恶喹酸在鳗鱼体内的代谢特征

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噁喹酸( Oxolinic acid) 属喹诺酮类药物，对革兰氏阴性菌有强的抗菌效力，对杀鲑气单胞菌( Aeromonas salmonida) 、嗜水气单胞菌( Aeromonashydrophila) 、鳗弧菌 ( Vibrio anguillarum) 等鱼类病原菌有相当强的抗菌活性，在水产养殖中主要用于防治鳟鱼疖疮病、弧菌病、鲫鱼类结节病、香鱼气单胞菌感染症、鳗鱼赤鳍病、红点病等［1］。但有文献认为，喹诺酮类抗生素的杀菌作用是由于抑制细菌 DNA 促旋酶而干扰细胞 DNA 复制和基因转移导致细菌死亡，对人类的毒性可能也与这个过程有关［2］。基于对细菌的抗生素耐药性的产生以及某些喹诺酮类抗生素显示的致癌、致突变、干扰生殖系统、诱发光过敏等毒性的认识，许多国家对于水产品中这类药物的残留，制定了相应的最大限量( MRL) ，并在生产和流通领域对之实施严格监控［2］。其中输日产品的最大残留限量为 50 μg/kg，而 输 韩 产 品 的 要 求 最 高，最 大 残 留 限 量 为1 μg / kg［3］。美国、挪威、丹麦、意大利、爱尔兰、日本以及我国的研究人员都对噁喹酸进行了水产动物的药代动力学及药物残留的研究，尤其是对大西洋鲑( Salmo salar)［4，5］、鲷( Sparu saurata，Diplodus pun-tazzo)［6］、虹鳟( Oncorhynchus myciss)［7］、大西洋比目鱼( Hippoglossus hippoglossus)［8］等的研究较为详细，但对于噁喹酸在欧洲鳗鲡( Anguilla anguilla)体内的药代动力学研究尚未见报道。鳗鲡是我国水产品出口的重要品种之一，年出口额达数亿美元，日本水产药物使用指南规定了噁喹酸用法和休药期，但近年发现执行规定的使用方法和休药期，在大量鳗鲡产品中仍发现噁喹酸残留未达标，引起产品销售和质量安全问题。本研究拟采用口灌和浸浴的给药方式，对噁喹酸在欧洲鳗鲡体内的药物代谢动力学及残留情况进行分析，为临床用药及休药期的制订提供参考。

1 材料与方法

1. 1 实验动物

健康欧洲鳗鲡( Anguilla anguilla) ，由福建省福清三华饲料有限公司提供，平均体重( 150 ±20) g，实验前暂养在水泥池中 60 d，正常投饵换水管理，水温为 18 ～ 28 ℃。实验在 50 cm × 80 cm不锈钢水族箱中进行，每箱放水 200 L，鳗鲡 25 尾，不间断充气增氧，不投饵，水温控制在( 25 ± 1) ℃。实验前鳗鲡经抽查证明组织中均不含噁喹酸。

1. 2 药品及试剂

噁喹酸标准品，含量 99. 9%，由中国兽医药品监察所提供; 噁喹酸原料药，含量 99%，购自湖北武穴市龙翔药业有限公司; 甲醇为 HPLC 级;其它试剂均为分析纯。

1. 3 高效液相色谱仪及色谱条件

采用 Agilent 1200 型高效液相色谱( HPLC) 仪( 色 谱 柱 类 型: Eclipse XDB-C184. 6 × 250 mm5 μm) ; 多波长紫外检测器; 流动相: 甲醇: 2%冰乙酸( 40∶ 60) ( V/V) ; 流速: 1 mL/min; 柱温:室温; 紫外检测波长: 260 nm; 进样量: 50 μL。

1. 4 实验设计及采样

1. 4. 1 口灌给药

称取噁喹酸原料药适量于 200 mL 容量瓶中，加入未加淀粉的鳗鱼基础饲料，加水配置成含噁喹酸 4 mg/mL 的糊状液。按 20 mg/kg 单剂量口灌给药，无回吐者保留实验。分别于给药后 0. 5、1、2、4、8、16、24、48、72、120、240、480、720、1080、1440、2160、2880、4320、5040 h 采集鱼体的血液和肌肉样本，每个采样时间点采鱼样 5 尾。血液置于含少量 1% 肝素钠( 已风干) 离心管中混匀，5000 r/min 离心 5min 分离血浆，血浆、肌肉于 －80℃保存备用。

1. 4. 2 浸浴给药

称取噁喹酸原料药适量，加 0. 1 mol/L NaOH溶液溶解后，投入 160 L 曝过气的水中，使水中噁喹酸浓度为 5 mg/L; 将鳗鲡置于其中浸浴 18 h 后换水，分别于浸浴后 0. 5、1、2、4、8、12、18、24、 30、 48、 72、 120、 240、 480、 720、 1080、1440、2160、2880、4320、5040 h 采样，采样方法同 1. 4. 1。

1. 5 样品处理

1. 5. 1 血浆

取出冷冻保存的血浆样品，室温下自然解冻，准确吸取 1. 00 mL 置于 15 mL 具塞塑料离心管中，加 20%三氯乙酸甲醇溶液 200 μL，混匀，加乙酸乙酯 5 mL，漩涡混合 5 min，5000 r/min 离心5 min，吸取上清液转移到另一 15 mL 具塞塑料离心管中，置 40 ℃水浴中氮气吹干，残余物加 1 mL流动相溶解，离心，使用 0. 45 μm 滤膜过滤，取50 μL 滤液上机检测。

1. 5. 2 肌肉

将肌肉样品匀浆，准确称取2. 00 g 置于50 mL离心管中，加乙酸乙酯 12 mL，漩涡混合 5 min，5000 r / min 离心 5 min，吸取上清液转移到一支15 mL 具塞塑料离心管中，40 ℃ 氮气吹干，残余物加 2 mL 流动相溶解后，加 5 mL 正己烷去脂 1次，下层液用0. 45 μm 滤膜过滤，取50 μL 滤液上机检测。

1. 6 标准曲线的制备

准确称取噁喹酸标准品 10 mg 于25 mL 容量瓶中，加 5 mL 0. 03 mol/L NaOH 溶液溶解后，加甲醇制成噁喹酸浓度为 400 μg/mL 的标准储备液，4 ℃ 避光保存备用，临用前用流动相倍数稀释成系列标准溶液。取 5 份空白样品( 血浆或肌肉) 分别加入相应体积的标准溶液，配制成含噁喹酸为0. 05、0. 1、0. 2、0. 5、1. 0、2. 0 μg / mL 的血浆样品和 0. 05、0. 1、0. 2、0. 5、1. 0、2. 0 μg/g 的肌肉样品，按 “1. 5”方法对样品处理后，上机测定其峰面积，求出血浆和肌肉的标准工作曲线回归方程和相关系数。

1. 7 回收率和精密度

取空白样品，添加适量噁喹酸标准工作液，配制成含噁喹酸为 0. 05、0. 1、0. 5 μg/mL 3 个系列浓度的血浆样品和 0. 05、0. 1、0. 5 μg/g 3 个系列浓度的肌肉样品，按 1. 5 方法对样品处理后，用高效液相色谱仪测定，计算回收率。将上述不同浓度的样品于 1 d 内分别重复进样5 次和分 5 d 测定，计算日内精密度和日间精密度。1. 8 模型及参数的确定将欧洲鳗鲡血浆与肌肉中噁喹酸浓度-时间数据( C-T) 用 PKS 药动学分析程序在微机上进行药动学处理，给出药物代谢所符合的模型和参数。

2 结果与分析

2. 1 噁喹酸标准品及样品的色谱行为

在上述色谱条件下，噁喹酸的色谱峰尖锐且对称，标准品和样品保留时间均为 5. 8 min 左右。样品中虽有杂峰出现，但与药物目标峰分离良好。空白血浆和肌肉中均无噁喹酸峰( 图 1) 。

2. 2 标准曲线及最低检测限

在 0. 05 ～ 2. 0 μg/mL 线性范围内，噁喹酸在欧洲鳗鲡血浆和肌肉中线性关系良好，详见表 1。以引起 3 倍基线噪音的药物浓度为最低检测限，该方法的最低检测限为 6 μg/L，满足噁喹酸的残留分析要求。

2. 3 回收率及精密度

回收率和精密度测试结果表明，该方法准确度高，重复性好，符合药物代谢动力学研究要求，详见表 2。

2. 4 噁喹酸在欧洲鳗鲡体内的浓度变化及代谢动力学特征

2. 4. 1 口灌给药

以 20 mg/kg 单剂量口灌给药后，噁喹酸在欧洲鳗鲡组织中的浓度见表 3，主要药动学参数见表 4，药时曲线见图 2。将噁喹酸浓度-时间数据采用 PKS 药动学程序进行分析，根据 AIC 值最小和R2值最大的原则，判定欧洲鳗鲡单剂量口灌噁喹酸后血浆及肌肉中的药物经时过程均符合一级吸收一室开放模型，其理论方程为: C血浆= 8. 0560( e－ 0. 00181t－ e－ 0. 00250t) ，C肌肉= 2. 9347 ( e－ 0. 00176t－e－ 0. 00217t) 。

2. 4. 2 浸浴给药

以 5 mg/L 浸浴给药 18 h 后，噁喹酸在欧洲鳗鲡组织中的浓度见表 5、主要药动学参数见表 6、药时曲线见图 3。将噁喹酸浓度-时间数据采用 PKS药动学程序进行分析，根据 AIC 值最小和 R2值最大的原则，判定欧洲鳗鲡单剂量口灌噁喹酸后血浆及肌肉中的药物经时过程均符合一级吸收二室开放模型，其 理 论 方 程 为: C血浆= 1. 8100e－ 0. 0042t+0. 5548 e－ 0. 00143t－ 2. 70e－ 0. 3007t， C肌肉=1. 2779e－ 0. 0082t+ 0. 0394 e－ 0. 000721t－ 6. 35e－ 0. 1202t。

3 讨论

3. 1 代谢特点

噁喹酸在欧洲鳗鲡体内的代谢过程中，其药物浓度均出现再次升高的现象: 口灌给药血浆及肌肉中药物浓度达峰时间分别为 30. 00 h 和 30. 40 h，而至给药后 1080 h 药物浓度均又有所升高; 浸浴给药同口灌给药类似，从浸浴开始噁喹酸在欧洲鳗鲡体内富集，血浆及肌肉中药物浓度分别于26. 40 h和 24. 00 h 达峰，且在 1440 h 药物浓度又有所回升。产生此现象原因可能是某些脏器对药物存在再吸收［9］，比如肝肠循环的作用，使得药物二次吸收，浓度升高，具体原因有待进一步研究。此结果说明噁喹酸在欧洲鳗鲡体内代谢缓慢，在养殖生产中应慎用，以保障产品的质量安全。

3. 2 代谢规律

噁喹酸在欧洲鳗鲡体内的药动学实验结果表明，在水温( 25 ±1) ℃条件下，以20 mg/kg 单剂量口灌给药后，噁喹酸在血浆和肌肉中的变化趋势基本一致，但血浆中的药物浓度与肌肉内的药物浓度相比始终保持较高水平，消除半衰期也较肌肉中的长，说明噁喹酸维持有效血药浓度时间较持久。噁喹酸在血浆和肌肉中的达峰时间无明显差异，其药动学最佳数学模型均符合一室开放模型，说明给药后药物迅速分布于各被测组织与器官，其代谢规律与大西洋鲑的较为类似，许多学者的研究［4-5，10］也得出了相似的结果。以 5 mg/L 浸浴给药 18 h 后，噁喹酸在欧洲鳗鲡体内的代谢规律与口灌给药基本相似，但其药动学最佳数学模型均符合二室开放模型。据报道，同种喹诺酮药在同种鱼中的动力学模型可能不同，例如噁喹酸在大西洋鲑血浆中的动力学既符合二室模型［4，10］又符合三室模型［7，11］。至于决定噁喹酸在鱼中代谢模型的原因，还需进一步研究确定。

3. 3 噁喹酸在欧洲鳗鲡体内的残留及休药期

日本 “肯定列表制度”中规定鳗鲡目中噁喹酸的最高残留限量( MRL) 为 50 μg/kg。单剂量口灌给药方式下，肌肉和血浆中噁喹酸含量分别到给药 83 d、114 d 后才达到安全水平; 浸浴给药方式下，肌肉中需 21 d，血浆中则需 71 d 才符合规定。若根据食用组织中残留浓度来确定休药期，为了充分保障消费者的安全，选择肌肉中未检测出药物且血浆中药物浓度低于 50 μg/kg 的时间为可以起捕食用的时间。因此初步建议在( 25 ±1) ℃ 水温条件下，以 20 mg/kg 单剂量对欧洲鳗鲡混饲口灌给药，休药期至少为给药后 114 d; 以 5 mg/L 浸浴给药18 h，休药期至少为给药后 71 d，起捕食用才是安全的。由于药物在体内的消除受许多因素的影响，因此，休药期的制定应结合给药方式、投饵量、养殖管理方式等多方面因素综合考虑，本研究结果可作为重要的参考依据。