中成药木香顺气丸微生物限度检查方法的验证研究

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摘要：目的 建立中成药木香顺气丸微生物限度的检查方法，并对方法进行验证。方法 按照中国药典2010年版一部微生物限度的检查方法，采用常规法和培养基稀释法（0.5 ml/皿和0.2 ml/皿）进行试验。结果 根据回收率试验得出，细菌采用培养基稀释法（0.2 ml/皿）进行测定，霉菌和酵母菌采用常规法进行测定，控制菌采用常规法进行检查。结论 此方法可用于中成药木香顺气丸的微生物限度检查。

关键词：中成药；木香顺气丸；微生物限度；验证

Abstract：Objective To provide a method of the microbial limit test for proprietary chinese medicine Muxiangshunqi Pill and carry out the verification of the method test of method.Methods Routine method，medium dilution method（0.5ml/dish and 0.2ml/dish）were adopted for the test according to test methods of Chinese Pharmacopoeia 2010 edition of a microbial limit.Results Based on recovery test，the number of bacteria were tested by medium dilution method（0.2ml/dish），molds and yeasts were tested by routine method，and using the toutine method for the inspection of the control bacteria.Conclusion The method can be used for microbial limit for proprietary chinese medicine Muxiangshunqi Pill.

Key words：Proprietary chinese medicine；Muxiangshunqi Pill；Microbial limit；Validation

木香顺气丸是由木香、砂仁、香附、槟榔、甘草、陈皮、厚朴、枳壳、苍术、青皮等中药组成的复方制剂，主治行气化湿，健脾和胃，用于湿浊中阻、脾胃不和所致的胸膈痞闷、脘腹胀痛、呕吐恶心、嗳气纳呆。按照《中国药典》2010年版规定，在进行药品中微生物限度检查时，只有在该检验条件下的样品浓度不足以抑制污染微生物的生长时，才能使供试品中的微生物的得到真实反映，从而保证检验结果的科学性和准确 性[1]。对于具有抑菌作用的品种，必须采取一定的措施，如培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法或其中2种方法连用，消除其抑菌作用后，再进行检验，以保证方法的可靠性[2]。在进行木香顺气丸微生物限度检查时发现其具有一定的抑菌作用，故建立了木香顺气丸微生物限度检查方法，为该类品种制定微生物限度标准提供了科学依据。

1仪器与材料

1.1仪器MJ-Ⅱ 型霉菌培养箱（生产企业：上海一恒科技有限公司），SPX-150型生化培养箱（生产企业：上海金慧科电子有限公司），SPX-250B-Z型生化培养箱（生产企业：上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

1.2样品 木香顺气丸（陕西利君现代中药有限公司，规格：8袋/盒）。

1.3稀释液 0.9%无菌氯化钠溶液（用于菌液稀释）；pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（用于供试品制备）（按中国药典方法制备，高压蒸汽灭菌法灭菌）

1.4培养基 营养琼脂培养基（批号140807）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号140904）、胆盐乳糖培养基（批号140912）、MUG培养基（批号150413）、乳糖胆盐发酵培养基（批号150310）、改良马丁液体培养基（批号140905）、氯化钠蛋白胨缓冲液（批号141213）均由北京陆桥技术有限公司生产。

1.5阳性对照菌 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]均由陕西省食品药品检验所提供。

2方法

2.1菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌至营养琼脂培养基上，35℃培养24 h；接种白色念珠菌至改良马丁琼脂培养基上，25℃培养48 h，以上培养物均用0.9%无菌氯化钠溶液制成50～100 cfu/ml的菌悬液；接种黑曲霉菌至改良马丁琼脂斜面25℃培养5 d（用0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱孢子，标准管比浊），再将培养物用0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成50～100 cfu/ml的菌悬液。

2.2供试品溶液制备称取供试品10 g，研细，加稀释液100 ml，制备成1∶10供试液。

2.3常规法

2.3.1试验组 取1∶10供试液1 ml和试验菌50～100 cfu，采用常规法进行细菌、霉菌和酵母菌数的测定。

2.3.2菌液组 取试验菌液1 ml，采用常规法测定所加试验菌数。

2.3.3供试品对照组 取1∶10供试液1 ml注入平皿中，不加试验菌，倾注相应培养基，采用常规法测定供试品的本底菌数。

2.3.4回收率的计算 按如下方法计算试验组的加菌回收率。

首先，用试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数，然后用这个结果再除以菌液组的平均菌落数，最后再乘以100%，得到回收率结果[4]。

即：试验组菌回收率（%）=[（试验组菌数-供试品对照组菌数）/菌液组菌数]×100%

2.3.5结果 试验结果表明，试验组金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率均70%，可采用常规法进行霉菌和酵母菌数测定，见表1。

2.4培养基稀释法（0.5 ml/皿）

2.4.1取1∶10的供试液，采用0.5 ml/皿，分别加入试验菌金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌50～100 cfu，同常规法进行试验。

2.4.2回收率的计算：同常规法。

2.4.3结果 试验结果表明，实验组金黄色葡萄球菌的回收率>70%，可采用培养基稀释法（0.5 ml/皿）进行测定，验证方法通过；而试验组枯草芽孢杆菌的回收率

2.5培养基稀释法（0.2 ml/皿）

2.5.1取1∶10的供试液，采用0.2 ml/皿，加入试验菌枯草芽孢杆菌50～100 cfu，同常规法进行试验。

2.5.2回收率的计算：同常规法。

2.5.3结果 试验结果表明，实验组枯草芽孢杆菌的回收率>70%，可采用培养基稀释法（0.2 ml/皿）进行测定，验证方法通过，见表3。

2.6控制菌检查方法验证（常规法） 当建立产品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法是否适合于该药品的控制菌检查。验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。验证大肠埃希菌和大肠菌群时，采用的验证菌株都是大肠埃希菌。

2.6.1大肠埃希菌 试验组：取菌数回收率测定项下1∶10的供试液10 ml和大肠埃希菌试验菌液10～100 cfu，接种至100 ml的胆盐乳糖培养基中，依据大肠埃希菌检查法试验。阴性对照组：取稀释液10 ml加入到胆盐乳糖培养基100 ml中，依据大肠埃希菌检查法试验。

2.6.2大肠菌群 试验组：取菌数回收率测定项下1∶10的供试液1 ml和大肠埃希菌试验菌液10～100 cfu，加入到10 ml的乳糖胆盐发酵培养基管中，依据大肠菌群检查法试验。阴性对照组：取稀释液1 ml加入到10 ml乳糖胆盐发酵培养基管中，依据大肠菌群检查法试验。

2.6.3结果 试验结果表明，可采用常规法进行控制菌（大肠埃希菌和大肠菌群）的检查，见表4。

2.7结果 本品按照《中国药典》2010年版一部附录微生物限度检查法要求，进行方法学验证试验，结果可采用培养基稀释法（0.2 ml/皿）进行细菌菌数检查，可采用常规法法进行霉菌和酵母菌数检查；可采用常规法进行大肠埃希菌和大肠菌群的控制菌检查[5]。

3 讨论

由于中成药含有多种成分，其中任何成分具有抑菌作用，均可能影响微生物限度检查的准确性，常规法可用于无抑菌作用或抑菌作用弱的药物，而对抑菌作用较强的药物，可采用培养基稀释法减少药品中抑菌成分的数量，从而消除其对细菌、霉菌与酵母菌生长的影响[3]。因此药品在进行微生物限度检查前，要排除自身抑菌作用所带来的干扰，这样测出的结果才能可靠、有效。中成药木香顺气丸处方中所含有的木香、苍术、甘草、厚朴提取物对金黄色葡萄球菌都有明显的抑制作用[4-7]，苍术和厚朴提取物还对枯草芽孢杆菌有明显抑制作用[5，8]。而这几种中药材作为木香顺气丸的主要成分，其对微生物限度检查的影响有多大无法确定，故采用依次渐进的办法来确定最为合适的检查方法。从实验结果表明，木香顺气丸对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有一定的抑制作用，这与实验前对成分抑菌作用的分析一致，因此，在进行中成药微生物限度检测前，进行必要的成分分析，有一定的参考价值。

参考文献：

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[2]潘雯，关倩明，林玲，等.7种具有抑菌成分中成药的微生物限度检查方法验证[J].广东：广东药学院学报，2012，28（6）：623-627.

[3]闵红，闫晋晋，安凤秋，等.三种中药成方制剂微生物限度方法验证[J].安徽：安徽医药，2012，16（12）：1783-1785.

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[5]陈炎明，陈静，G桂新.苍术化学成分和药理活性研究进展[J].上海：上海中医药大学学报，2006，20（4）：95-97.

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[7]王承南，夏传格.厚朴药理作用及综合利用研究进展[J].湖南：经济林研究，2003，21（3）：80-81.

[8]王立青，江荣高，陈蕙芳.厚朴酚和厚朴酚药理作用的研究进展[J].天津：中草药，2005，36（10）：1591-1593.