ELISA和IFA法检测SARS患者病毒抗体IgG和IgM的比较

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作者 ：李穗芬 谭奕洲 唐漾波 刘丽儿 袁小珍 唐小平 尹炽标 【关键词】 elisa

【摘要】 目的 探讨SARS患者体内SARS病毒抗体产生的规律及比较ifa和ELISA法的特点。 方法 采用间接免疫荧光技术（IFA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）对43例SARS患者双份血清及10例正常人双份血清的SARS病毒IgM/IgG抗体进行检测。 结果 43例患者中新近感染sars病毒40例（93.02%），3例未检出其感染。发病10天内检出率较低，发病10天后检出率较高。阳性率随发病时间而上升。在SARS病毒IgG的检测中，ELISA法较IFA法敏感。 结论 IFA法和ELISA法均适合于SARS发病10天后实验室辅助诊断方法，ELISA法较IFA法敏感。

关键词 SARS病毒 酶联免疫吸附试验 间接免疫荧光技术 IgM IgG

The comparison between ELISA and IFA methods for determining antibodies of IgG and IgM in patients with SARS

【Abstract】 Objective To study and discuss the rules of the SARS virus antibody production in patients with severe acute respiratory syndrome（SARS），compare the characteristics of IFA and ELISA.Methods The SARS virus IgM/IgG antibodies of double serums of43patients with SARS and10normal controls were detected by IFA and ELISA.Results 40out of43（93.02%）patients with SARS infected SARS virus recently and other three patients can't be detected the antibody.The antibody detection rate that with in10days of the disease taking bad is lower than that after10days，the positive rate of the detection raises following the increase of the time of disease taking bad ELISA is more sensitive than IFA in the detection of SARS virus antibody IgG.Conclusion Both IFA and ELISA are fit for the lab assistant diagnosis of SARS that taking bad more than10days，ELISA is more sensitive than IFA.

Key words SARS virus enzyme linked immunoadsorbed assay indirect immune fluorescent assay IgM IgG

在临床上有多种病原体可以引起肺炎等呼吸道疾病，较常见的有细菌、病毒、衣原体、支原体、立克次体等。一种病毒被确认是引起传染性非典型肺炎即重症急性呼吸道综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）的病原 ［1］ 。世界卫生组织已正式将此病毒命名为SARS病毒。为了解SARS患者血清抗体产生的规律，本项研究用间接免疫荧光法（IFA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）对广州市第八人民医院的SARS病例和正常人血清SARS抗体进行检测。为SARS的特异诊断提供依据和参考，同时也比较了两种方法的特点。

1 对象与方法

1.1 对象与样品收集 43例SARS患者均为2003年2～3月期间广州市第八人民医院收治的住院患者，诊断符合广东省SARS的诊断标准，男19例，女24例，年龄11～84岁（平均41.09岁），在本院的住院天数为6～40天（平均17.53天），留取以上研究对象住院初期及之后的双份血清，以发热症状出现作为其起病时间，第一份血清距起病时间为0～19天（平均5.3天），第二份血清距起病时间为6～33天（平均16.23天），两份血清采集时间相距2～23天（平均10.93天）。另选取10例正常人的双份血清作对照组同时进行检测。

1.2 试剂、仪器

1.2.1 IFA试剂盒 由广东省疾病预防控制中心微生物所提供。ELISA试剂盒:由北京华大吉比爱生物技术有限公司提供。

1.2.2 仪器 日本OLYMPUS荧光显微镜，荷兰ALISEI全自动酶免分析仪。

1.3 实验方法

1.3.1 IFA实验方法 待测血清56℃30min灭活，每份血清标本用0.05mol/L、pH7.2磷酸缓冲液（PBS）分别稀释到1∶20和1∶80两个稀释度，（IgM1∶20，IgG1∶20和1∶80）每个稀释度各取10μl分别滴加在抗原片的不同孔上。将玻片置37℃湿盒中，检测IgM抗体放置60min，检测IgG抗体放置30min。反应完成后将玻片取出，用PBS冲洗5次，晾干。在荧光显微镜下观察染色结果，根据胞浆或胞膜部位有无特异性荧光来判断检测结果。

1.3.2 ELISA实验方法 对照孔分别直接加入50μl阴、阳性对照，其余检测孔加入样品稀释液100μl/孔。加入待测样品10μl（IgM加入已用生理盐水稀释10倍的待测样品）混匀，37℃30min（IgM37℃60min）。洗板5次，拍干、分别加入相应的酶标抗体，37℃20min。洗板5次、拍干，每孔加入底物A、B液各50μl，37℃避光10min。每孔加入终止液50μl，以空白调零，置酶标仪450nm波长下检测OD值。

1.4 结果断定 大于Cut off值为阳性:IgM Cut off值=0.11+阴性对照OD均值;IgG Cut off值=0.13+阴性对照OD均值。

1.5 新近感染判定标准 实验结果符合以下任何一条判定为SARS病毒新近感染:（1）IgM阳性。（2）第一份血清IgG阴性，第二份血清IgG阳性。（3）第二份血清IgG滴度或样本OD值/Cut off值（S/CO）比第一份血清有4倍以上的增高。

1.6 统计学方法 采用SPSS11.0数据统计软件进行数据处理。对SARS患者患病后不同时间双份血清，分别采用ELISA和IFA两种测定方法，监测SARS患者抗体IgG和IgM阳性率产生趋势，进行相关回归分析，并计算相关系数（r）;计数资料采用χ 2 分析;以P<0.05评价数理统计差异的显著性。

2 结果

2.1 抗体产生情况 10例正常人双份血清的SARS病毒IgM和IgG抗体均呈阴性反应;43例SARS患者，SARS病毒的新近感染率为93.02%（40/43），其中34例（79.1%）检出IgM;37例（86.05%）检出IgG。SARS病毒IgG抗体的阳性率高于IgM抗体。结果显示，发病的同时机体便可检测到SARS抗体IgM，离起病时间最长（33天）的血清也能检测到，但也有患者发病第9、23及30天的第二份血清中的IgM由第一份的阳性转为阴性，说明SARS病毒IgM抗体产生及 消失在时间上个体差异较大。

2.2 SARS患者血清抗体产生规律 发病1～33天的43例患者双份血清抗SARS病毒抗体的结果显示第一周患者血清抗体阳性率较低，1周后迅速上升，10～15天达到第一个高峰。结果见图1及表1，对发病时间与抗体阳性率采用趋势分析，结果显示抗体阳性率随发病时间的增长而增大，其中IFA法IgM趋势分析γ=0.9391，P=0.018;IgM的趋势分析γ=0.9334，P=0.020。ELISA法IgM趋势分析γ=0.9348，P=0.020;IgM趋势分析γ=0.9232，P=0.025。

表1 发病时间与抗体阳性率的比较 （略）

2.3 抗体检测的最佳时间 由图1可见，发病10天后抗体出现1个高峰，以后一段时间内平稳上升，从表1可见发病10天前抗体阳性率较低，而10天后抗体的阳性率较高，且两者差异有显著性或非常显著性，表明两项抗体检测最好的时机应选择在患者发病后10天。

2.4 ELISA法与IFA法的比较 第一份血清IgM的阳性率IFA法高于ELISA法，第二位血清IgM的阳性率ELISA法高于IFA法，但两者差异均无显著性。见表2。ELISA法检测igg的阳性率明显高于IFA法。见表3。

表2 ELISA法与IFA法检测第一份和第二份血清igm抗体的比较 （略）注:第一份血清IgM抗体，χ 2 =1.324，P>0.05;第二份血清IgM抗体，χ 2 =2.386，P>0.05

表3 ELISA法与IFA法检测第一份和第二份血清IgG抗体的比较（略）注:第一份血清IgG抗体:χ 2 =7.155;P<0.01;第二份血清IgG抗体:χ 2 =8.155，P<0.01

3 讨论

SARS是本世纪初新发现传染病，严重威胁人类的健康，是继艾滋病后第二种可引起全球性流行的新发传染病。SARS冠状病毒（SARS-CoV），属于巢状病毒目（order:Nidovirales），冠状病毒科（Family:Coronaviridae），冠状病毒属（Genus:Coronavirus），属于单链正义RNA病毒［（+）sense，ss-RNA Virus］。在形态上与已知人类冠状病毒十分相似。SARS主要以发热、疼痛、起病急、进展快为临床特征，其潜伏期一般2～14天，平均（4.6±3.0）天 ［2］ 。其临床表现轻重不等，预后良好。IFA法能快速地检测SARS抗体，但该方法需特殊的仪器（荧光显微镜），对抗原片的质量要求较高，敏感度和特异性与操作者的经验有关。ELISA法操作简单，方便，结果判断主观影响不大，检测的敏感度较高，可应用于自动化操作系统，适合于基层医院使用。近2年，我院曾采用IFA和ELISA法，初步探讨了SARS患者血清抗体产生的规律，以及用于SARS的流行病学调查 ［3～6］ 。本项研究以SARS临床确诊病例及正常人群为调查对象，分别采用ELISA法和IFA法对患者双份血清分别测定SARS抗体IgG和IgM，结果显示，SARS患者发病早期血清SARS病毒IgG和IgM抗体阳性率较低，而在发病10天以后，血清SARS病毒IgG和IgM的阳性率较高，SARS发病时间与抗体IgG和IgM产生阳性率间趋势分析，均有显著相关性（r=0.9232～0.9348，P=0.018～0.025）。提示检查SARS病毒抗体IgG和IgM，适合于SARS患者发病10天后的血清学诊断指标，在利用此两项抗体的检测结果对疾病的诊断时应考虑检测时间对结果的影响。另外，检测血清IgM的阳性率，ELISA法和IFA法，两者差异均无显著性。而检测抗体IgG的阳性率，则ELISA法的灵敏度，明显高于IFA法。明确病原是SARS研究的一大突破。对患者体内血清抗体产生规律的研究为SARS实验室诊断及日后疫苗的免疫效果等方面提供了依据。但机体感染病毒至抗体的产生仍有一个窗口期，更敏感、准确的实验室诊断方法的建立仍有待探索。尽管科学家们对这种新病毒的来源进行了大量追踪研究，但其确切来源目前仍不清楚，其来源有以下三种可能:（1）一种早先存在于人体但不造成严重疾病的冠状病毒发生了基因变异，其毒性明显增强;（2）一种人冠状病毒和一种动物冠状病毒或另一种人冠状病毒发生遗传物质交换，产生新的基因重组体;（3）一种动物冠状病毒，跨越物种，从动物“跃迁”到人体。由于人类对其完全没有免疫力，所以显示出极高的致病性与传染性。如果SARS病毒潜藏于自然界中，这很可能意味着SARS将长期存在，在任何时候它都有可能从受侵袭地区传播到其他地方;它可能在一段时期消失，但也可能会周期性地出现感染人类。野生动物是自然疫源地中病原体的巨大天然储蓄库，因此，传染性疾病控制与预防必须从根本上切断从野生动物到人或禽畜的传播链。虽然SARS疫情得到了控制，但由于隐患依然存在，因此很多研究工作有待继续深入，特别是疫苗的研制和应用方面，它是控制SARS传播的主要措施。

参考文献

1 WHO.Update31-coronavirus never beforeseen in humans is the cause of SARS.April16，2003.

2 赵春惠，郭雁宾，吴昊，等，北京地区108例SARS患者临床特征、治疗效果及转归分析.中华医学杂志，2003，83:897-901.

3 李穗芬，谭奕洲，刘丽儿，等.广州某医院职工SARS病毒抗体的检测.生物技术通讯，2003，14（5）:467.

4 谭奕洲，唐漾波，刘丽儿，等.SAILS病毒抗体的检测及其应用.中华微生物学和免疫学杂志，2003，23（10）:317.

5 董惠卿，唐漾波，李穗芬，等.广州地区某医院职工SARS病毒抗体的检测及分析.广州医药，2004，35（1）:47-48.

6 谭奕洲，唐漾波，刘丽儿，等.SARS病毒抗体的检测及垂直传播追踪.临床检验杂志，2004，22（3）:191-192.