湿热型溃疡性结肠炎造模方法的实验研究

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇湿热型溃疡性结肠炎造模方法的实验研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘要：目的：复制湿热型溃疡性结肠炎大鼠模型，探讨该模型的客观指标评价体系。方法：采用高脂高糖饮食造成湿热体质，用三硝基苯磺酸(7NBS)和乙醇混合液灌肠诱发湿热型溃疡性结肠炎，观察大鼠证候、结肠病理学改变及血清白介素－6(IL－6)。结果：模型大鼠出现粘液便、懒动、食欲减退等湿热证候，病理切片可见结肠粘膜出现明显溃疡、病理学评分有显著性差异(P＜0.01)，血清IL－6明显升高(P＜0.01)。结论：采用饮食加化学刺激法首次成功复制出湿热型溃疡性结肠炎的大鼠模型，并拟定证候、病理及免疫三大指标体系。可为临床和实验研究提供参考。

关键词：湿热证；溃疡性结肠炎；模型；白介素－6

中图分类号：R285.5　文献标识码：A

文章编号：1007－2349(2007)11－0037－03

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是临床引起腹泻的常见病和难治病，其辨证分型以湿热型最常见，但在该病的造模实验研究当中，目前只复制出肝郁脾虚和脾虚两种动物模型，尚未复制出最常见的湿热型动物模型，更未能建立该模型的客观指标评价体系。基于上述问题，本研究运用中医的病因病机理论及溃疡性结肠炎的西医发病机制学说，采用饮食加化学刺激的方法，首次成功复制出湿热型溃疡性结肠炎的大鼠模，并初步拟定了客观指标评价体系，为临床和实验研究提供成熟的动物模型。具体实验情况如下。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 实验动物 36只3月龄SPF级SD大鼠，雌雄各半，体重(200±20)购自广东实验动物中心，动物合格证编号：2006A027。

1．1．2 试剂及物品 三硝基苯磺酸由美国Sigma公司生产，批号：026K5006。大鼠血清IL－6(EIJSA法检测)试剂盒由美国California R&B公司生产。红星二锅头(酒精度为56°)为北京红星股份有限公司产品；蜂蜜由海南卓沣蜂业有限公司生产。

1．1．3 仪器 EPICS公司高速离心机(HERAEUS－1.0R)，电子天平为上海台之衡电子衡器有限公司产品，酶标仪由Bio－Tek公司生产。

1．2 造模方法 采用高脂高糖饮食加化学刺激法。随机选取9只大鼠为空白对照组，普通饲料喂养，自由饮水。其余27只为造模组(其中18只另分别作治疗和对照组，此文暂不讨论)，以普通饲料喂养为基础，自由饮用浓度为200s／L的蜜糖水，每日上午灌服猪油lOg／ks，约30min后再灌服56度白酒(红星二锅头)10ml／k8，共持续10天，以造成内因湿热模型；于造模第11天禁食24h，用3％戊巴比妥钠30rag／k8腹腔注射麻醉，予三硝基苯磺酸(TNBs)lOOmg／k8(约等于TNBs原液0.20ml／100g)加50％乙醇0.25ml，用直径约1.5mm的聚丙烯管插入上段约8cm后一次性注入上述混合试剂。造出湿热型溃疡性结肠炎大鼠模型。

1．3 观察指标

1．3．1 一般情况 泄泻程度、大便的性状、颜色、气味、精神状态、饮食量、毛发等，计算24h湿粪重量和记录体重。

1．3．2 评分 肉眼观察结肠组织形态学改变并按表1进行评分。

1．3．3 血清 IL－6检测。

1．3．4 病理切片 观察结肠病理改变。结果见表l。

1．4 标本处理和指标检测

1．4．1 血标本 造模后观察72h，确定模型稳定，用ELISA法检测空白及模型组大鼠血清IL－6含量，结果用ng／L表示。

1．4．2 结肠标本 颈椎脱臼处死大鼠，剖腹取距离约8cm结肠一段做HE染色。

1．4．3 粪便 用鼠笼收集大鼠24h湿粪，用电子天平称取湿粪重量。

1．5 统计方法 采用t检验。

2 结果

2．1 证候 湿热造模期间部分大鼠出现短时间站立不稳、呼吸加快的醉酒表现，饮食量和体重下降，且出现最具特征性的粘液便，常为两节粪便由一丝状粘液连结，不易拉断(图1)；粪便的颜色及秽味加深加重。灌肠造成溃疡性结肠炎模型后，大鼠腹泻明显，24h湿粪重量见表2。其中部分大鼠出现明显中毒性结肠扩张和肠粘连(图2及图3)。

2．2 病理学检查 模型组大鼠结肠粘膜出现明显充血水肿，可见多个溃疡灶，大量炎症细胞浸润，HE染色切片见图4，评分见表2。

2．3 免疫学检查 血清IL－6明显升高，见表2。

3 讨论

3．1 造模结果评价 IL－6是组织损伤后产生的一种重要细胞因子，具有免疫调节作用，它与炎症的发生发展有密切联系。在湿热证本质的研究中发现IL－6与湿热的发生存在重要关系，故本研究选取IL－6作为湿热的评价标准。大鼠出现丝状粘液便、懒动、食欲及体重下降等表现，符合中医理论“湿性粘滞、重浊、趋下”等特点。本研究发现造模后IL－6显著升高，且部分大鼠出现中毒性结肠扩张、肠粘连等UC的严重并发症，结合证候及病理学检查，证实湿热型溃疡性结肠炎的造模方法成功，且该模型稳定性理想。

3．2 造模方法概述及评价 1984年Morris采用三硝基苯磺酸(TNtks)与乙醇混合液灌肠成功复制出UC的大鼠模型，此方法后来被广泛参考和采用。当前UC的造模方法主要分4类：化学性刺激法，主要是用三硝基苯磺酸、葡聚糖硫酸钠、乙酸等灌肠造模，免疫学方法，主要有大鼠结肠细菌株模型、胎鼠结肠包埋法等；复合法，主要是将两种化学方法进行结合；中医方面的造模方法目前只复制出肝郁脾虚及脾虚两种证型的UC模型，尚未复制出最常见的湿热型UC模型，且上述研究均没有为特定证型的UC制定系统客观的指标评价标准体系。

3．3 湿热型溃疡性结肠炎模型的客观指标评价体系 该模型是西医疾病与特定中医证型结合起来的模型。故应“同时具备湿热证和溃疡性结肠炎的客观指标”。根据UC的免疫学发病机制。结合湿热证本质与免疫的关系，本研究拟定了以下湿热型UC的客观指标评价体系：

3．3．1 湿热证候指标 粪便出现明显粘液，黄色加深、味秽，排便次数增多且不易排尽而易粘附于肛周；食欲下降、懒动、毛发失荣、对刺激反应下降，体重减轻等。

3．3．2 病理学指标 病理切片和评分。

3．3．3 免疫学指标 如白介素、抗中性粒细胞抗体等。

3．4 本造模方法的细节及要点探讨

3．4．1　防止灌肠液流出 灌肠后肠腔压力增加且在麻醉状态下进行操作，处于松弛状态，所以拔管后灌肠液容易流出，故应该采取以下措施避免：拔管前后使大鼠处于头朝下、朝上的；缓慢拔管后，按压至少2min。

3．4．2 及其剂量选择 因为该实验要求动物术中无挣扎且在术后苏醒，故应选取起效快且作用时间不宜过长的。乌拉坦虽然起效快，但术后苏醒需要的时间过长，且麻醉过程中死亡率较高；乙醚起效快，但术中动物易苏醒不能配合手术。故3％戊巴比妥钠是最理想的麻药。术中发现若按0.1ml／100g的剂量，部分大鼠麻醉效果欠佳，追加到0.12ml／100g则麻醉效果理想，且动物可在术后3h内全部苏醒。