples ； water samples were collected and utilized for RT-PCR detection and routine bacteriological testing. Results Norovirus nucleic acid were detected positive inswabs of six students， a health care teacher， three chefs and a feces sample， a food. Conclusion Norovirus inswab， feces and food can be detected quickly and effectively by RT-PCR.

Key words：Norovirus；PCR；Foodborne diseases；Detection technology

近年来，诺如病毒引起的急性胃肠炎暴发时有发生。诺如病毒可通过食物、水及人与人接触而使人感染发病，若在学校及幼儿园等集体单位发生，则易引起群体性胃肠炎暴发。诺如病毒感染性腹泻以起病急、传播快、暴发多为特征，因该病的症状及其多在冬季流行率上升，故被称为"胃肠道流感"或"冬季呕吐病"[1]。本文针对2015年3月成都市成华区某小学发生的一起诺如病毒引起的聚集性急性胃肠炎，将相关实验室病原检测情况及技术探讨报告如下：

1 资料与方法

1.1临床信息 学生聚集性病例的主要症状为呕吐、腹泻、腹痛、恶心，部分病例的血常规检测结果显示白细胞总数、中性粒细胞率增高。

1.2流行病学及卫生学调查 患者均为在校学生及教师，有在校共同进餐史，学校提供公用直饮水及生活用水。

1.3 样本采集及其来源 根据流行病学信息，准备的采样物资包括病毒采样管（北京友康）、自配灭菌1% NaCl肉汤、灭菌盐水和肠道致病菌直划平板（Mac、HE、TCBS）。采集病例肛拭8份、粪便样1份、学校厨师肛拭8份、供餐食品留样5份、调味品4份、环境涂抹样16份及水样2份（见表1）。

1.4实验室检测 对采集的样本进行病毒学检测和食物中毒常规致病菌检测。用RT-PCR法检测诺如病毒和轮状病毒核酸；采用RT-PCR和细菌培养法检测食物中毒常规致病菌：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、致泻大肠埃希氏菌。

1.4.1 病毒检测样本处理 肛拭和粪便样本无需前处理；对于食品样本，采用无菌操作取适量（约5 g）样本至病毒采样管内（若有体积较大的食材，则用灭菌剪刀剪碎后放入），充分振摇后，静置待用。

1.4.2 细菌DNA 的提取及检测 取样本盐水管上清液1mL，12000rpm离心5min后弃上清。沉淀加入灭菌水50μL，将其悬浮后100℃煮沸5min，12000rpm离心2min，取上清用于PCR反应。本实验采用达安生物科技有限公司提供的沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、致泻大肠埃希氏菌核酸检测试剂盒，按说明书加入5μL核酸提取物，在ABi Step-one plus PCR扩增仪依程序进行40次循环扩增，并检测。

1.4.3病毒RNA 的提取及检测 选用天隆核酸提取试剂盒（磁珠法）（Ex-RNA/DNA 病毒2.0）提取病毒RNA。取各样本上清液200μL，按说明书加入10μL Proteinase K，4μL Acryl Carrier，放入天隆NP 968核酸提取仪依程序自动提取。RT-PCR采用达安生物科技有限公司的A、B、C 组轮状病毒核酸、诺如病毒核酸检测试剂盒，取核酸提取物5μL，加入PCR反应管，放入ABi Step-one plus PCR扩增仪依程序扩增40个循环，并检测。

1.4.4 细菌学培养法常规检测 按照WS 271-2007、GB 4789-2010方法进行沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、致泻大肠埃希氏菌、变形杆菌、椰毒假单胞菌等病原菌的检测。

2结果

2.1细菌PCR检测 扩增曲线均无明显指数增长期和平台期，表明样本中未检出目标菌核酸。

2.2病毒RT-PCR检测 RT-PCR结果表明，6名学生、1名保健教师、3名食堂厨师的肛拭样本和1个粪便样本、1个食品样本（炒榨菜）中检出诺如病毒；所有样本中均未检出轮状病毒（见表2）。

注：打"/"号为该样品未开展检测此项检测。

2.3细菌学培养 细菌学培养结果显示，样本均未检出目标菌。

2.4疫情控制 临床资料、流行病学调查资料和实验室检测结果显示，从食品加工者、食品及用餐者检测出诺如病毒，构成一条出清晰的传播链。因此，此次疫情判定为诺如病毒引起的聚集性疫情，可能系诺如病毒污染学校供餐食品所致。明确诊断和进行疫情分析后，疾控中心继续开展调查，指导并督促学校落实疫情控制措施，停止食用污染的食品，对相关区域进行了消毒，对带病毒厨师调离食品加工岗位，继续开展症状监测、病例搜索等防控措施。对住院病例进行有针对性治疗。截止疫情发生后第3d，住院病例相继痊愈出院，未发现新发病例，疫情得到有效控制。

3 讨论

3.1在17例病例的临床检验结果中，有5例血常规检测结果显示中性粒细胞率增高，淋巴细胞率降低，部分患者白细胞总数增高。一般情况，接诊医院会做出胃肠道细菌型感染诊断，但检测实验室不应轻易排除对病毒的采样、检测。

3.2此次事件共采集了40个样本，包括肛拭、粪便、食品、调味品、环境涂抹样、水样等不同的样本类型，样本容器包括病毒采样管、1% NaCl肉汤采样管、灭菌盐水采样管和Mac、HE、TCBS致病菌直划平板。科学、适度、合理的采集样本可提高病原微生物的检出率。

3.3诺如病毒的检测目前主要采用RT-pcr 技术，国内食品类检测研究仅限于牡蛎等贝类样本， 尚未见蔬菜、水果等其他食品的病毒检测方法报道。另外，食品样本一般体积大，病毒含量少，样本处理、病毒富集是实验室检测的关键点，也是难点。一般采用有机絮凝沉淀法进行富集[3]。但无论是PEG沉淀法，还是Trizol抽提法，过程都比较繁琐、用时长，加之多数基层疾控中心现阶段并未配备相关设备和耗材，因此无法进行病毒富集。在此次检测中，我们根据经验判断病毒含量可能比较大，所以采用均质后静置，取上清液直接进行检测，结果显示多个样本诺如病毒阳性。这表明在样本数量足够、污染病毒量大且成分单一的情况下，本方法对于突发公共卫生事件的快速检测有一定的可行性。

3.4 与常规培养方法相比，PCR技术用于病原微生物检测具有灵敏、快速、检出率高等优势。目前，该技术的应用越来越广泛。此次采用PCR法检出以诺如病毒为代表的肠道致泻病毒，为聚集性胃肠炎的病因诊断提供了有力证据。

3.5对于基层疾控中心来说，病原微生物的富集、检测等基础设备设施的匮乏给检测带来了一定的难度，特别是中西部地区的基层疾控中心应加强检测能力的建设。

参考文献：

[1] GUREMONT E，BRASSARD J，HOUDE A，et al.Development of an extraction and concentration procedure and comparison of RT-PCR primer systems for the detection of hepatitis A virus and norovirus GII in green onions[J].J Virol Meth， 2006， 134（1-2）：130-135 .

[2] KOOPMANS M，DUIZER E.Food borne viruses：an emerging problem[J].Int J Food Microbiol，2004，90（1）：23-41.

[3] 周晓红.食品中诺如病毒RT-PCR 检测技术研究进展[J].国外医学卫生学分册，2009，36（4）：234-238.