纤维素酶协同机械法制备微/纳纤丝

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摘 要：以杨木纸浆纤维为原料，采用纤维素酶水解法协同机械处理法制备出微/纳纤丝（Micro/Nanofibrils）。酶处理制备微/纳纤丝的影响因素按大小依次为：时间、加酶量、料液比。最佳工艺条件：处理时间为36 h，加酶量30 FPU，料液比为1∶40。酶解后纤维的结晶度为84.2%，纤维素含量为95.26%，再经过纤丝进行超声和高压均质间歇式处理来制备微/纳纤丝。从SEM图可以看出，纤丝表面起毛、分丝帚化，次生壁中层S2上微纤丝暴露，分离出了细小纤维。纤维的直径分布在25～55 nm，宽度方向已经达到纳米级纤丝要求。

关键词：纤维素酶；微/纳纤丝；机械处理

中图分类号：TQ340.1 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.11.002

21世纪以来，随着资源的严重匮乏和人们对环保的日益重视，可再生生物质资源的利用具有了重要意义[1]。纤维素是地球上极为丰富的可再生生物质资源之一，占地球总生物量的40%[2-3]，广泛应用于造纸、塑料、炸药、电工及科研等方面。从天然纤维中分离出的微/纳纤丝具有高强度、高结晶度、高纯度、生物可降解、亲水性强等特性，因此，微/纳纤丝在高性能复合材料中显示出广阔应用前景。微/纳纤丝（micro/nanofibrils）包括微纤丝（microfibril）和纳米纤丝（nanofibril）两种。微纤丝被定义为直径在0.1～1 μm，长度在5～50 μm的纤维，纳米材料则包括至少一维空间的尺寸为纳米级（1～100 nm）[4]。

微/纳纤丝的制备方法有化学法、机械法、生物法、人工合成法、静电纺织法、酶处理法等[5]。相比较来说，酶处理法制备微/纳纤丝具有反应条件温和、能耗低、设备要求相对简单、经济环保等优势[6]，且所用的试剂酶与纤维素酶均为可再生资源[7]，因此，酶处理工艺更适合今后的大量生产微/纳纤丝。

本研究以杨木纸浆纤维为原料，通过纤维素酶协同机械法处理，致力于以环境友好方式制备出微/纳纤丝，运用高效液相色谱、X射线衍射仪和扫描电子显微镜对制备出的微/纳纤丝进行表征分析，研究其细化后的性能变化。

1 材料和方法

1.1 材 料

杨木纸浆纤维：购置于江苏某造纸厂，纤维素含量为77.44%，半纤维素含量为15.72%，酸不溶木素为5.1%，结晶度为68.2%。纤维素酶：购置于宁夏和氏璧公司，是由青霉菌发酵液精制而成，滤纸酶活为48.86 FPU·g-1。主要试剂：柠檬酸、过氧化钠、亚硫酸钠、硫酸、3，5-二硝基水杨酸、偏重亚硫酸钠等分析纯均购于南京化学试剂有限公司。

主要仪器：高效液相色谱（美国安捷伦公司），高压均质仪（定制于日本某研究公司），超声波细胞粉碎机（南京先欧仪器制造有限公司），马尔文激光粒度仪（马尔文公司），X射线衍射仪（岛津/KRATOS公司），JSM-7600F场发射扫描电镜（日本电子）等。

1.2 酶解杨木纸浆纤维中纤维素/半纤维素的测定[8]

称取（300.0±10.0） mg已用酶处理过的杨木纸浆纤维置于干燥皿中，加入（3.00±0.01） mL72%硫酸，充分润湿混匀。将干燥皿置于（30±3） ℃水浴中振荡反应（60±5） min，振荡须保证所有纳米纤维素浸润于硫酸溶液中，完全水解。水解完成后，从水浴槽中取出干燥皿，加入（84±0.04） g纯水，将硫酸浓度稀释至4%。将样品置于高压灭菌器中，温度设置为121 ℃，时间60 min。反应结束后，冷却至室温。用已准备好的磨成粉状的脱水Ba（OH）2，中和样品pH值至5～6。离心后，取上清液作高效液相分析用，从图谱中计算出葡萄糖、木糖浓度。从而可以计算出样品中纤维素和半纤维素的绝干百分比。公式（1）如下：

纤维素/半纤维素含量=×100%（1）

式中，C为水解后单糖的浓度，单位为g·L-1；MC为杨木纸浆纤维的含水率，0.087为水解液的总体积，单位为L；0.3为酸水解原料的质量，单位为g；0.9为纤维素和半纤维素水解葡萄糖对应的系数。

用蒸馏水洗涤残渣，后将残渣在105 ℃下干燥至恒质量并称质量，将其作为酸不溶木质素的质量；取一定量的水解上清液用分光光度法在205 nm处测定其吸光度AOD，然后按式（2）计算相应的酸溶木素。

酸溶木素=×8.7%（2）

1.3 杨木纸浆纤维预处理

（1）杨木纸浆纤维的粉碎。由于纤维过于粗，用植物粉碎机对杨木纸浆纤维再加工，过0.18 mm筛。

（2）化学处理[9]。由于杨木纸浆纤维中仍然有少量半纤维素、木素及其它杂质，这会影响微/纳纤丝的制备，因此要将其去除。选择固液比为1∶30，在NaSO3浓度为3%，蒸煮时间为2 h，温度为200 ℃，脱去杨木纸浆纤维中的木质素，水洗至中性，收集滤渣；选择固液比为1∶30，NaOH浓度为8%，碱处理时间3 h，温度80 ℃，脱去杨木纸浆纤维中的半纤维素，水洗至中性，收集滤渣；选择固液比为1∶40，H2O2浓度5%，处理时间1 h，温度45 ℃，脱去果胶等杂质，水洗至中性，收集滤渣。经高效液相得出图谱，通过公式（1）和（2）分别计算得出纤维素含量为92.85%、半纤维素含量为1.87%、木质素含量为0.88%，适合作为酶解纤维素的底物。

1.4 正交试验

为了考察最优条件，选择加酶量、酶解时间和料液比作为考察因素，运用3因素3水平作正交试验，确定微/纳纤丝的最佳工艺参数，具体因素水平如表1所示。

1.5 纤维素酶解杨木纸浆纤维

将碱预处理后的纤维素与缓冲溶液以一定的料液比加入纤维素酶液，在适宜的温度以及pH值下酶解反应一定时间，达到纤维素酶的平衡聚合度，灭酶5 min，过滤，滤渣风干，粉碎，即得杨木纸浆微/纳纤丝。

1.6 机械法处理杨木纸浆纤维

由于纤维素酶选择性地酶解掉无定形的纤维素而剩下部分纤维素晶体[10]，因此，可以用机械法加以辅助酶解微/纳纤丝，以较为环保的方式获得结晶度较高、粒径较小的产物。本试验中采用超声波粉碎仪和高压均质仪间歇式处理已酶解过的微/纳纤丝以获得质量更优的微/纳纤丝。

1.7 X射线衍射分析（XRD）[11]

样品按照X射线衍射仪的测试要求装片。X光为铜靶，扫描步长为0.05°，扫描范围为5°～40°，5°·min-1。测试条件为电压40 kV，电流30 mA，采用2θ/θ步进扫描。根据Turley法计算试样的结晶度[11]，计算公式为：

CrI=×100% （3）

式中，CrI为结晶度指数；I002为（002）晶格衍射角的极大强度；Iam为代表2θ角近于18°时非结晶背景衍射的散射强度。I002与Iam单位相同。

1.8 JSM-7600F场发射扫描电子显微镜（SEM）分析

配制已制备好的微/纳纤丝溶液，放入冷冻干燥箱中冷冻干燥48 h后取出并立即存放入干燥器中以备检测微/纳纤丝的长度、粒径、形态等[12-14]。临界点干燥，喷金，放入JSM-7600F场发射扫描电子显微镜（SEM）下观察。

2 结果与分析

2.1 正交试验分析

本试验采用的纤维素酶由青霉菌发酵液精制而成，此种酶经试验在50 ℃下酶解效率最好，因此本试验酶解温度定为50 ℃[15-21]。采用3因素3水平的正交试验，确定制备微/纳纤丝的最佳工艺参数，得到CrI较高的微/纳纤丝。根据公式（3）和XRD图谱算出每组试验的CrI，正交试验结果见表2。

由表2可知，酶处理制备杨木纸浆微/纳纤丝的影响因素依次为A>C>B，即时间、加酶量、料液比。最佳工艺条件为A2B2C1，即最佳工艺条件为加酶量30 FPU，处理时间为36 h，料液比为1∶40。由于酶中含有蛋白质等杂质，使原料中纤维素含量有所降低，可以通过适当的碱处理来去除蛋白质，再进行机械处理以制备粒径更小的微/纳纤丝。

通过马尔文激光粒度仪Zetasizer Nano对酶解后微/纳纤丝的粒径分布进行测量。从图1可以看出，溶液中去除蛋白前后的变化情况。

图1（a）中有2个峰值，在80 ℃下进行热碱处理后得到图1（b），图1（b）有一个峰值，这说明，酶处理后的产物中蛋白质已经去除。因此，可以得出：图1（a）中粒径分布范围在100～1 000 nm，光强小的峰值是试验材料中酶的粒径范围分布情况。从（a）、（b）两图中均可看出，酶处理后的产物粒径分布范围大都在1 m以上，说明酶处理后的微/纳纤丝大部分还是聚集形态的纤丝束，还需要进一步的机械法处理才能获得粒径分布范围更小的纳米纤丝。图1（b）中1 m以上纤丝粒径分布较图1（a）变窄，这是由于纤维在热碱溶液中能够发生剥皮反应（150 ℃下发生），引起纤维素降解。

按照正交试验的结果进行验证试验，由计算可知纤维素酶水解后杨木纸浆纤维的CrI为84.2%，这表明纤维素酶水解作用破坏了纤维素的非结晶区，使酶解后的纤维CrI提高。去除蛋白后纤维素的含量为95.26%。纤维素酶水解后，纤维素的结晶度和含量均有所改善。

2.2 机械法再处理

尽管在本试验的最佳酶解条件下获得纤丝的纤维素含量和结晶度提高较大，但是酶解的作用趋于缓和，在粒径的提高方面明显不够。用机械法加以辅助酶解，不仅较之化学法污染更小，而且可以获得更小粒径的微/纳纤丝[21]。

本试验采用超声波粉碎仪和高压均质仪间歇处理酶解后的微/纳纤丝。配制浓度为0.05%的酶解后的杨木纸浆纤维溶液100 mL（已达到微米级别，见图2中（a）、（b）和（c）），选用1/2″探头（探入式）、振幅为80 μm、处理时间90 min（分3次）、脉冲时间6 s、脉冲间隔4 s。打开高压均质仪的压力阀，调整压力至1 000～1 500 bar，分3组进行均质，每组5次，每次处理时长约为2 min。超声波处理和高压均质处理为间歇式，即：超声波处理高压均质处理超声波处理高压均质处理超声波处理高压均质处理。

2.3 杨木纸浆微/纳纤丝的表征分析

采用JSM-7600F场发射扫描电子显微镜（SEM），分别对酶解后和超声波/高压均质仪处理后的杨木纸浆纤维的形态进行研究，配制浓度为0.05%微/纳纤丝溶液进行冷冻干燥，48 h后放入扫描电镜下观察，结果如图2所示。

图2中的（a）、（b）和（c）图为酶处理后杨木纸浆纤维的SEM图。从图中可以看出，纤维比较疏松多孔，这说明酶处理已经使纤维的初生壁和次生壁外层脱落。但是团聚现象较严重，分散不均匀，粒径分布大都在10 m左右，如图（c）所示。因此，还需机械力辅助使纤维产生纵向分裂，破坏纤丝与纤丝之间的氢键作用以获得分散均匀、粒径达到纳米级的纳米纤丝。

图2中的（d）、（e）和（f）图为酶处理协同机械法处理杨木纸浆纤维的SEM图。从图中可以看出，经过超声波和高压均质间歇处理后的纤维已经分离成纤丝状。纤维素链上的主要功能基是羟基（—OH），羟基不仅对纤维素的超分子结构有决定作用，而且也影响其化学和物理性能。—OH基之间或—OH基与O—、N—和S—基团能够联接，即氢键。因此，只有纤丝与纤丝间的氢键断裂，才能获得微/纳纤丝。酶处理协同机械法处理纤维正是运用于此，才制备出了如图2中（d）～（f）纳米级的纤丝。如图2中（d）、（e）和（f）所示，纤丝具有较大的比表面积，并且长径比大，图2（f）表明：纤维的直径分布在25～55 nm，宽度方向已经达到纳米级纤丝要求。从图2（d）、（e）和（f）中还可以看出，纤丝表面起毛、分丝帚化，这是因为次生壁中层S2上微纤丝暴露，分离出了细小纤维。

3 结 论

（1）酶处理制备杨木纸浆微/纳纤丝的影响因素按大小依次为：时间、加酶量、料液比，最佳工艺条件为：加酶量30 FPU，处理时间为36 h，料液比为1∶40。

（2）热碱处理去除酶解产物中的蛋白质，纤丝的CrI为84.2%，纤维素含量为95.26%。纤丝的CrI和含量均有所改善。

（3）采用超声波粉碎仪和高压均质仪间歇处理酶解后的微/纳纤丝，获得产物达到纳米级别，从电镜图中可看出，次生壁中层S2上微纤丝暴露，纤丝表面起毛、分丝帚化，分离出了细小纤维。纤维的直径分布在25～55 nm，宽度方向已经达到纳米级纤丝要求。

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