蜂胶提取物在大鼠体内组织分布研究

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摘 要：研究蜂胶提取物在大鼠体内的组织分布规律。蜂胶提取物以1.8 g/kg大鼠灌胃给药后，用HPI.C-UV法测定心、肝、脾、肺、肾中咖啡酸，香豆酸，阿魏酸，异阿魏酸和3，4-=甲氧基肉桂酸的含量。色谱柱Zorbax Extend-C1s （250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为（A）甲醇-（B）0.2%（（p cHAc））冰醋酸水溶液梯度洗脱；柱温：35℃；检测波长：320 nm；进样量：10 μL；流速：1.O mL/min。建立了五种酚酸类成分在大鼠心、肝、脾、肺、肾中的HPLC含量测定方法。该方法简便、快速、重复性好，适用于大鼠灌胃蜂胶提取物后，酚酸类成分的体内组织分布研究。

关键词：蜂胶乙醇提取物；酚酸；HPLC；组织分布

中图分类号：R962

文献标志码：A

文章编号：0367-6358（2015）05-0290-04

蜂胶是工蜂从植物的新生支条、叶、芽或树皮等组织上采集到树脂状分泌物后混入其上颚腺等腺体的分泌物和蜂蜡等加工而成的芳香性胶状物，含有与胶源植物相类似的大量有效成分。收载于2010版《中国药典》一部，常用中药材，味苦、辛、寒。具有抗菌消炎、调节免疫、抗氧化、加速组织愈合的活性。用于高血脂症和糖尿病的辅助治疗。蜂胶具有悠久的药用历史，现代药理研究表明，蜂胶具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗炎症、抗溃疡、抗肿瘤、保肝、局部麻醉、免疫调节、清除自由基等生理作用。

黄酮和酚酸类成分是蜂胶中的主要成分，具有抗炎、抗氧化等明确、良好的药理活性。对于蜂胶的体内代谢研究主要集中在对黄酮类成分以及咖啡酸苯乙基酯（CAPE）上，目前还没有对蜂胶中酚酸类成分组织分布的相关报道。为研究蜂胶在大鼠体内的组织分布规律，单剂量1.8 g/kg大鼠灌胃蜂胶醇提取物后，建立了咖啡酸，香豆酸，阿魏酸，异阿魏酸和3，4-二甲氧基肉桂酸五种酚酸类成分在大鼠心、肝、睥、肺、肾中的HPLC含量测定方法，测定了其在五个脏器中的分布经时变化。

l 仪器材料与方法

Agilent 1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；2-16K型冷冻高速离心机（德国Sigma公司）；HCG-36A氮吹仪（东莞市永先电子仪器厂）；BT25S型电子天平（德国Sardoris公司）；MS-I型涡旋混合器、T-18型内切式组织匀浆机（广州仪科实验室技术有限公司）。标准品：咖啡酸、香豆酸、阿魏酸、异阿魏酸和3，4-二甲氧基肉桂酸为作者从原蜂胶中分离得到，纯度均大于98%；替硝唑（中国药品生物制品检定所）；甲醇（色谱级）、乙酸乙酯（分析纯）、甲醇均购自国药集团化学试剂有限公司，冰醋酸（色谱级）购自美国TEDIA公司；纯净水由Milli-Q纯水制备系统制备。

原蜂胶药材购自河南省长葛县，药材经上海药物所鉴定为蜂胶。

蜂胶乙醇提取物的提取过程为：干燥蜂胶药材粉碎后用95%乙醇提取完全后，石油醚脱脂，乙酸乙酯萃取至颜色不再加深为止，减压浓缩后真空干燥，即得。经HPLC检测其中含有咖啡酸22.9mg/g，香豆酸9.O mg/g，阿魏酸4.2 mg/g，异阿魏酸13.3 mg/g和3，4二甲氧基肉桂酸37 mg/g。蜂胶醇提物用含水25%的1，2一丙二醇分散，得浓度为0.36 g/ml_的混悬液，以1.8 g/kg的剂量大鼠灌胃。

2 结果与讨论

2.1 组织样品预处理

取大鼠心、肝、脾、肺、肾脏器，生理盐水洗净，滤纸吸干水分，分别准确称取各脏器组织0.2g，加入500 μL生理盐水，于10mL具塞离心试管中，在冰浴上制备组织匀浆。依次移取内标替硝唑溶液（21μg/mL）100μL，0.2mol/L盐酸水溶液100 μL，乙酸乙酯萃取液3 mL，涡旋，15℃，4000 r/min离心10min，分取上清液，氮气吹干，残渣加入含水20%的甲醇水溶液200μL，涡旋溶解60s，0.22μm微孑L滤膜过滤，取续滤液10 μL注入高效液相色谱仪，记录。

2.2 对照品溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备

分别精确称取对照品咖啡酸、香豆酸、阿魏酸、异阿魏酸和3，4-二甲氧基肉桂酸适量，放置于5mL容量瓶中，用含水20%的甲醇溶液溶解并定容至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液，再依次精密量取储备液，稀释成系列标准样品溶液，浓度范围依次为1.96～98.00 μg/mL，1.02～50.80 μg/mL，0.98～48.80 μg/mL，1.01～50.40 μg/mL和1.03～51.20μg/mL。对照品溶液储存于4℃，备用。

2.2.2

QC样品的制备

分别取空白组织在冰浴上制备组织匀浆，加入对照品溶液100 Lμ，制备成含被测物高、中、低三个浓度的质量控制样品（quality control samples，QCS），即咖啡酸（7.80，3.92，0.78 μg/mL），香豆酸（4.08，2.04，0.41 μg/ml_），阿魏酸（3.92，1.96，0.39 μg/mL），异阿魏酸（4.04，2.02，0.40μg/mL）和3，4-二甲氧基肉桂酸（4.08，2.06，0.41μg/mL），储存于-70℃，备用。

2.3 HPLC条件

Zorbax Extend-CI8色谱柱（250 mm×4.6mm，5μm）、Zorbax Extend-C18保护柱（20 mm×4mm，5μm）；流动相为（A）甲醇-（B）0.2%冰醋酸水溶液梯度洗脱：0～16min：A 17%升至23%，B83%降至77%； 16～18min：A 23%升至25%，B77%降至75%；18～30min：A 25%升至40%，B75%降至60%；30～40min：A 40%升至60%，B60%降至40%；柱温：35℃；检测波长：320 nm；进样量：10 μL：流速：1.O mL/min。

2.4 方法学考察

2.4.1 方法的专属性

将动物空白组织的色谱图，与空白组织中加入待测物和内标物后的色谱图，以及给药后不同时间点的大鼠组织色谱图进行比较，结果表明待测物和内标物的测定不受组织中内源性物质的干扰，并具有良好的峰形。色谱图见图1。

2.4.2 标准工作曲线的绘制

分别取空白组织，加入系列标准样品溶液100μL，内标替硝唑溶液100 μL后，按照“2.1”项下方法操作，每个样品测定4次。用加权最小二乘法进行回归运算，以被测物与内标物峰面积比值为纵坐标（y），被测物浓度为横坐标（T），得直线回归方程，权重系数为l/X2。被测物在标准曲线范围内呈良好线性（r2>0.99），结果见表1。

2.4.4 精密度和准确度

取低、中、高三个浓度的质量控制样品，每一浓度进行6样本分析，并与标准工作曲线同时进行，以当日的标准工作曲线计算样品的浓度，求得方法的精密度和准确度，结果显示，日内、日间精密度RSD

2.4.5 绝对回收率

取高、中、低三个浓度的质控样品各3份，按“2.1”项下方法操作，3种浓度下的提取回收率均大于70%，说明该萃取方法可靠稳定。

2.4.6 组织样品的稳定性

高、低浓度的质控样品分别进行制备后24h、置于室温4h、以及3个冻融周期测定，每个浓度质控样品各3份。实验结果显示，稳定性RSD均小于15%，表明组织中的5个被测物能被准确测定。

2.5 组织分布研究

2.5.1 组织样品的采集和预处理

取Wistar雌性大鼠66只，随机分成11组，每组6只。大鼠灌胃蜂胶乙醇提取物后，分别于5、10、20、30、60、240、480、720min处死，收集心、肝、脾、肺、肾等组织，保存在-70℃下，按“2.1”项下处理组织样品，进行HPLC分析。

2.5.2 组织分布分析结果

大鼠灌胃蜂胶乙醇提取物后（1.8 g/kg），分别测定五个酚酸类成分在心、肝、脾、肺、肾组织中8个时间点的分布经时变化。各组织中5个化合物的经时变化见图2。

3 结论

结果表明，5个被测物在给药5～720min的8个时间点中，应用该方法在心、肝、脾、肺、肾组织中绝大部分可被检出，说明其在组织中分布广泛，且与组织有较高的亲和性。图2比较了大鼠灌胃蜂胶乙醇提取物后主要酚酸类化合物在各组织中的平均药时曲线，结果表明，咖啡酸在各组织中的浓度最高，尤其在肺中，给药10min后达到含量的峰值，之后缓慢消除，并且在720min仍然能检测到。而其他4个指标成分几乎均在给药30min时脾脏中浓度最高，之后消除缓慢，提示其作用部位可能在脾脏。同时，五种成分在大鼠组织内的经时分布曲线基本相似，几乎均含有双峰现象，提示可能由肝肠循环引起。