RP多糖体外抗乙型肝炎病毒作用研究
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摘要：目的 观察rp多糖在体外对HBV的抑制作用。方法 RP多糖设不同浓度组与HepG2.2.15细胞混合培养，同时设3-TC组和细胞对照组，采用CCK-8法检测药物对HepG2.2.15细胞的抑制作用，9d后通过ELISA法检测细胞培养液中的HBsAg、HBeAg含量，用FQ-PCR检测培养液中的HBV-DNA含量。结果 药物浓度在小于1mg/mL时无明显细胞毒性；在各稀释浓度对HBsAg、HBeAg的分泌具有一定抑制作用，最大抑制率分别为50.9%和44.2%；HBsAg、HBeAg的治疗指数分别大于14.66%、12.39%。药物可抑制HBV-DNA的复制（P
关键词：菲律宾蛤仔多糖；HepG2.2.15细胞株；乙型肝炎病毒
盛产于我国南北沿海的菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum，RP），又称杂色蛤、蛤蜊、花蛤，属软体动物门（Mollusca）、双壳纲（Bivalvia）、帘蛤科（Veneridae），广泛分布在近岸滩涂和浅海区。因它经济价值高，生长周期短，适应能力强，非常适合人工规模养殖，系我国传统养殖的四大贝类之一。菲律宾蛤仔肉味鲜美，营养丰富，除了食用，药用自古就有记载。宋朝掌禹锡《嘉本草》："润五脏，止消渴，开胃，解酒毒，主老癖能为寒热者，及妇人血块，煮食之。"《本草求原》："消水肿，利水，化痰，治崩带，瘿瘤，五痔。"其传统功效为：滋阴清热、安神定志、平肝潜阳、名目退翳、化痰止咳、软坚散结、收敛固涩、利尿通淋、制酸止痛、强壮滋补等[1]。国内外学者近年来的研究表明，其具有抗肿瘤、抗炎、增强免疫力、降压、降血脂、延缓衰老等药理作用[2]。因其药用功效显著且价廉易得，本文以RP提取的多糖为研究对象，探讨其体外抗乙型肝炎病毒作用。
1资料与方法
1.1药物 RP多糖（本实验室提取，将新鲜菲律宾蛤仔肉洗净后匀浆，超声波辅助热水浸提法、乙醇沉淀法提取多糖，经柱层析分离纯化后得粗提物，经莫立许反应和菲林反应鉴定，存在多糖成分，纯度约为82.5%[3]）。拉米夫定（3-TC），葛兰素史克公司生产。
1.2 HepG2.2.15细胞 中国科学技术大学生殖生物实验室惠赠。
1.3试剂 胰蛋白酶：GIBCO公司；DMEM干粉：GIBCO公司；L-谷氨酰胺：京科化学试剂公司；胎牛血清：GIBCO公司；HBsAg、HBeAg 抗原检测试剂盒：北京北方免疫试剂研究所；CCK-8试剂盒：北京伊普瑞斯公司；PCR试剂盒：华美生物工程公司；Chelex：Bio-Rad公司；HBV探针和引物：ABI公司；G-418：GIBCO公司。
1.4仪器 荧光定量PCR仪：Bio-Rad公司；振荡器：Bio-Rad公司；高速冷冻离心机：Eppendorf公司；酶标仪：Perkin-Elmer公司；倒置显微镜：OLYMPUS公司；CO2细胞培养箱：上海博迅实业有限公司；超净工作台：苏州3医药净化设备厂；多标记微孔板检测仪：Perkin-Elmer公司；多标记微孔板检测仪：Perkin Elmer公司；超低温冰箱：SANYO公司；细胞培养板（96/24孔）：Corning公司。
2方法
2.1 HepG2.2.15细胞株培养 取冻存的HepG2.2.15细胞，培养在DMEM培养基中（含0.03g/L L-谷氨酰胺、0.1g/L链霉素、100U/mL青霉素、10%胎牛血清、100mg/mL G-418，50g/L碳酸氢钠调pH值至7.2），置于细胞培养箱内（37℃、5%CO2），每2～3d更换培养液。观察细胞生长到70%～80%时，用胰蛋白酶（含EDTA）消化传代，每次换液时留取上清液，检测HBsAg、HBeAg和HBV-DNA水平，表达稳定后进行实验。
2.2细胞毒性实验 药物对HepG2.2.15细胞生长的抑制作用采用CCK-8（Cell Counting Kit-8）法[4]检测。方法：取1瓶生长良好的HepG2.2.15细胞，经胰酶消化后制成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度至每毫升2×104个，按100μL每孔加入96孔细胞培养板中，各浓度均3复孔。把培养板放入5%CO2、37℃培养箱中培养过夜，待贴壁。将上清吸去，加入含不同浓度RP多糖的DMEM培养基（梯度为10、1、0.1、0.01、0.001mg/mL），另设细胞对照组。5%CO2、37℃环境作用48h后，加入WST-8（10μL/孔），继续培养4h，待培养基由粉色变为稳定的橙色，用酶标仪检测各孔的OD450，每孔平行测定两次取均值，结果以均数±标准差（x±s）表示。计算细胞存活率和药物对细胞的半数毒性浓度TC50（按Reed -Muench法[5]计算），公示如下：
（OD1：药物处理组OD值，OD2：细胞对照组OD值，OD3：空白对照组OD值）
（其中 A=log>50%药物浓度，B=log
2.3药物对HBsAg、HbeAg的抑制作用 HepG2.2.15细胞经胰酶消化，制成单细胞悬液，按1mL每孔接种至24孔培养板（细胞浓度调至2×104个/mL），5%CO2、37℃环境培养。4d后取出培养板，吸去上清，以细胞毒性检测结果为参照，分别加入10-4、10-3、10-2、10-1、1mg/mL浓度的药物，另设细胞对照组、阳性药物组（拉米夫定）和培养液空白对照组，每组3孔。第3、6d更换新鲜的含药液培养，第9d收集各孔上清液，-20℃冻存待检。检测上清液中HBsAg、HBeAg含量用酶联免疫吸附测定法（ELISA），计算药物对抗原的抑制率，公式如下：
（OD1：药物处理组OD值，OD2：细胞对照组OD值，OD3：空白对照组OD值）
2.4 HBV-DNA定量检测 取备用的各孔细胞上清液，酚-氯仿抽提法提取HBV-DNA，荧光定量聚合酶链式反应（FQ-PCR）测定HBV-DNA的量。反应体系中加入以下试剂：模板1.0μl；Taq酶0.25μl；5×R-PCR Buffer 5.0μl；250mM Mg2+ 0.5μl；5 M探针1.2μ1；10 M引物1.0μl；10 M dNTP 0.75μl；补充ddH2O直到20μl。PCR扩增目的片段：115bp HBV基因区 p区 292 ～407。扩增引物：HBVFP：5'-TGT-CCT-GGT-TAT-CGC-TGG -3'和HBVRP：5'- CAA-ACG-GGC-AAC-ATA-CCT-T-3'。TaqMan探针序列：FAM-5'-TGT-GTC-TGC-GGC-GTT-TTA-TCA T-3'-TAMRA。95℃条件下样品预变性3.5min，之后94℃ 20s；60℃ 40s，共40个循环。在86℃检测激发荧光，用iCycler iQ 3.1分析数据。