论苹果渣多酚抗氧化性质

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摘要：为研究苹果渣多酚的抗氧化性质，分别测定了苹果渣多酚对·OH的清除作用、对·O2-的清除作用和对脂质过氧化的抑制作用。结果表明：苹果渣多酚提取物对·OH的清除能力、对·O2-的清除能力和脂质过氧化的抑制能力EC50分别为5.7mg/ml、6.7mg/ml和0.27mg/ml。苹果渣多酚提取物具有较强的抗氧化的作用。关键词：苹果渣；多酚；抗氧化作者简介：靳学远（1955-），学士，安徽淮南人，副教授，从事天然产物化学研究和教学。苹果中含有丰富的植物纤维、糖、矿物质、苹果酸、维生素、蛋白质和多酚类物质。苹果多酚(applepolyphenols，缩写为AP)是苹果中所含多元酚类物质的总称，在一些酿酒苹果品种中最高可达7g/kg(鲜重)[1]。研究发现，苹果多酚的许多生理功能活性比茶多酚要高100倍以上[2]，具有防衰老、抗肿瘤、抗突变、抗动脉粥样硬化、防治冠心病与中风等在内的多种药理功能[3]。日本从未成熟的苹果中已开发出苹果多酚制品，我国的苹果资源丰富，然而其综合利用还较落后，苹果渣是果汁厂榨汁后产生的下脚料，含有多丰富的多酚类化合物，但长期以来，果汁厂将其作为废渣抛弃，造成了环境的极大污染和资源的严重浪费。作者采用苹果渣提取了其中的多酚物质，对其抗氧化活性进行研究。1材料与方法1.1材料和设备苹果渣为安徽萧县龙城食品厂提供；无水乙醇、氯仿、乙酸乙酯等为分析纯，原儿茶酸、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)为Sigma公司产品。WD2900B格兰氏微波炉(中国顺德格兰氏电器公司)，751-GD紫外可见光分光光度计(上海分析仪器总厂)，旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）,SHZ-C型循环水式多用真空泵(河南省巩义市英峪电子仪器厂生产),电子天平(日本岛津公司)。1.2试验方法1.2.1苹果渣多酚的微波提取精确称取一定量的苹果渣放入烧杯内。按比例加入70乙醇溶液，然后把烧杯放入微波炉内，调节微波功率350W，按提取时间240s进行提取。提取完成后，取出烧杯慢慢搅拌，放置2-3min后，用真空泵将原料与溶剂减压抽滤分离，收集滤液，滤液用旋转蒸发器减压蒸馏回收乙醇，待乙醇基本除去后，加入一倍量的氯仿萃取，将下层(氯仿层)溶液在旋转蒸发器上回收氯仿，上层(水层)用3倍量的乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，加入无水MgSO4除去残留水分，然后将萃取液过滤，得到的滤液用旋转蒸发器在50～60℃下减压蒸馏回收乙酸乙酯。将回收乙酸乙酯后的萃取液放入真空干燥箱中，在小于70℃下干燥，除去残余的乙酸乙酯，得苹果渣多酚。1.2.2多酚含量的测定标准曲线的制作：配制100mg/L原儿茶酸标准溶液。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml原儿茶酸标准溶液，加入1mlFolin-酚显色剂、5ml1mol/L碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至10ml，混合均匀后，室温下避光放置1h，用UV-754紫外可见光分光光度计在760nm处测定吸光值。以吸光值（A0对原儿茶酸浓度（C）进行线性回归分析，求得回归方程和相关系数分别为A=0.0723C-0.0092r=0.998(P<0.01)。分析表明，原儿茶酸质量浓度在0.002~0.012mg/ml时与吸光值具有良好的线性关系。样品中多酚含量的测定：准确称取40mg苹果渣多酚化合物固体提取物，用蒸馏水溶解并定容至5ml，取1ml按标准曲线制作方法测定吸光值，计算多酚含量。1.2.3苹果渣多酚对·OH的清除作用采用Fenton反应体系，·OH由EDTA-Na2-Fe(Ⅱ)-H2O2产生，由于·OH可特异性地使番红花红T褪色，根据褪色程度用比色法来衡量·OH的含量。反应体系含pH7.4磷酸盐缓冲液1.5ml，260μg/ml番红花红T0.2ml，3H2O20.8ml，2mmol/LEDTA-Na2-Fe(Ⅱ)0.7ml，再加入不同浓度的供试液0.8ml，混匀后于37℃保温30min，然后于520nm处测定A值。空白组以重蒸水代替供试液，对照组以重蒸水代替供试液和EDTA-Na2-Fe(Ⅱ)，每个浓度组平行测定5份，求其平均值。实验结果以抑制率（E）表示。1.2.4苹果渣多酚对·O2-的清除作用采用邻苯三酚自氧化法。具体操作是pH8.2的Tis-HCI缓冲液加0.1ml不同浓度的PRL,混匀后加入7mmol/L的邻苯酚0.3m1,混匀后在第4min时加入10mol/LHCI1滴中止反应，在325nm波长下测A值，计算抑制率（E）。1.2.5苹果渣多酚对自发脂质过氧化的抑制作用选用18~25g雄性小鼠，饥饿过夜，颈椎脱臼处死，迅速取出肝脏放入冰浴的PBS缓冲液中，洗净剪碎，然后加入4℃PBS缓冲液进行匀浆，制成10的肝匀浆，取0.6ml于试管中，加入不同浓度供试液1.0ml，对照组以蒸馏水代替供试液，混匀后于37℃水浴温孵2h，取出后加10三氯乙酸2.0ml，0.67硫代巴比妥酸2.0ml，混匀后沸水浴15min，以4500r/min离心20min，取上清液在532nm处测定吸光度A值，以硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量，并计算抑制率（E）。2结果与讨论2.2.1苹果渣多酚对·OH的清除作用·OH是活性氧中最活泼的氧自由基之一，它几乎能与活细胞中任何分子发生反应，可介导机体组织脂质过氧化，蛋白质解聚、聚合，核酸断裂和多糖裂解等生化过程，引发组织细胞病变，导致各种疾病发生和加速机体衰老。减少此类自由基可预防衰老、心血管疾病，并具有防癌抗>！图1苹果多酚对·OH的清除作用由图1可见，苹果渣多酚对·OH自由基有较强的清除作用，达到50清除率所需提取物浓度(EC50)为5.7mg/ml。2.2.2苹果渣多酚对·O2-的清除作用不同浓度的苹果渣多酚对·O2-的清除作用见图2。图2苹果多酚对·O2-的清除作用由图2可见，苹果渣多酚对·O2-自由基有较强的清除作用，达到50清除率所需提取物浓度(EC50)为6.7mg/ml。2.2.3苹果渣多酚对自发脂质过氧化的抑制作用脂质过氧化反应会损伤生物膜，丙三醛(MDA)是脂质过氧化反应的终产物之一，氧化损伤可引起MDA生成增加，肝脏是反应脂质过氧化较为敏感的器官，所以肝脏中MDA的含量间接反映细胞脂质过氧化程度。图3苹果渣多酚自发脂质过氧化的抑制作用从图3结果可见，苹果多酚对自发脂质过氧化有较强的抑制作用，达到50抑制率所需提取物浓度(EC50)为0.27mg/ml。3结论抗自由基的药物研究近年来受到人们的重视，尤其是在抗衰老、防治心脑血管疾病领域。机体在代谢过程中产生的氧自由基在某些病理条件下因代谢产物过量，对机体的生物大分子如蛋白质、脂质、核酸等造成氧化损伤。苹果多酚体外可清除·OH自由基和·O2-，并可抑制小鼠肝匀浆脂质过氧化反应，表明苹果渣多酚提取物具有较强的抗氧化的作用，可用于抗衰老、防治心脑血管疾病。参考文献[1]SanonerP,GuyotS,MametNetal.Polyphenolsprofilesoffrenchciderapplevarieties(Malusdomesticsp.)[J].AgricFoodChem,199 9,47:4847-4853.[2]唐传核,彭志英.苹果多酚的开发及应用[J].中国食品添加剂,20__,2:41-45.[3]LuYingrong,YeapFooL.Identificationandquantificationofmajorpolyphenolinapplepomace[J].FoodChemistry,1997,59:187-194.