真核细胞范文精选

细胞是除病毒以外的生物体结构和功能的基本单位。在种类繁多的细胞世界中，根据其进化地位、结构的复杂程度等方面的差异，可以将细胞分为原核细胞和真核细胞两大类。原核细胞没有典型的细胞核，由原核细胞构成的生物是原核生物；真核细胞有细胞核，由真核细胞构成的生物是真核生物，但二者的区别还不仅如此，现就高中阶段所学知识，将二者之间的区别归纳如下。

1.细胞壁上的差异

原核细胞细胞壁的成分主要是肽聚糖和胞壁酸，还有脂多糖、脂蛋白等成分。细胞壁除对细胞有保护作用外，还对物质交换起部分调节作用，其成分还与抗原性、致病性等方面有关。真核细胞中动物细胞没有细胞壁，植物细胞的细胞壁成分主要是纤维素和果胶，起支持和保护作用。

2.细胞核与染色体水平

原核生物的特征是体积较小，直径由0.2～10μm，进化地位较原始，现存资料可以证明真核细胞是由原核细胞进化而来。代表性的原核生物有：细菌、蓝藻、支原体、衣原体、立克次氏体等。原核细胞与真核细胞最本质的区别就是看有没有成型的细胞核，原核细胞没有核膜将它的遗传物质与细胞质分隔开，没有核膜、没有核仁、没有固定形态、结构也较简单，其遗传信息量小，遗传信息的载体是的双链环状DNA分子，没有与组蛋白结合，不构成染色体（有的原核生物在其主基因组外还有更小的能进出细胞的质粒DNA）。真核细胞具有双层膜结构的核膜将细胞内部分成细胞核与细胞质两部分，核膜上有核孔，核内有核仁，其绝大多数遗传物质就分布在细胞核内，双层核膜的出现为遗传物质结构的演化提供了良好的微环境，使高度复杂的遗传装置相对独立起来，也使基因的表达具有严格的区域性。真核细胞遗传信息的载体DNA与原核细胞的DNA相比，其结构与数量都有变化。数量由几千发展到几万甚至十万以上；结构为线状，线状的DNA分子能与多种组蛋白结合，形成直径10nm的核小体结构，然后再以核小体为结构单位高度螺旋盘绕形成复杂的染色体或染色质。

3.细胞器水平

细胞器存在于细胞膜以内核膜以外具有一定形态结构功能。原核细胞只具有一种细胞器—核糖体。真核细胞除核糖体外，还有具有双层膜结构的细胞器：线粒体、叶绿体（植物细胞）；单层膜结构的细胞器：高尔集体、内质网、溶酶体、液泡（植物细胞）和没有膜结构的细胞器—中心体，它们分散在细胞质中，每种细胞器都有各自的结构和功能，他们之间协调配合来完成物质的代谢。如分泌蛋白的合成，首先要在核糖体上合成肽链，然后运到内质网中进行加工，再运到高尔基体上进行再加工，最后释放到细胞外，在整个过程中涉及到核糖体、内质网、高尔基体和提供能量的线粒体四种细胞器。二者虽然都有核糖体，但核糖体的化学组成和形态结构上有明显的区别。真核细胞核糖体的沉降系数为80S型，由60S和40S大小两个亚基组成；原核细胞核糖体的沉降系数为70S型，由50S和30S大小两个亚基组成。

真核细胞中的线粒体，有自己特有的基因组，能完成自己DNA的复制及部分蛋白质的合成，其内膜上有与氧化磷酸化相关的电子传递链，为细胞的代谢活动提供能量。原核细胞功能上与线粒体相当的结构是质膜和由质膜内折形成的结构，但后者没有自己特有的基因组。真核细胞的叶绿体，也有自己特有的基因组和合成系统。有些原核生物虽然也具有能进行光合作用的膜结构称之为类囊体，但未被双层膜包裹，不形成叶绿体。

有丝分裂与减数分裂是真核生物细胞增殖的方式。有丝分裂主要发生在生物生长发育阶段，是体细胞的增殖方式。减数分裂一般发生在生物进行有性生殖时，是有性生殖细胞的产生方式。掌握染色体、染色单体、DNA以及细胞数目与种类的变化规律是深刻理解这部分知识的重要途径，辨别各种图形与曲线并熟练掌握，是学好这部分内容的基本方法。

例1 关于同一个体中细胞有丝分裂和减数第一次分裂的叙述，正确的是（ ）

A.两者前期染色体数目相同，染色体行为和DNA分子数目不同

B.两者中期染色体数目不同，染色体行为和DNA分子数目相同

C.两者后期染色体行为和数目不同，DNA分子数目相同

D.两者后期染色体行为和数目相同，DNA分子数目不同

解析 有丝分裂和减数分裂分裂期过程的最大区别是染色体的行为不同。有丝分裂前期有同源染色体但不联会，中期染色体的着丝点被纺锤丝拉到赤道板位置排列整齐，后期着丝点分裂，姐妹染色单体分离并分别移向细胞的两极，此时染色体数目暂时性加倍，DNA分子数不变，分裂的结果是分裂前后染色体数与DNA分子数与分裂前一样。减数第一次分裂前期同源染色体联会，中期是联会的同源染色体被拉到赤道板的两侧并列分布，后期同源染色体分离及非同源染色体的自由组合，分裂的结果是染色体数目和DNA 数目均减少一半。由于DNA是在间期复制的，在分裂期总数未增加。有丝分裂的前期无同源染色体联会的行为，所以A、B、D错。本题通过有丝分裂和减数第一次分裂中有关染色体行为和DNA数目变化规律的内容，考查两种分裂方式的相同点和不同点，考查大家对两种分裂方式的识记和分析解决问题的能力。

答案 C

[摘要] 目的 探讨真核细胞起始因子-4E（eIF-4E）在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达情况及其与预后的关系。 方法 选择2009年1月～2010年12月温州医科大学附属黄岩医院外科手术切除的NSCLC组织60例以及30例癌旁正常组织样本作为对照，采用免疫组化法检测NSCLC组织以及癌旁正常肺组织中elF4E的表达。NSCLC患者术后均接受2周以上的榄香烯联合顺铂化疗，对所有患者均进行系统地随访评价，分析eIF-4E的表达与无瘤生存期（DFS）和总生存时间（OS）的关系。 结果 eIF-4E在NSCLC癌组织中的表达率为80.00%，显著高于正常癌旁组织（33.33%），差异有高度统计学意义（P < 0.01）。年龄≥60岁及TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期患者的eIF-4E高表达率明显高于年龄<60岁及分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者，差异均有统计学意义（P < 0.05）。eIF-4E低表达患者的DFS和OS均显著高于高表达者，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 eIF-4E基因在NSCLC组织中呈高水平表达，榄香烯联合顺铂化疗后eIF-4E低表达患者的DFS和OS明显延长。eIF-4E高表达水平可作为NSCLC不良预后的预测因子。

[关键词] eIF-4E基因;表达;非小细胞肺癌;预后

[中图分类号] R734 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）01（a）-0012-04

Expression of eIF-4E in non-small cell lung cancer and its correlation with prognosis

WANG Binliang LI Xiaobo KONG Yiming ZHANG Rongying

Department of Respiratory Medicine， the Affiliated Huangyan Hospital of Wenzhou Medical University the First People's Hospital of Taizhou City， Zhejiang Province， Taizhou 318020， China

[Abstract] Objective To investigate eIF-4E expression in patients with non-small cell lung cancer （NSCLC）， and its correlation with prognosis. Methods Tumor tissues were collected from 60 NSCLC patients who underwent surgical resection from January 2009 to December 2010 in the Affiliated Huangyan Hospital of Wenzhou Medical University， and 30 adjacent normal tissues samples were also collected. The expression level of eIF-4E in NSCLC tissues and adjacent normal tissues were measured by immunohistochemical method. All the NSCLC patients after resection were subject to treatment with elemene plus cisplatin for more than 2 weeks. A systematic follow-up evaluation was also performed to investigate the correlation of eIF-4E expression level with disease-free survival （DFS） and overall survival （OS）. Results The expression rate of eIF-4E in the tumor tissues （80.00%） was significantly higher than that in adjacent normal tissues （33.33%）， the difference was statistically significant （P < 0.01）. The eIF-4E high expression rate of the patient with age≥60 years and clinical stage of Ⅲ-Ⅳ was higher than whose age<60 years and clinical stage ofⅠ-Ⅱ， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The DFS and OS values of patients with low eIF-4E expression level were significantly larger than those of patients with high eIF-4E expression level， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion eIF-4E is highly expressed in NSCLC tissues; the DFS and OS values of patients with low eIF-4E expression level are significantly larger. High eIF-4E expression level may be an independent predictor of poor NSCLC prognosis.

[Key words] eIF-4E gene; Expression; NSCLC; Prognosis

作者：赵领洲，张玉梅，魏艳萍，李健学

作者：晁晓东,费舟,张磊,李娟,仝武军

【摘要】目的：克隆大鼠谷氨酸转运蛋白3（EAAT3）的cDNA，构建其真核表达载体并转染Hella细胞.方法：从大鼠的脑组织中提取RNA,采用RTPCR技术扩增EAAT3的基因编码区序列,将序列定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+).经酶切及测序鉴定后用阳离子脂质体将其转染到Hella细胞中，通过免疫印迹法鉴定其表达.结果:经双酶切、测序鉴定证实EAAT3基因的真核表达载体构建成功.免疫印迹法证实EAAT3基因的表达.结论:成功克隆了EAAT3编码区序列,并构建了其真核表达载体,为以EAAT3为基础的中枢神经系统疾病的治疗奠定了基础.

【关键词】载体蛋白质类;谷氨酸;真核表达载体

0引言

通常认为，细胞外液中没有使谷氨酸（Glu）失活的水解酶系统.对从神经末梢释放出来的Glu的清除和失活的唯一途径是通过位于突触前膜和神经胶质细胞膜上的兴奋性氨基酸转运体(EAAT)的摄取而实现［1］.目前，已克隆了5种EAAT［2］，分别是EAAT1，EAAT2，EAAT3，EAAT4和EAAT5.EAAT3主要分布在中枢神经系统海马结构的CA1CA4区的锥体细胞层、齿状回、小脑的颗粒细胞层及大脑皮质的ⅡⅣ［3］.最近研究证明EAAT3与主要的神经系统疾病，如肌萎缩性侧束硬化症、阿尔兹海默病、帕金森病、癫痫、脑缺血、外伤性脑损伤和精神分裂症等有关，但具体机制尚不清楚.我们通过对大鼠EAAT3基因进行扩增、克隆及序列分析,为研究和防治由于EAAT3功能紊乱而导致的中枢神经系统疾病奠定基础.

1材料和方法

1.1材料成年雄性SD大鼠1只，体质量350g，由第四军医大学实验动物中心提供；真核表达载体pcDNA3.1(+)（Invitrogen公司）；感受态大肠杆菌TOP10，pGEMTeasy试剂盒（Promega公司）；Trizol及lipofection2000（Invitrogen公司）；QuantscriptRTKitcDNA第一链合成试剂盒、TaqPlusDNA聚合酶、DNA凝胶回收试剂盒及DNA提取试剂盒（TIANGEN公司）；限制性内切酶XhoⅠ，EcoRI及T4DNA连接酶（TaKaRa公司）；EAAT3抗体（美国Santacruz公司）；其它试剂为进口或国产分析纯试剂.

【摘要】 本文就开展制作真核细胞亚显微结构模型比赛活动作了简要介绍， 并在总结和反思活动的基础上阐述了本次活动对高中生物学教学的几点启示。即要充分认识到开展生物学实践活动的意义及其必要性，积极组织学生开展相关学习生物学的活动，并从中激发学生学习生物学的兴趣和培养学生的创造能力，帮助学生牢固构建生物学的有关知识，充分体现探究性学习和互助合作性学习的优势。

【关键词】 制作真核细胞亚显微结构模型 活动启示

【中图分类号】 G633.91 【文献标识码】 A 【文章编号】 1674-4772（2013）08-023-01

为了培养学生学习生物学知识的兴趣，以及进行合作探究学习的能力，我校在2012级高一学生中开展了制作真核细胞亚显微结构模型的比赛活动。通过本次活动不仅激发了学生学习生物学知识的兴趣性，还取得了课堂教学中无法达到的良好效果。现将活动情况及受到的启示分述如下：

一、选择合适时机开展制作真核细胞亚显微结构模型比赛活动

由于用普通光学显微镜无法观察到真核细胞的亚显微结构，因此在课堂教学中教师通常利用多媒体图片展示真核细胞的亚显微结构进行教学，学生通过此类教学也只能初步了解真核细胞的亚显微结构，许多学生对真核细胞亚显微结构的认识较为模糊。为此，我们参照高中生物课程标准中相关活动的建议，积极组织学生开展了制作真核细胞亚显微结构模型的活动，并进行了评比和展示。目的是让学生通过本次活动巩固所学知识，提高合作探究学习能力和动手制作的能力，培养学习生物学的兴趣。

在本次活动前，我们系统进行了真核细胞结构和功能知识的教学，为学生奠定了一定的真核细胞亚显微结构知识基础。之后安排学生利用假期时间制作真核细胞亚显微结构模型，并组织学生作品参加比赛。不到一个星期的时间我们就收到了来自全年级的150多件作品，之后我们又继续发动学生增做作品和修正完善作品，于是在后一个星期中我们又收到了80多件参赛作品和一些经过完善修正的作品，本次活动共收到参赛作品236件，据初步统计，全年级参与制作模型的学生约占98%，较好地体现了活动的全体参与性。

对于学生的参赛作品，我们积极组织生物教师认真评比，共评出：一等奖作品5件、二等奖作品6件、三等奖作品10件、优秀作品奖16件。之后我们又从未获奖的作品中选出20多件作品连同获奖作品一起在校园内显著位置进行展示，并连续展出了两天，期间学校高一到高三的学生，乃至许多教师都饶有兴趣地参观了学生的作品。

【关键词】STARD7;载体构建;转染

doi:10.3969/j.issn.1006-1959.2010.05.010 文章编号:1006-1959(2010)-05-1035-02

SATRD7是一编码295个氨基酸残基,分子量为34.7kDa的新型蛋白质,其生物学功能至今未明。通过生物信息学分析,发现其全长序列中含有一个类固醇敏感性调节蛋白(StAR)相关脂类转运体结构域(START)。START涉及脂类结合介导的细胞信号转导、脂类转运和调节。START发生突变或错误表达与基因错配、自身免疫性疾病以及肿瘤相关。为了研究STARD7基因过表达后对肿瘤细胞生物学的影响,我们将STARD7基因克隆构建到真核表达载体上,并稳定转染到HEPG1*2肝癌细胞中。

1.材料和方法

1.1 材料:大肠杆菌DH-5α和人肝癌细胞系HepG1*2均由本实验室保存,pMD18-T载体购自大连宝生物工程有限公司,M-MLV逆转录酶购自Promega公司,各种分子克隆工具酶购自MBI公司,脂质体Lipofectamine2000、Trizol试剂、G418和pcDNA3.1(-)真核表达载体购自Invitrogen公司,RPMI1640、胎牛血清(FBS)等购自GIBCOBRL公司。

1.2 方法。

1.2.1 HepG1*2总RNA的提取。按照Trizol试剂说明书步骤提取总RNA。收集所培养的HepG1*2,加TRIZOL试剂1mL,静置3~5min。加入氯仿0.5ml,混匀。室温静置2~3min后,12000r/min离心15min。于上清中加人0.5ml异丙醇,室温静置10min。10000r/min离心10min。弃上清,加入750ml/L乙醇1ml,7500r/min离心5min,干燥沉淀,加入30μL DEPC处理水。经琼脂糖凝胶电泳显示无降解后,用紫外分光光度计测定其纯度并定量,保存于-80℃备用。

1.2.2 引物设计。根据GenBank的基因序列(NM_064536),设计扩增STARD7编码区cDNA上、下游引物。上、下游引物中分别引入SamⅠ、Xhol酶切位点,扩增片段为880bp。上游5' CTCGAGATGGCGGCGTTAGCC 3',下游5' CCCGGGAGCATACTCAATC 3';内参照β-actin的引物序列为:上游5' TGTGACGTGGACATCCGCAAAG 3',下游5' TGGAAGGTGGACAGCGAGGC 3',扩增片段为206bp。并设计作为转染HepG1*2细胞后鉴定用的G418抗性基因PGK neo的特异性引物:上游5'-AGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTG 3',下游5'-AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG 3',扩增片段为492bp。所有引物均由Invitrogen公司合成。

【摘要】 目的：构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1，检测人子宫内膜癌HEC细胞转染pcDNA3.1-Beclin1后，外源性基因Beclin1在蛋白水平的表达，并观察其对HEC细胞增殖的影响。方法：通过RT-PCR和T/A克隆等方法，构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1，并通过脂质体介导的方法将外源性Beclin1基因导入人类子宫内膜癌细胞株HEC中，通过实时PCR检测转染后Beclin1在HEC中表达的情况，并设立实验组（转染pcDNA3.1-Beclin1真核载体）、空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、空白脂质体对照组，用Western blot法检测子宫内膜癌HEC细胞中Beclin1的表达情况，MTT法检测Beclin1对HEC细胞体外生长的影响等，研究Beclin1基因与子宫内膜癌的关系。结果：经限制性内切酶鉴定及测序，证明Beclin1基因真核质粒的序列完全正确，将其转染HEC细胞，转染后的HEC细胞在体外能继续增殖，但增殖能力明显下降。结论：Beclin1基因pcDNA3.1-Beclin1真核表达载体构建成功，并能在HEC细胞中表达，转染HEC细胞体外增殖能力明显降低，Beclin1基因用于子宫内膜癌基因治疗具有重要靶向价值。

【关键词】 Beclin1； 真核表达载体； 细胞； 增殖

子宫内膜癌（EC）是仅次于乳腺癌和宫颈癌的常见女性生殖系统恶性肿瘤，占女性生殖系统恶性肿瘤的20%～30%[1]。其发病率每年10万人约有24.6人，在我国近二十年来也呈逐年上升趋势，但其发生、发展机理仍不十分明确。多数学者认为其发生发展与雌激素水平密切相关[2]。长期无拮抗的雌激素刺激可能是主要发病因素，在实验动物中可观察到雌激素引起子宫内膜有丝分裂增多的现象。

Beclin1是一种与自噬相关的抑癌基因，位于人染色体17q21上，在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌中该部位均存在缺失。有研究提示Beclin1的表达缺失导致自噬活性的减弱从而促进肿瘤的发生，故Beclin1在雌激素依赖性肿瘤子宫内膜癌的发生发展中起着重要的作用。因此，本研究旨在构建Beclin1真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1，建立稳定表达Beclin1的细胞株，探讨Beclin1在子宫内膜癌细胞增殖中的影响，以期对子宫内膜癌基因治疗提供科学的依据，对内膜癌的发生发展关系的研究能进一步深入奠定实验基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 高效真核表达载体pcDNA3.1质粒购自Oligoengine公司；G418和Lipofectamine2000购自Invivogen公司；BglⅡ、EcoRI、Hind Ⅲ、T4DNA链接酶、TaqDNA聚合酶和DL2000DNA分子量标记购自北京天根生物有限公司；琼脂凝胶回收试剂盒、质粒提取纯化试剂盒、RNA抽提及逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒购自Fermentas公司，兔抗人Beclin1多克隆抗体购自大连宝生物公司，所有DNA序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；人子宫内膜癌细胞HEC-1-B购自中国医学科学院上海细胞库，实验涉及各种酶类为NEB产品，嘌呤霉素为sigma产品，胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物制品公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计和子宫内膜细胞Beclin1基因扩增 在NCBI数据库中查找Beclin1的mRNA全序列，基因编号NM003766；根据其cDNA全长序列，参照国际流行标准，利用Invivogen公司的在线软件进行设计，选取编码区两侧的碱基合成相应的引物。上游引物序列（上游）5′-ATCCTGGACCGTGTCACCATACAGT-3′，（下游）5′-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGT-3′，分别含有EcoRI、Hind Ⅲ酶切点位，目的片段为326 bp。按T/A克隆操作规范，参照Trizol试剂盒说明书提取人子宫内膜癌细胞株HEC总RNA，利用蛋白核酸分析仪测定RNA纯度及浓度，通过1%琼脂糖电泳鉴定RNA完整性；取300 ng总RNA，根据RT-PCR试剂盒说明进行逆转录合成Beclin1DNA；PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min、55 ℃退火1.5 min、72 ℃延伸0.5 min，共30个循环，最后72 ℃再延伸6 min终止。取PCR最终产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，切取326 bp目的片段凝胶，利用试剂盒回收纯化目的片段。

摘要：目的：研究HPV18 E2及其N端(TAD)、C端(DBD)与GFP融合蛋白在巨噬细胞（MΦ）内的表达与定位。方法：将真核表达载体pEGFP-C1/E2、pEGFP-C1/TAD和pEGFP-C1/DBD及pEGFP-C1分别转染MΦ，48h后用倒置荧光显微镜观察荧光情况，以确定GFP及融合蛋白的表达；以抗GFP抗体为一抗作Western blot检测相应蛋白质的表达。结果：在荧光显微镜下，4种质粒转染的细胞，pEGFP-C1组细胞内均有荧光；pEGFP-C1/E2组荧光主要在细胞核，但细胞浆也有；pEGFP-C1/DBD仅在细胞核有荧光，pEGFP-C1/TAD仅在细胞浆有荧光。Western blot检测到GFP-HPV18 E2及其突变体融合蛋白在细胞内的表达。结论：GFP-E2及其突变体融合蛋白均能在巨噬细胞内表达，且GFP-E2主要定位于细胞核，GFP-DBD定位于细胞核内，GFP-TAD定位于细胞浆。

关键词：人瘤病毒18型；E2蛋白；定位

中图分类号： R373.9 文献标识码： A 文章编号： 1008-2409(2007)06-1188-02

Expressionand localization of GFP-HPV18 E2 and its mutants fusion proteins in eukaryotic cells/CHEN Chun-lian, WAN Yan-ping, PENG Jun//The Affiliated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 541001, China

Abstract:Objective:To study expression and localization of GFP-HPV18 E2 and its TAD or DBD fusion proteins in macrophages. Methods:The plasmid of pEGFP-C1/ E2, pEGFP-C1/TAD, pEGFP-C1/DBD or pEGFP-C1 was transfected into macrophages，respectively. Their expression and localization were observed with fluorescent microscope. Western blot was used to analyze GFP or its fusion proteins by the anti-GFP antibody as the first antibody.Results:Fluorescence could be observed in the whole cells transfected by pEGFP-C1, mainly in the nuclei of the cells transfected by pEGFP-C1/E2, but only in the nuclei of the cells transfectedby pEGFP-C1/DBD while only in the cytoplasma of the cells transfected by pEGFP-C1/TAD. Western blot showed that the expression of GFP, GFP-E2, GFP-DBD, GFP-TAD fusion proteins. Conclusion:GFP-HPV18 E2 and its mutants could express in macrophages. GFP-E2 fusion protein locate mainly in nuclei, while GFP-DBD fusion protein locate completely in nuclei and GFP-TAD fusion protein locate completely in cytoplasma.

Key words:HPV18; E2; localization

人瘤病毒（human papillomavirus，HPV）18型(HPV18)属高危型，可引起重度不典型性增生，甚至恶性肿瘤[1]。HPV18早期基因区编码的E2蛋白由365个氨基酸(amino acid,aa)组成，分为N端转录活化结构域（transactivation domain,TAD）和C端DNA结合域（DNA-binding domain,DBD），前者有206aa，后者有80aa；两者中间为可变的铰链区（hinge），有79aa[2]。E2蛋白既调节病毒的转录又调节病毒的复制，且通过多种途径影响细胞增殖。巨噬细胞（macrophage, MΦ）是机体抗肿瘤免疫中的重要效应细胞。HPV 感染后，在真皮基质可检测到大量的MΦ[3]。本研究报道GFP-HPV18 E2及其突变体融合蛋白真核表达载体转染细胞后，在细胞内的表达与定位情况。

1 材料和方法

[摘要] 目的 构建PDCD5基因真核表达载体，并电转染BGC823细胞，获得稳定转染细胞。 方法 设计合成PDCD5基因片段，将其插入经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3.1+表达载体，菌落PCR和基因测序进行鉴定。重组质粒电转染BGC823细胞，G418筛选数周后PCR鉴定稳定转染细胞。 结果 重组质粒经菌落PCR测序分析表明，PDCD5基因序列准确插入预期位置，且序列正确。重组质粒成功电转染BGC823细胞，并整合入细胞基因组DNA。结论 成功构建了PDCD5基因真核表达载体，并整合进BGC823细胞基因组，为研究PDCD5基因的功能及胃癌的基因治疗提供实验基础。

[关键词] PDCD5基因；pcDNA3.1+表达载体；电转染；BGC823细胞系

[中图分类号] R394 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）06-0033-03

[Abstract] Objective To construct eukaryotic expression vector of PDCD5 gene and transfect BGC823 cells to obtain stable transfected cells. Methods The PDCD5 gene fragment was designed and inserted into pcDNA3.1+ expression vector which was digested with EcoR Ⅰ and Xho Ⅰ. Colony PCR and sequencing were used for identification. The recombinant plasmid was electrically transfected into BGC823 cells， and PCR was used for identifying the stably transfected cells after G418 screening for weeks. Results It was suggested by colony PCR and sequencing analysis that the recombinant plasmid PDCD5 gene sequenc was accurately inserted into the desired position and the sequence was correct.Recombinant plasmids were successfully transfected into BGC823 cells and integrated into cell genomic DNA. Conclusion The eukaryotic expression vector of PDCD5 gene is successfully constructed and integrated into BGC823 cell genome， which provided experimental basis for studying the function of PDCD5 gene and gene therapy of gastric cancer.

[Key words] PDCD5 gene； pcDNA3.1+ expression vector； Electrical transfection； BGC823 cell line

程序性细胞死亡因子5（programmed cell death 5，PDCD5）原名为TFAR19，由北京大学人类疾病基因中心从白血病细胞株TF-1细胞中克隆得到，具有促进多种细胞凋亡和抑制增殖的效应，其异常表达与多种肿瘤及自身免疫性疾病有相关性[1]。研究表明，PDCD5基因在胶质瘤细胞[2]、前列腺癌细胞[3]、结肠癌[4]和胃癌[5]等多种恶性肿瘤组织中较正常组织表达水平下降，并且重组人PDCD5蛋白可以增强软骨肉瘤细胞[6]和肺癌细胞[7]等肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其5年生存率低于20%，是全球第二个癌症死亡相关的原因，而我国每年因胃癌死亡病例占全球人口的47.8%[8]。本研究以PDCD5基因和BGC823胃癌细胞为研究对象，构建pcDNA3.1+-PDCD5重组真核表达载体，电转染BGC823细胞，并筛选稳定转染细胞株，为进一步研究PDCD5基因的功能及进行胃癌的基因治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

【摘要】

目的: 构建大鼠il-10基因的真核表达载体, 观察其在大鼠肝细胞系brl中的表达, 比较有无受体介导的脂质体的转染效率。方法: 抽提外周血单个核细胞的总rna, 通过rt-巢式pcr方法获得大鼠il-10的全长编码序列, 定向克隆到真核表达载体pcdna3.0, 并进行限制性内切酶酶切及测序鉴定。将重组质粒分别通过脂质体transfasttm与去唾液酸糖蛋白受体介导的脂质体peijet-gal转入大鼠肝细胞系brl, 通过rt-pcr方法检测il-10 mrna的表达, 比较二者的转染效率, 用elisa法检测后者分泌型il-10的表达。结果: 经酶切及测序鉴定证实, 重组质粒插入片段与大鼠il-10的全长编码序列完全相符。发现受体介导的脂质体peijet-gal转染效率明显高于非受体介导的脂质体transfasttm 。通过受体介导的脂质体转染, brl细胞获得高水平的il-10表达。结论: 成功地构建pcdna3.0-il-10重组质粒。受体介导的脂质体对肝细胞有较高的转染活性, 可能成为il-10基因治疗肝纤维化的有效转染载体。

【关键词】 白细胞介素-10 基因治疗 去唾液酸糖蛋白受体 肝细胞

construction of eukaryotic expression plasmid containing rat interleukin-10 gene and its expression in brl cells in vitro

chen yun-xin, huang yue-hong, chen zhi-xin, zheng wei-da, wang xiao-zhong*

department of gastroenterology, union hospital, fujian medical university, fuzhou 350001, china

［abstract］ aim: to construct eukaryotic expression vector of rat il-10 gene and observe its expression in hepatocyte cell line brl. methods: total rna was extracted from rat peripheral blood mononuclear cells. the full length coding region of il-10 was amplified by rt- nested pcr and cloned into eukaryotic expression vector pcdna3.0. the recombinant plasmid was transfected into brl cells with either liposome transfasttm or asialoglycoprotein receptor mediated liposome peijet-gal respectively. the expression of il-10 mrna was detected with pcr and that of il-10 secreted from brl cells transfected by liposome peijet-gal was detected with elisa. results: the recombinant plasmid was identified and confirmed with digestion of restriction endonuclease and dna sequencing. receptor mediated liposome peijet-gal exhibited significantly higher transfection efficiency than liposome transfasttm and higher level secretory il-10 expressed in brl cells. conclusion: the eukaryotic expression vector of il-10 gene was successfully constructed. asialoglycoprotein receptor-mediated liposome had high transfection efficiency on hepatocytes, suggesting that it could be a potential hepatocyte-targeting delivery system for il-10 gene therepy.

［keywords］interleukin-10; gene therapy; asialoglycoprotein receptor; hepatocyte