巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

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摘 要:经过近20年的不断开发和完善,巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)已经成为目前最成功的真核表达系统之一,被广泛用于医药生产、饲料添加剂开发和科学研究。介绍了毕赤酵母的生物学特性、常用菌株和表达载体的特点及其研究进展,并阐述了其在外源蛋白的表达方面具有的独特优势。

关键词:毕赤酵母;表达载体;外源蛋白

中图分类号:Q78

文献标识码:A

文章编号:1005-569X(2009)12-0037-03

1 引 言

巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)是一类在缺乏葡萄糖或甘油时,能利用甲醇做为唯一碳源和能源的酵母菌,具有旺盛的生命力,可以在廉价的非选择性培养基中生长,有较宽的生长pH适应范围(3.0～8.0),有较好的发酵基础,非常有利于实现高密度发酵培养,菌体密度可高达100g干细胞/L,它们生长的适宜温度一般为28～30℃,是常用的外源蛋白表达系统。

2 巴斯德毕赤酵母宿主菌株

根据对甲醇利用的情况,P.pastoris可划分为三种表型:第一型,即Mut+型,此型毕赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似,称为甲醇利用正表型。绝大多数毕赤酵母为Mut+表型,如GS115和SMD1168;第二型,即MutS型,此型毕赤酵母的AOX1基因部分敲除,被酿酒酵母ARG4基因所取代,AOX2虽然与AOX1有97 %的同源性,但在含甲醇的培养基内该型毕赤酵母生长缓慢,称为甲醇利用慢表型,如KM71(his4 arg4 aox1::ARG4);第三型,即Mut-型,此型毕赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,细胞不能进行甲醇代谢,无法在甲醇中生长,为甲醇利用负表型,如MC100-3(his4 arg4 aox1::ARG4 aox2::Phis4)。后两者表达外源蛋白有时优于野生株,且需甲醇较少,有时其表达量甚至高于Mut+型。三型菌株在AOX1启动子调控下均可诱导异源蛋白的表达。对这三种菌株的进一步改造,还可得到其它衍生宿主菌,现已获得十几种不同基因型的衍生宿主菌。目前,使用最广泛的巴斯德毕赤酵母宿主菌是Cregg在1985年建立的GS115,它具有组氨酸脱氢酶缺陷型基因His4,可接受His4的载体而具有His+表型。

3 毕赤酵母表达载体

毕赤酵母菌体内无天然质粒,所以表达载体需与宿主菌染色体发生同源重组,将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达[1]。表达载体主要元件包括:启动子、多克隆位点、终止序列、选择标志以及可以诱导基因发生重组的同源序列。

表达载体都是穿梭质粒,先在大肠杆菌中复制扩增,然后被导入宿主酵母细胞。因此,表达载体还含有大肠杆菌质粒的复制单元(ColE1)以及筛选大肠杆菌转化子的标记(如Ampr,Kanar)。若要表达产物分泌到细胞外,表达载体还需携带信号肽序列。

3.1 启动子

目前最常用的启动子是来源于巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因的启动子PAOX1。它是一个很强的启动子,能非常有效地控制外源基因的表达。虽然利用PAOX1已成功表达了多种外源蛋白,但以PAOX1为启动子的表达系统还有一定缺陷,例如不适用于食品生产,添加甲醇诱导时存在火灾隐患。3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子PGAP是Waterham等近年来克隆成功的一个构成性表达的启动子,它突出的特点是发酵过程操作简便,可以连续表达,无需诱导。利用PGAP表达外源基因主要的限制是目的蛋白不能对宿主菌有毒性,否则在长期的发酵过程中将限制其生长。

Shen等又克隆出FLD1(谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶基因)启动子,它具有与AOX1启动子相同或更高的强度,能在甲胺(葡萄糖、甘油等)或甲醇为唯一碳源的情况下表达,甲胺不易挥发,更适于摇瓶研究。这三种启动子都是导致外源基因过高表达的启动子,但有研究发现,某些外源基因可因被启动的表达水平过高,而导致目的蛋白折叠失准,加工无能或定位错误。因此,近年来人们又研制了启动基因柔和表达的启动子如PEX8和YPT1启动子,但它们的表达水平要低于上述三种强启动子。这些启动子各有优缺点,在实验设计中应根据自己的需要选择合适的启动子。

3.2 选择标志

常用的选择标记可以分为两种:①营养缺陷型选择标记,如来源于巴斯德毕赤酵母的HIS4基因和来源于酿酒酵母的ARG4基因和SUC2基因;②抗性选择标记,如来源于大肠杆菌Tn903能够使真核细胞对卡那霉素家族成员G418产生抗性的kanr基因,又如来源于印度斯坦链异壁菌(streptoalloteichus hindustanus)能够使细菌和真核细胞对博莱霉素家族成员Zeocin产生抗性的Shbler基因,但Zeocin是一种强诱变剂,可能导致转化子产生不可预料的突变。近来,还成功获得一系列新的营养筛选标记,如巴斯德毕赤酵母氨基咪唑琥珀酸草酰二胺合成酶基因(ADE1)和乳清酸核苷-5&-磷酸脱羧酶基因(URA3)。

3.3 信号肽

分泌性的外源蛋白可以采用自身的信号肽来实现分泌,但是大多数外源信号肽不能在毕赤酵母中有效表达,可以考虑采用酵母自身的信号肽。由于毕赤酵母表达的分泌性蛋白很少,不易找到合适的信号肽,从酿酒酵母分离到的α-因子前导肽,它不仅可以介导蛋白质沿分泌通路分泌到细胞外,而且在分泌过程中可以被自身的膜蛋白酶Kex2自动切割去除。

如果表达胞内蛋白的话就不需要信号肽了,可以在目的蛋白前加一个定向肽(peroxisome targetingsignal,PTS),可以把目的蛋白聚集到微体中,既避免了胞内过量积累外源蛋白对细胞正常生理功能的影响,又可以保护外源蛋白免受胞内蛋白酶的降解。

4 利用毕赤酵母表达外源蛋白的优缺点

毕赤酵母作为一个真核表达系统既具有原核表达系统生长力旺盛、对营养物质的要求低、生活周期短、易培养的优点,也具备其作为近几年来广泛应用的表达系统的独特优势,可以对表达的外源蛋白进行加工修饰使蛋白更接近天然的状态,形成有活性的蛋白。与第一代真核表达系统酿酒酵母相比,毕赤酵母表达系统具有以下优势:

(1)稳定性高。由于毕赤酵母没有游离的质粒,外源基因进入细胞后通过交换整合进入酵母的基因组中成为毕赤酵母基因组的一部分,外源基因不会丢失,遗传稳定性好。

(2)表达量高。在毕赤酵母中采用了AOX1启动子作为外源基因的启动子,AOX1启动子是一个强启动子,在甲醇诱导下可以实现外源基因的高效表达,比以往的表达系统提高了10～100倍[2]。而且由于AOX1是甲醇诱导型的可以通过控制甘油和甲醇的比例来控制外源蛋白的表达。

(3)分泌效率高。采用酿酒酵母α成熟因子(α-MF)信号序列可以实现大多数蛋白的分泌表达,也有采用外源蛋白自身信号肽来分泌并获得成功的例子,如HAS[3]、转化酶[4,5]、牛的溶菌酶[6]。

(4)自身分泌的蛋白较少。细胞外大部分是目的蛋白,而且营养要求简单,培养基中其他的蛋白成分少,背景比较干净清楚,这就为下游分离纯化蛋白提供了便利。

(5)糖基化更接近蛋白的天然状态[7],糖基侧链较酿酒酵母短约为它的20%[8],作为药物治疗时不会引发免疫反应。

此外,毕赤酵母偏好有氧的生长环境,菌体可以达到很高的密度(细胞干重可达100g/L以上),适应较宽的pH(3.0～8.0),这些特点使得毕赤酵母适于大规模的工业发酵来产生大量的外源蛋白。

但是毕赤酵母表达系统也有一些不尽如人意的地方需要改进:

(1)甲醇做诱导物存在安全隐患。甲醇有毒过量能够导致失明,表达一些口服药物以及食品蛋白时往往不能被人们接受,而且甲醇易挥发,为大规模的工业化生长带来了火灾的遗患。

(2)毕赤酵母的遗传背景还没有酿酒酵母那么清楚,为开展实验带来了诸多不便。

(3)目前有越来越多的低表达或不表达的报导出现,比如多瘤病毒大T抗原,还有的甚至不能表达(如HIV表面糖蛋白)[9]。影响蛋白表达量的因素很多,需要不断摸索寻找最佳表达条件,实际操作很繁琐。

5 结 语

巴斯德毕赤酵母是一种嗜毕赤酵母,起初是菲利普石油公司为了生产家畜饲料单细胞蛋白而开发的,它可以在以甲醇为唯一碳源的培养基中生长。自l987 年Gregg等首次在毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)以来,国内外已有数百种外源蛋白获得表达。

巴斯德毕赤酵母表达系统的诸多优势使之越来越受到关注,其研究和商业价值亦不断体现。近年来,随着对该甲醇营养酵母分子遗传学研究和认识的进一步深入和实践经验的不断积累,巴斯德毕赤酵母基因表达系统的应用范围大大加宽,表达产物除了人畜药用制品外,还包括来自植物、动物和细菌的各种酶、膜受体蛋白、含辅基的蛋白质以及可用于研究晶体结构的蛋白质等,它还可以同时表达酶组分比例适当的一个酶系而以全细胞作为生物催化剂,对整个生命科学和人类健康产生重要影响。同时我们也相信,该表达系统必将在我国21世纪基因工程真核表达产品产业化、商品化进程中,发挥越来越大的作用。

参考文献:

[1] 欧阳立明,刘志敏等.巴斯德毕赤酵母的基因表达系统研究进展[J].生物化学与生物物理进展.2000,27(2):151～154.

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[5] Tschopp J F,Svelow G,Kosson R,et al.High-Level Secretion of Glycosylated Invertase in the MethylotroPhic Yeast,Pichia Pastoris.Bio/Technology,1987,5:1305~1308.

[6] Digan ME,Lair SV,Brierly RA,et al.Continuous production of a novel lysozyme via secretion from the yeast pichia pastoris.Bio/Technology,1989,7:160～164.

[7] Kalidas C,Joshi L,Batt C.Characterization of glycosylated variants of β-Lactoglobulin expression in Pichia pastoris.Protein Engineering,2001,vol.14 (3)201～207.

[8] Trimble RB,Atkinson Ph,T schopp JF,et al.Structure of oligosaccharides on Saccharomyces SUC2 invertase secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris.J Biol Chem,1991,vol.266(34):22807～22817.

[9] Keller G.In vitro differentiation of embryonic stem cells.Curr Opin Cell Biol.1995,vol.7(6):862～869.