STR-PCR半定量检测嵌合体方法在异基因造血干细胞移植中的应用

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[摘要] 目的:应用短串联重复序列-聚合酶链反应(str-pcr)半定量方法检测异基因造血干细胞移植后供者细胞比例并探讨其临床意义。方法：给30例接受移植的患者行移植后嵌合体检测,采集外周血提取DNA,对9个STR位点行聚合酶链反应扩增,扩增完成后行聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色显影,再计算嵌合率。结果：30例患者均检测到供者细胞,24例达到完全嵌合(CC),6例形成混合造血(MC)。在移植后14 d,稳定植入的患者多数表现为CC。CC组的aGVHD发生率高于MC组,7例患者在复发前检测到嵌合率(donor cell,DC)下降,经相应免疫治疗后有3例达到CC。结论：监测异基因造血干细胞移植后嵌合率的动态变化过程,PCR-STR是一种简单经济的方法,可根据嵌合状态指导个体化免疫治疗,对患者的长期存活有重要意义。

［关键词］ 短串联重复序列-聚合酶链反应； 异基因造血干细胞移植； 嵌合体分析

［中图分类号］ R733.7; R730.54 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1671-7256(2011)02-0138-04

doi：10.3969/j.issn.1671-7256.2011．02.005

Semi-quantitative analysis of chimerism after allogeneic

stem cell transplantation using STR-PCR

LIU Jing, DING Jia-hua

(Department of Hematology, Zhongda Hospital, Southeast University， Nanjing 210009, China)

［Abstract］ Objective: To investigate the value of semi-quantitative analysis of the ratio of donor cells after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation(allo-HSCT) using short tandem repeat-polymerase chain reaction (STR-PCR). Methods： Among 30 patients receiving allo-HSCT were evaluated, DNA was extracted from peripheral blood and nine STR loci were amplified followed by polyacrylamide gels, silver staining,and then the engomphosis rates were calculated. Results: Donor cells could be detected from all of 30 cases, 24 cases formed complete chimerism(CC) and 6 cases formed mixed chimerism(MC). Most patients with stable engraftments showed CC on day+14. The incidence of aGVHD in group CC was significantly higher than that in group MC. Before the time of relapse, STR-PCR indicated a decrease of donor cell(DC) in 7 patients, and 3 cases were of complete chimerism by corresponding immunotherapy. Conclusions： STR-PCR provide a simple and economic approach for monitoring the dynamic process of donor chimerism. Individual immunotherapy based on chimerism is important for patient long time survial．

［Key words］ short tandem repeat-polymerase chain reaction; allogeneic hematopoietic stem cell transplantation; analysis of chimerism

异基因造血干细胞移植现今已经成为临床上各种恶性及非恶性血液病治疗的一项重要措施,供者细胞植入受者体内后供者细胞及受者细胞含量情况是动态变化的,需要进行动态的检测。检测结果有助于判断移植是否成功,及预测移植物抗宿主病的发生与疾病的复发,并指导下一步免疫干预治疗的应用［1］。短串联重复序列(STR)是由2～6个碱基对组成的一种遗传标记,已在移植后嵌合体检测中广泛使用。传统的STR-PCR检测方法敏感性多大于5%,但当供受者性别相同时,无法计算供者细胞的嵌合率。我们对30例接受异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的患者进行了动态嵌合体的监测,根据嵌合结果,为患者的临床治疗和预后提供依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2008年至2010年在东南大学附属中大医院血液科接受allo-HSCT的患者30例中,男18例,女12例；年龄8～53岁(中位年龄25岁)。其中急性非淋巴细胞白血病5例,急性淋巴细胞白血病10例,慢性淋巴细胞白血病1例,急性粒细胞白血病2例,慢性粒细胞白血病4例,多发性骨髓瘤1例,骨髓增生异常综合征3例,再生障碍性贫血3例,免疫性血小板减少1例。同胞供者12例,无血缘关系供者18例。HLA配型全相合的20例,半相合的10例。供、受者性别相合的11例,性别不和的19例。ABO血型相合14例,血型不合16例。

1.2 预处理方案及移植物抗宿主病（GVHD）的防治

预处理用改良的Bu/CY预处理方案,即阿糖胞苷、白消安、环磷酰胺、司莫司汀和抗胸腺细胞球蛋白。GVHD预防采用环孢霉素A、麦考酚酸酯和短程甲氨蝶呤方案。

1.3 标本的收集和处理

在干细胞移植前采集供者和受者外周血1～2 ml,移植术后14 d、28 d采集患者外周血,此后每月或每3月采集1次。若行供体淋巴细胞输注(DLI)治疗,之后每15 d采集受者外周血1次。采血后先裂解红细胞,提取白细胞,再将3 μl血样加入1 ml双蒸水,振荡充分混匀后,以12 000 r•min-1转速离心3 min,弃上清。再加入5%的Chele-x-100 200 μl,水浴箱中56 ℃水浴30 min,振荡混匀,100 ℃孵育10 min,振荡15 s,以12 000 r•min-1离心3 min,取上清液4 ℃保存备用于聚合酶链反应［2］。

1.4 聚合酶链反应扩增

以上个步骤提取的DNA为模板,对9个STR基因座(D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、D3S1358、vWA、FGA)进行扩增。反应体系20 μl，包含反应缓冲液2 μl,Taq酶1 μl,2.5 mmol•L-1 dNTPs 1.6 μl,上、下游引物混合液2.0 μl,模板DNA 8 μl,蒸馏水5.4 μl。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s,56 ℃退火50 s,72 ℃延伸50 s,共30个循环；72℃终末延伸5 min。

1.5 扩增产物的检测

扩增完成后,行非连续非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色显影。第一步先定性分析：根据等位基因阶梯(ladder)对照阅读各位点的基因型,找出各组供、受体可区分彼此的有信息位点,并选择出Ⅰ类和Ⅱ类位点进行下一步嵌合率计算［3］。第二步定量分析：电泳后的凝胶用UVP成像分析系统进行灰度扫描,再用Gel-Pro4.0软件进行片段分析,选择以下相应的公式计算供体细胞嵌合率(DC)［4-5］。

Ⅰ. a供、受者均为纯合子(没有相同的条带)：DC=D/(R+D)；

Ⅰ. b供、受者均为杂合子(没有相同的条带)：DC=(D1+D2)/(R1+R2+D1+D2)；

Ⅰ. c受者为杂合子,供者为纯合子(没有相同的条带)：DC=D/(R1+R2+D)；

Ⅰ. d受者为纯合子,供者为杂合子(没有相同的条带)：DC=(D1+D2)/(R+D1+D2)；

Ⅱ. 供、受者均为杂合子(有1条带相同)：DC=D/(R+D);

D为供者特异性条带的整合光密度比值,R为受者特异性条带的整合光密度比值。

1.6 嵌合体的界定

完全嵌合体(CC)：DC>95%;混合嵌合体(MC)：5%

2 结 果

2.1 移植后1个月内嵌合体检测情况

移植1个月后,30例患者均形成不同比例的供、受者造血细胞嵌合体,其中24例形成CC,6例形成MC；5例形成高比例混合嵌合(HMC)；1例低比例混合嵌合(LMC)。所有稳定植入的患者在移植后14 d多数病例达CC,平均嵌合率是95.88%。

2.2 嵌合体的动态监测

移植后随访2.5个月到24个月,平均12个月。24例CC患者中只有1例患者在移植后15个月后复发,间隔1个月检查1次嵌合状态,患者DC呈进行性下降,最终疾病复发,治疗无效死亡。另23例此后一直维持CC。6例MC患者中,1例LMC的MDS患者在移植后1个月时,只在2个位点检测到少量的供者型遗传标记,移植后3个月时就完全为受者型遗传标志了。5例HMC患者中3例早期出现DC进行性下降,其中2例经治疗后逐渐转为CC,另1例最终治疗无效死亡。另2例在1年后由CC转为MC,其中1例行二次移植后获得CC,另1例因感染死亡。

2.3 GVHD的发生

30例患者中,有20例患者发生了急性移植物抗宿主病(aGVHD)。其中CC组24例中有18例发生,Ⅰ~Ⅱ级13例,Ⅲ~Ⅳ级5例。MC组6例中2例发生aGVHD,Ⅱ级2例,Ⅲ-Ⅳ级1例。

2.4 嵌合体和临床干预治疗

在24例CC患者中的1例复发患者,由于供者淋巴细胞来源困难,未能行DLI,仅停用免疫抑制剂,治疗无效死亡。1例LMC的患者,行DLI后,患者出现严重的GVHD及感染,最终死亡。HMC患者中3例早期出现DC进行性下降,1例在行DLI后嵌合转为CC；另1例有脾肿大,骨髓增生明显活跃,诊断为脾功能亢进,后行切脾治疗,嵌合转为CC；另1例行DLI后嵌合维持MC,治疗无效死亡。HMC患者中另2例在1年后由CC转为MC,其中1例行2次移植,移植后出现aGVHD,经治疗后好转；另1例行DLI后出现严重的粒细胞缺少,感染无法控制而死亡。

3 讨 论

我们对异基因造血干细胞移植后患者嵌合状态的检测有助于判断供者细胞植入情况、预测复发及免疫排斥、GVHD发生［3,6］。近来已经有许多检测嵌合的方法,荧光原位杂交(FISH)是一种敏感性较高的方法,但是此方法只能用在供受者性别不相同的情况下［7］。

可变数目串联重复序列-聚合酶链反应(VNTR-PCR)及STR-PCR是比较常用的方法,不受性别、HLA配型等因素影响,STR-PCR比VNTR-PCR更敏感,更高效［8］。

STR位点分布情况存在人群、地区差异性,我们选择D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、D3S1358、vWA、FGA 9个位点。这几个位点错配较少,有较高的个体识别能力,易于分型而且等位基因频率在研究人群所属江苏地区分布较好［9-10］。荧光标记的多重PCR结合测序仪和基因扫描软件程序检测嵌合体虽然也能定量分析嵌合体并且自动化程度高,但其敏感性较单一位点STR-PCR方法低,而且费用贵。我们采用的STR-PCR结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色以及凝胶成像分析技术检测嵌合体的方法，在长期监测的后期只需筛选出敏感性高的位点扩增即可,简便易行,费用也比较便宜［11］。

本研究发现，移植后30 d能达到达到CC的患者在此后的存活过程中维持CC的概率比30 d后为MC的患者大,且此后MC患者的DC也不稳定。也有研究［1］发现,移植后14 d是否能达到CC也是十分重要的,达不到的患者发生早期的免疫移植排斥的可能性大。可见,我们应该加强早期的移植后患者嵌合率的监测,并及时采取措施。对处于MC患者,免疫抑制剂的减量或停用是使其获得CC的一项措施,应该加强嵌合状态的动态检测。一旦回到CC,应考虑恢复使用免疫抑制剂,防止GVHD的发生。如果停用免疫抑制剂未能逆转供者细胞消退,应考虑作DLI治疗。对DLI后供者嵌合率无明显回升的患者,早期可联合使用能增强移植物抗白血病效应的细胞因子。本组中1例ALL的患者1年后复发,行二次移植后获得CC并长期存活,可见二次移植也是一项重新获得CC的有效治疗措施。

本研究CC组的aGVHD发生率高于MC组(P90%的患者的GVHD发生率明显比DC

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