苯酚硫酸法测定黄芪中多糖含量

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摘要：

目的：采用苯酚硫酸法测定黄芪多糖含量的方法及效果评价。方法：运用苯酚硫酸法评价黄芪多糖测定的重复性、稳定性和回收率。结果：该方法重复性强，RSD为2.53%；稳定性好，在显色反应可维持4h以上，RSD为3.3%；回收率高，RSD为1.78%。黄芪中多糖的含量为59.8%。结论：本法具有省时省力、重复性强、稳定性好和回收率高等优势，适用于黄芪多糖的含量测定。

关键词：苯酚硫酸法；黄芪；多糖含量；测定

【中图分类号】

R97 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）08-0014-01

黄芪为豆科紫云属膜荚黄芪（Astragalus membranceus Fisch Bge）或蒙古黄芪（Amongholicus Bge）的干燥根，作为临床常用的一种中药，其不仅在补气固表、生津养血、利尿消肿、托毒排脓等方面具有良好的功效，还被广泛应用于兽药及动物饲料添加剂中[1]。研究表明，黄芪中含有皂苷、黄酮、多糖、氨基酸等多种成分，其中黄芪多糖（Astragalus Polysaccharides， APS）是黄芪主要活性成分之一。大量研究表明，APS具有促进免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、抗衰老、抗寄生虫等多种生物活性，且因其毒副作用小、无残留、不产生耐药性等优点已被广泛应用于免疫增强剂和抗病毒药物中[2]。本文运用苯酚硫酸法对黄芪中的多糖含量进行测定，评价其重复性、稳定性和回收率等。

1 仪器与药品

UV751GD 紫外分光光度计（上海精科仪器有限公司）、HZT精密天平（美国华志公司）；无水葡萄糖标品（大连美仑有限公司）、黄芪（产自内蒙）、硫酸锌、亚铁氰化钾、苯酚、硫酸等试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄芪多糖的提取：

先取出黄芪饮片100g，加入10倍量水，然后煮沸50min再过滤，所滤药渣再加8倍量水煮沸50min后重复过滤，合并两次的滤液进行浓缩。加95%乙醇至醇浓度为70%后于冰箱中静置过夜，次日倾去上清液过滤。加同沉淀物量的蒸馏水溶解后重复上述操作，减压干燥即得黄芪多糖。

2.2 试剂与溶液配制

2.2.1 5%苯酚水溶液的配制：精密量取苯酚5g，加蒸馏水定容至100mL。

2.2.2 标准品溶液的配制：精密称取干燥至恒重的无水葡萄糖标准品0.1002g于100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至容量刻度，混匀后再做10倍稀释备用。

2.2.3 黄芪多糖溶液的制备： 准确称取黄芪多糖1.0g置于250mL容量瓶，加蒸馏水50mL后微微加热，待多糖溶解冷却后加入5mL 30%的硫酸锌溶液，水浴加热5min后一边晃动一边迅速加入5mL亚铁氰化钾溶液，再次冷却后加蒸馏水至容量刻度，混合均匀进行重复过滤，取二次滤液25mL于500mL容量瓶中，加蒸馏水至容量刻度混匀备用。

2.3 标准曲线的绘制：

分别量取0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL标准品溶液于10mL容量瓶中，依次加入0.5mL 5%苯酚溶液和5mL98%浓硫酸溶液，混合均匀后于沸水浴中加热20min，冷却后加蒸馏水至容量刻度。用UV751GD 紫外分光光度计在490nm处以空白为参照分别测定吸光度值。结果见下表1。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行线性回归，得出回归方程为A=0.012C+0.019，r=0.9993，在5～25μg范围内呈现良好的线性关系。

2.4 黄芪中多糖含量的测定：

准确量取2mL黄芪多糖溶液置10mL容量瓶中，依次加入0.5mL 5%苯酚溶液、5mL 98%硫酸，混合均匀后置沸水中20min，冷却稀释后于490nm处测定吸光度值，根据2.2得出的回归方程计算得出受试黄芪中多糖的含量为59.8%。

2.5 重复性检测：

平行称取上述黄芪多糖溶液6份，按2.3所述方法进行重复测定。6份样品的黄芪多糖含量分别为：59.4%、60.0%、59.8%、59.5%、60.1%、59.6%，计算平均含量为59.7%，RSD为2.53%。

2.6 稳定性检测：

分别在0、1、2、4、8h下对受试黄芪进行吸光度测定，结果证明该受试黄芪溶液在8h内基本保持稳定，其中0～4h内表现为很稳定，4h后呈现下降趋势，RSD=3.3%。

2.7 回收率检测：

取6份已知含量的黄芪多糖样品通过添加不同量的葡萄糖进行回收率检测。计算平均回收率为99.2%，RSD为1.78%，具体结果见下表2。

3 讨论

黄芪多糖含量的测定方法主要有苯酚硫酸法、蒽酮浓硫酸法、DDS法（3，5-二硝基水杨酸法）以及碘量法[3]。苯酚-硫酸法主要用于甲基化糖、戊糖和多聚糖的测定，且基本不受蛋白质存在的影响；蒽酮浓硫酸法适用于糖的微量测定，试剂简单，操作简便；DDS法为半微量定糖法，操作简便、快速且较少受其他杂质的干扰；碘量法虽具有干扰小、准确度高的特点，但较苯酚硫酸法操作繁琐。目前黄芪多糖含量的测定多运用苯酚硫酸法，其原理是：多糖在浓硫酸作用下能够水解生成单糖，单糖迅速脱水生成糖醛衍生物后与苯酚缩合可生成一种橙黄色的化合物，该化合物颜色稳定且在波长490nm处有最大的吸收值，其吸光度与总糖含量成线性关系[4]。

本文运用苯酚硫酸法进行黄芪中多糖含量的测定，结果证明其重复性强，RSD为2.53%；稳定性好，在显色反应可维持4h以上，RSD=3.3%；回收率高，RSD为1.78%，又因该测定方法操作简单，试剂便宜，故是测定黄芪多糖含量的首选方法。但值得注意的是，黄芪多糖为中药提取物，它的纯度受很多因素的制约，以致影响检测结果的准确性[5]，且该方法只能测出黄芪多糖中总糖的含量，而不能分组分测定单糖及多糖的含量[6]。

参考文献

[1] 朱振元，刘荣强，周芳，等. 黄芪多糖的分离纯化和抗肿瘤活性研究[J]. 现代食品科技，2011，27（4）： 376-379.

[2] 张彦丽，合力力阿布都热合曼，斯马义阿依吐伦. 苯酚-硫酸法测定维吾尔药昆仑雪菊多糖含量的研究[J]. 药物分析杂志，2010 （011）： 2205-2207.

[3] 于晓辉，刘自扬，杨劲松，等. 薄层色谱法与苯酚硫酸法联用控制黄芪多糖粗粉质量[J]. 安徽农业科学，2010 （14）： 7312-7314.

[4] 涂波，汪志勇. 当归补血汤颗粒中黄芪甲苷和黄芪多糖的含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（18）： 115-117.

[5] 付娟，张海，杨世海，等. 不同产地黄芪多糖含量的测定[J].人参研究，2013， 25（002）： 28-30.

[6] 金芬芬，金锡姣，杨惠鑫，等. 不同提取方法对黄芪多糖提取率影响的实验研究[J]. 中华中医药学刊，2013，31（10）： 2136-2138.