乙酰胆碱酯酶在尼龙网上的固定化研究
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摘要：以尼龙网为全体，分刺用硫酸二甲酯和三乙基肟四氟化硼作烷基化试剂使尼龙网活化。然后将尼龙网浸入一定浓度的乙酰胆碱酯酶溶液中，置于4℃条件下进行固定化，获得了较好的固定化效果，醇膜活性分刺达到4.2 U／cm2和11.1 U／cm2，固定化效率分别达到24.2％和64.1％。重现性好，稳定性好，5个月后活性无明显下降。
关键词：乙酰胆碱酯酶；固定化；醇片；生物传感器
中图分类号：Q 814.2
文献标识码：A
文章编号：0367-6358(2007)12-751-04
作者简介：周租新(1963－)，男，上海人，硕士，副教授，主要从事化学传感器和生物传感器的研究。
有机磷农药和氨基甲酸酯类农药杀灭害虫的机理是利用该农药抑制生物体中乙酰胆碱酯酶的活性，使酶活性减弱或失去催化水解乙酰胆碱的功能，从而将害虫致死。利用这一特性，可将乙酰胆碱酯酶固定后制成酵传感器，用于检测水体，土壤和果蔬中的农药残留。对乙酰胆碱酵酶传感器而言，酶的固定化是其制作的关键技术，它决定着酶传感器的灵敏度，稳定性和选择性及有无实用价值。
酶的固定化方法主要有吸附法，包埋法，交联法和共价法。用吸附法或包埋法等物理方法固定酶，活性较高，但在测定过程中酶易泄露，流失，稳定性差；用戊二醛交联法由于试剂对酶的损害作用，固定化酶的活性较低，本文以尼龙网为载体，采用共价键法固定酶，使酶既保持较高的活性，又有很好的稳定性。
1 实验部分
1.1仪器和试剂
722型分光光度计(上海棱光分析仪器厂)；PHS-3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂)；79-2型磁力搅拌器(金坛市科析仪器有限公司)；尼龙网(100目)，上海吴淞筛网厂；乙酰胆碱酯酶(Ec3.1.17)取自电鳗，活力为695 U／rag，Fluka公司；碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)，Fluka公司；硫酸二甲酯(DMS)(提纯)上硫化工股份有限公司，5，5.双二硫代(2.硝基)苯甲酸(DTNB)。磷酸氢二钠磷酸二氢钠，环氧氯丙烷。三氟化硼乙醚溶液(均为分析纯)，国药集团。
1.2实验方法
1.2.1载体的处理
(1)以硫酸二甲酯作烷基化试剂
取一面积约为12 mm×12 him的尼龙网，在75aC烘箱中活化5 rain后，于室温下浸入硫酸二甲酯中反应3 min，将尼龙网迅速取出放入无水甲醇中浸30 B，另换甲醇再浸30 8。晾干后在室温下，将此尼龙网与0.5 moL／L赖氨酸反应4 h。用0.2 mol／L NaCl溶液洗去尼龙网上残留的赖氨酸后，将此尼龙网放入12.5％戊二醛水溶液中反应40 mill，取出后将此尼龙网用0.2 tooL／L NaCI溶液清洗数次，抽干。
(2)以三乙基肟四氟化硼作烷基化试剂
在46℃时，将500 mL 10％(质量分数)环氧氯丙烷干乙醚液慢慢滴加到200 mL 5％(质量分数)三氟化硼干乙醚溶液中，同时搅拌，回流1 h后，常温下再搅拌3 h，即生成三乙基肟四氟化硼沉淀。用干乙醚洗涤沉淀3次，每次用量30 mL，然后按10％比例将沉淀溶3氯甲烷中，待用。
室温下将尼龙网浸在0.5 mol／L HCl溶液中活化30 min，取出后用蒸馏水冲至洗出液呈中性。将此尼龙网浸入新鲜合成的10％(质量分数)三乙基肟四氟化硼二氯甲烷溶液中，反应7 min后，依次用二氯甲烷和二氧六环各清洗2 min，随即在室温下与10％(质量分数)已二胺甲醇溶液反应3 h，之后用蒸馏水将尼龙网清洗13 h，吸干，再用无水甲醇清洗尼龙网约15 min，最后尼龙网与5％(质量分数)戊二醛溶液反应30 min后，用无水乙醇清洗尼龙网数次，抽干。
1.2.2乙酰胆碱酯酶的固定化
在4℃下，将预处理过的尼龙网浸入一定量的乙酰胆碱酯酶溶液中，置于冰箱内若干小时进行固定化。取出后依次用0.2 mol／L的甘氨酸、0.2 moltL NaCI溶液和0.1 mol／L磷酸盐缓冲液(pH=7.0)清洗网膜，即得固定化酶膜。将此固定化酶膜浸在0.1 mol／L磷酸盐缓冲液(pH=7.0)中于4℃下保存。
1.2.3乙酰胆碱酯酶的活性测定
(1)非固定化酶的活性测定
参照EllmantSj的方法，稍作修改：在1 cm比色皿内，准确加入3.0 mL磷酸盐缓冲液(0.1 moL／L，pH=8.0)和20酶液(5 U／mL)，混匀片刻，再依次加入100DTNB溶液(终浓度为1.0 mmol／L)和20ATCh溶液(终浓度为1.0 mmoL／L)，迅速混匀。在412 nm处，每隔15 s读取吸光度数值，连续测定3～5 mln。第一支比色皿不加ATCh，作为空白调零。根据1 min内的吸光度变化值来计算酶的活力，计算公式如下： 酶活力U(pmol／min)=v x A×50／(k×l)(1)式中：A-吸光度随时间的变化率(1／min)，即一分钟内吸光度的变化值；
k-消光系数(L／retool／ram)，k=1.36；
测定酶活力时溶液的光径长度，即比色皿光程(mill)，L=10；
V-反应体系的总体积(mL)，v=3.14；
50-体积换算系数。
(2)固定化酶的活性测定
按上述的测定方法，稍作改动：在1 cm比色皿内，准确加入3.02 mL磷酸盐缓冲液(0.1 mol／L，pH=8.0)和固定化酶片，再加入100止DTNB溶液(终浓度为1.0 mmol／L)，待溶液混匀、稳定后，将此溶液作为空白调零。随即加20 pL ATCh溶液(终浓度为1.0 mmol／L)后，迅速使反应体系充分混匀后，取出酶膜，在412 nm处，读取吸光度值，再将酶膜放回比色皿中，继续反应。用相同方法混匀该反应体系。按此操作，每隔l min读取吸光度值，连续测定4 min，测定出固定化酶膜的酶活力值计算方法同非固定化酶的活性测定。
2 结果与讨论
2.1载体处理试剂的选择
较简便的烷基化试剂常用硫酸二甲酯，但它有较大的毒性；而三乙基肟四氟化硼制备有一定难度。但毒性小，本文分别用这两种烷基化试剂处理尼龙网。三乙基肟四氟化硼处理的尼龙网固定酶达到11.1 U／cm2(实验所用12mmx 12 mm的尼龙网膜活性为16.1 u，换算成单位面积活性为11.1 U／cm2,下同)，固定化效率为64.1％(在5 mL浓度为10 U／mL。总活性为50 u的酶溶液中，放入两片12 mx12mm的尼龙网，固定在尼龙网膜上的酶为32.2u)；而用硫酸二甲酯处理的尼龙网能周定酶为4.2U／cn2，固定化效率为24.2％。十分明显，用三乙基肟四氟化硼作烷基化试剂的效果要好得多。因此后面的实验数据均来自用三乙基肟四氟化硼作烷基化
试剂所制酶膜。
2.2固定化条件的选择
2.2.1酶浓度的选择
酶用量的多少对酶膜的活性有很大的影响，用量大，成本太高；用量少，酶膜活性低，响应灵敏度低，无法做成传感器。通过测试发现，用10 U／mL的酶液(5 mL)，能得到最好的固定效果(见表1)。
2.2.2固定化时间的选择
固定化时间对固定化效率有影响。若时间太短，酶未充分键合上去，酶膜活性低，时间过长，不仅费时多，还有可能损失酶。我们分别用2，4，8，16，24h固定酶，结果见表2。
表2表明，固定化时间为2，4 h时，酶膜活性不高，8 h时活性已很高，16，24 h基本不变，故固定化时间选择8 h较为合适。
2.2.3固定化温度的选择
酶与载体的键合及酶本身的活性均与温度有较大关系，本文分别选择4，25，400c条件下进行固定化实验，结果见表3。
表3表明，在4℃时活性最高，25ac时活性较低，400c基本无活性，故选择40c作为固定化温度。
2.2.4固定化时搅拌或不搅拌的比较
一般的化学反应，若搅拌会使反应速率加快，反应充分。在进行酶固定化时，分别用搅拌与不搅拌的方法固定酶，结果发现，搅拌时酶膜活性为7.2U／c12，不搅拌时活性为10.9 U／err12，可见，不搅拌时酶膜活性更高，可能是由于吸附作用，在膜周围酶浓度较高，而搅拌后，酶浓度趋于平均，影响了酶与膜片的键合。
2.3固定化酶膜的性能
2.3.1固定化酶膜的活性及重现性
按1.2.2确定的最佳固定化条件进行酶片的制备试验，同一批次及不同批次制备的固定化酶活力测定结果见表4(酶活力值根据公式(1)计算而得)。
分析表4数据可得平均偏差为：0.96％-3.31％。表示重现性良好。
2.3.2固定化酶膜催化底物的重现性
由表5可见，固定化条件制得酶膜后，按1.2.3方法连续测定10次。酶片活力降低了7.75％；而在前6次测定中，酶片较稳定，仅在第7次以后活力逐渐下降，说明在无抑制剂存在时。固定化酶片都可连续使用至少6次。
2.4固定化酶膜的储存稳定性
2.4.1存放介质对固定化酶活力稳定性的影响
控制酶固定化过程的其它条件一致，分别将固定后的酶膜置于4℃下、pH 7.0的磷酸盐缓冲液中(浓度0.1 moFL)于40c下干保存。5 d后。经酶活力测定后，发现干保存的酶膜活性为0.76 U／em2，明显有较大幅度降低，而湿保存的酶膜活性为9.9 U／cm2，仍保持较高的活力，故用磷酸盐缓冲液保存。
2.4.2 pH值不同缓冲液对酶膜括垭的影响
将制得的酶片置于不同pH值的0.1 mol／L磷酸盐缓冲溶液中贮存，5个月后，测定其活力。结果见表6。
由表6可知，相同条件下固定的酶膜在pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中贮存5个月，仍能保持较大的酶活力。综上所述，固定化的酶膜置于4℃下、pH=7.O的磷酸盐缓冲液中贮存最为妥当。
2.4.3固定化酶膜的储存稳定性
置于4℃,0.1 mo]／L，pH7.0磷酸盐缓冲溶液中保存最稳定。酶固定化后将酶膜置于该条件下保存,我们分别于固定后第一天、隔一周、隔三周测定其残余活力。酶活力铡定结果见表7。
由表7可知，酶膜性能稳定，由每日损失率推算，1号，2号酶膜在最佳贮存条件下至少可保存72d，并且仍能维持80％酶活力，符合制各生物传感器的要求。
3 结论
研究表明，本文制备的酶膜，表现出高催化活力、高稳定性、使用寿命长，重现性好等良好的性能。酶膜经较长时间使用后仍保持90％以上的酶活性、在最佳贮存条件下保存7周后。仍维持80％的酶活力，从而有效地提高了酶的使用价90g，rap85.5℃，随后环化后mpl74―175℃。