鱼精蛋白范文精选

【关键词】 体外循环；抗凝；鱼精蛋白

肝素抗凝是体外循环（extracorporeal cirulation，ecc）必不可少的条件，而ecc结束后又必须用鱼精蛋白中和肝素的抗凝血作用。鱼精蛋白作为中和肝素的药物，目前尚无更好的替代品。但在使用鱼精蛋白的过程中，常常出现一些毒性反应和过敏反应。对于这些反应的原因和处理方法，有过很多相关的研究和报道［1-3］，但是鱼精蛋白不能中和肝素的病历报道却十分罕见。

1 资料与方法

1.1 临床资料 患者男性，22岁，44 kg。术前诊断为“先天性心脏病，法洛四联症”，超声心动图示：室间隔膜周部回声中断20 mm，主动脉骑跨率为50%，右室流出道肌性狭窄，内径为4～5 mm，右室前壁明显增厚，室间隔运动异常。肺动脉主干16mm，左右肺动脉内径分别为11 mm和12 mm。术前血气分析示：pao2 35.1 mmhg，sao2 71.1%；血常规示：红细胞8.52×1012/l，血红蛋白256 g/l，血小板134×109/l；凝血酶原时间活动度15.1%，凝血酶原时间为31.0 s；肝功能：谷丙转氨酶100 u/l，谷草转氨酶139 u/l。肾功能正常，乙肝六项检查全阴。

1.2 ecc过程 采用jostra-20滚压泵，膜式氧合器（东莞科威），人工超滤器（宁波），预充乳酸林格氏液2200 ml，20%甘露醇100 ml，血浆450 ml，抑肽酶200万单位，20%白蛋白50 ml。ecc中追加乳酸林格氏液1000 ml，5%碳酸氢钠150 ml，超滤2000ml。降温至鼻咽温28.8℃。停机后，机器余血500 ml全部装瓶静脉点滴。

1.3 肝素化和鱼精蛋白中和方法 ecc前测act（美敦力-ⅱ监测仪）生理值126 s，全身肝素化，首次肝素剂量4 mg/kg，共176 mg。首次肝素后10min测act值为900 s，建立ecc。转机后90 min测act值999 s，超过机器值部分未记录在内。

停机后鱼精蛋白按1∶1拮抗肝素，首次鱼精蛋白剂量按常规4 mg/kg，共176 mg。见无血凝块后追加鱼精蛋白30 mg，同时测act值为999 s。然后分两次追加鱼精蛋白20 mg和40 mg，测act值仍为999 s。停止追加鱼精蛋白，放置心包及纵隔引流管，关胸。

2 结 果

近日，有媒体报道称用于治疗心脏病的手术必用药鱼精蛋白在全国多地出现供应短缺甚至断货。针对这一情况，国家卫计委回应称，预计5月底前后即可向市场供货。据介绍，因鱼精蛋白药典标准修订，企业自2015年底暂时停产，并从市场上召回了相关批次药品，导致暂时性供应短缺。另外，考虑到鱼精蛋白近些年来一直整体供货紧张，经常发生短缺，近期，工信、卫生计生、发改、药监4部门将包括鱼精蛋白在内的9个药品纳入了2016年临床必需、用量小、市场供应短缺药品的定点生产试点工作，并已于4月29日开始公开招标生产企业……（5月11日《京华时报》）

人们对于鱼精蛋白也许并不陌生。2011年下半年，鱼精蛋白在全国多省市缺货。北京部分医院非紧急手术只能临时叫停，就连北京安贞医院、中国医学科学院阜外医院这样的“用药大户”，也被迫到用量相对较小的医院去调剂用药。哪知5年过去，救命的鱼精蛋白依然还缺货。

鱼精蛋白是开展心脏外科手术等必须备用的药品，现在只有上海第一生化药业有限公司和北京悦康凯悦制药有限公司两家药品生产企业可以生产。事情看似并不复杂：鱼精蛋白是从鱼类新鲜成熟中提取的一种碱性蛋白质的硫酸盐。因为定价偏低，其生产积极性可想而知。问题恰恰出现在两个层面：第一，此药既然没有可替代性，又属于救命的基础用药，“特殊保障机制”面临着严峻考验！市场不是万能的，价格调节更不是零风险的，明知断供有生命危险，公共责任为何不能兜底呢？第二，鱼精蛋白“断供”无论是涨价前的“逼宫”，抑或是“技术攻关”的症结，既然5年前就上演过此般“险情”，相关部门为何迟迟未能做出改进？

当微信朋友圈在慨叹“长效青霉素仅剩两药企生产”的时候，实际上，更多知名或不知名的廉价药，早就杳无音讯了。今年年初据媒体报道，受原材料价格急剧上涨、利润不足等因素影响，西地兰、注射用红霉素、潘生丁等多种供应数十年的基本药物，正逐渐从市场上消失，患者只能用其他高价药替代。一项对全国12个城市40余家三甲医院临床用药情况的抽样调查显示，国家和地方增补的基本药物有500多种，其中有342种短缺……

便宜药不长命，似乎是情理中的事。成本翻倍，定价却束手束脚，亏本买卖自然没人愿做。有疗效，无“钱”途，劣币驱逐良币，廉价药自然就死在过于廉价这一症结上。

有人说，只有政府、药企和医院三方博弈后找到市场平衡点，“药价高杀人、药价低要命”的乱象才会终结。但愿这一回等着救命的病患，不再需要等待漫长无期的“若干年”！

Protamine deficiency

鱼精蛋白缺货，心脏难以承受之痛

近日，鱼精蛋白在全国范围内的缺货，让各大医院纷纷面临“无米下锅”的窘境。

对于这种状况，阜外心血管病医院心脏外科副主任医师孙宏涛向记者解释说，许多心脏外科手术需要在心脏停跳的情况下进行，这类手术需要用到一种体外循环机，暂时代替人的心脏工作，进行血液循环。但机器毕竟是机器，血液一旦流出就会凝固，容易形成血栓，因此，手术需要用一种被称作肝素的抗凝剂来稀释血液。而在手术最后，患者需要迅速止血，否则将无法下手术台，鱼精蛋白正是有抗凝血作用的一种药物。

据了解，早在1870年，科学家就发现了这种从鱼的头部巢中分离出来的碱性蛋白，截至目前，鱼精蛋白还不能化学合成，这也在一定程度上限制了它的产量。不过，孙宏涛表示，鱼精蛋白缺货的根源显然不是官方回复的是因为从国外进口的一批原料经检测不合规而退货，生产原料问题的不足，导致鱼精蛋白产量减少、甚至停产。他说，长期以来，鱼精蛋白的定价就不高，药厂利润微薄，生产积极性自然不高。

在孙宏涛看来，药价虚高的确是老百姓看病贵的一个原因，国家应该加大力度，打击药品价格的飙升。但同时，也应该清楚地看到，一方面，药品价格的飙升主要是在流通领域发生的，药品经销商的层层转包、层层加价是其根本问题。国家应有的放矢，擒贼先擒王。另一方面，对于药价的打压不能一刀切，像这样关系民生、但价格低廉的必需药品，国家物价部门应将政策有所倾斜，网开一面。而且，这样药品的生产应该像军需品的生产一样，纳入国家强制要求生产的范畴，合理提高药品价格，既满足民生需要，也保证生产厂家的合理利润。 文/记者胡珉琦

Underground pipeline management

北京普查城市地下“生命线”

由于价廉无利，厂家拒产，医院买不到心脏病手术所必需的鱼精蛋白，问题发展到了不得不“高度重视”的程度。呼吁政府加强管制，保障供应的声音再起。可实际上，如果鱼精蛋白仍然无利可图，短缺现象肯定还会重现，这起事件无非再一次说明，在市场经济中，失败是管制的必然结局。

放眼看去，当今社会关于政府加强管制、监管或规制的言论比比皆是。许多经济学家认为，自由竞争的市场不可能做到商家的个别利益与消费者利益以及社会利益完全一致。由于自发形成的价格，没有也不可能完全反映商业活动的社会成本，所以仅仅依靠价格机制，不能完全消除企业和私人行为带来的负面“外部效果”。这些所谓的“市场失败”是如此严重，以至于有了普通法、宏观调控和反托拉斯法还不够，非要政府对企业活动做出直接干预不可。这些解释为政府实行管制提供了系统的理论根据。

可实际上，随着市场范围的扩大、分工深度的提高和交易活动的高度复杂化，对政府管理经济提出越来越高的要求。管制的知识专业化，以及由此产生的大量“管制专家”，既是分工的结果，也是产生更复杂管制结构的原因。像市场里任何专业化分工一样，管制专家总是倾向于能够使他们的专家知识增值的管制体制。但管制专业知识的“买方”只有政府一家，缺乏市场竞争的筛选和淘汰。管制常常声称是为了社会利益，为了保护消费者和全社会免遭企业营利性活动可能产生的损害，但实际上，“为消费者谋福利”旗号下的管制往往出自政府的“政绩冲动”和“权力扩张偏好”，其结果也往往是损害了消费者利益。

正如价格管制是淡季电荒的根源，同理，价格管制亦是鱼精蛋白短缺的根源。政府强制企业开工生产只是临时措施，无法长久。提价也许是最直接、最简单的办法，但显然不为公众所欢迎，而且提价也不能一劳永逸，在高通胀持续的背景下，过段时间可能又会出现无钱可赚而减产停产的情况。

当然，也有人提出，政府对鱼精蛋白等利润太薄的必需药品进行补贴，从而激发厂家生产和销售的积极性。然而，是补生产方还是补消费者？补贴标准如何定？其他药品怎么办？都要补贴，政府补得起吗？价格是市场上最有力的杠杆，它可以最有效地配置资源、调节供求。如果行政力量强行压制价格，就会扭曲市场信号、导致供应短缺，这一规律在鱼精蛋白上再次得到了印证。

近年来，国家发改委先后数十次降低了上万种药品的价格，但大多数降价的药品很快就从市场上消失，患者的医疗负担不但没有减轻反而还在增加，这也早已证明价格管制在市场上是无效的。除了市场机制，恐怕没有其他既能保障供给、又能让价格合理的长效机制。

《价格法》规定：“与国民经济发展和人民生活关系重大的极少数商品价格”，“在必要时可以实行政府指导价或者政府定价”，这是药品实行政府定价的法律依据。可是，真有这种“必要”吗？要说“与国民经济发展和人民生活关系重大”，粮食比药品有过之而无不及，既然粮食可以市场化，药品为什么不可以呢？

如果药品生产及销售实行市场化，鱼精蛋白价格必将有所提高，但这种提高是合理的，公众应该予以接受。市场具有发现价格的机制，只要竞争公平而充分，效率就能提高，成本就能降低，价格就会趋于合理。政府所要做的，是在维护市场秩序的同时，不断提高社会医疗保障水平。

作者：陈锐，杨洁，张芳琳，秦炜炜，王涛，张瑞，孟艳玲，胡刚，徐志凯，杨安钢

【摘要】 目的：构建汉坦病毒（hantavirus， hv）单链抗体/鱼精蛋白片段融合蛋白1a8 scfv/cκ/p基因的原核表达载体，蛋白经表达后纯化并进行1a8 scfv/cκ/p融合蛋白的功能活性鉴定. 方法 ：采用pcr的方法，扩增单链抗体基因1a8 scfv和1a8 scfv/cκ，将鱼精蛋白片段的编码序列设计入扩增引物，获得hv单链抗体/鱼精蛋白片段的融合蛋白基因1a8 scfv/cκ/p. 将获得的重组基因克隆入原核表达载体pet32a，并在大肠杆菌bl21中表达. 表达产物经sds?page和western blot鉴定，用ni?nta螯合层析介质进行纯化. 采用elisa方法 分析 1a8 scfv/cκ/p融合蛋白与hv抗原的结合活性，凝胶迁移阻滞实验检测1a8 scfv/cκ/p融合蛋白与质粒dna的结合活性. 结果：成功构建了hv 1a8 scfv/cκ/p融合蛋白基因的表达载体，在大肠杆菌中实现了可溶性表达. 通过功能活性测定，纯化的1a8 scfv/cκ/p融合蛋白既保持了与hv抗原的结合能力，同时又具有与核酸的结合活性. 结论：构建和表达的hv 1a8 scfv/cκ/p融合蛋白具有hv抗原结合活性和dna结合的活性.

【关键词】 汉坦病毒; 单链抗体; 鱼精蛋白; 融合蛋白; 靶向输送

0引言

选择性地转移基因到体内各种类型细胞和器官，可以对人类疾病尤其是肿瘤和病毒感染性疾病进行靶向 治疗 ［1］. 鱼精蛋白（protamine，p）是一种碱性蛋白，截短至22个(8～29)富含碱性氨基酸片段仍然保留着核酸结合功能. 单链抗体（single chain，scfv），分子小，穿透力强，免疫原性低，有导向载体功能. 我们构建和表达一种由汉坦病毒（hantavirus，hv）白的单链抗体（1a8 scfv）和鱼精蛋白片段组成的融合蛋白1a8 scfv/cκ/p， 以期获得具有抗原结合活性和核酸结合活性的1a8 scfv/cκ/p融合蛋白.

1材料和方法

1.1材料1a8vh?lgl/w6e和3g1vh?lalckgshis 质粒、vero?e6细胞、汉坦病毒76~118株(第四军医大学微生物教研室)；pet32a载体，大肠杆菌dh5α，bl21(de3)，（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室）；限制性内切酶、连接酶（takara公司）；iptg（promega公司），质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒（合肥优晶生物技术有限公司）；hitrap ni?nta螯合层析介质(invitrogen公司)；hrp?6 his tag antibody（abcam公司）；ecl化学发光试剂盒、bca蛋白定量试剂盒（pierce公司）.

1.2方法

doi：10.3969/j.issn.1007-614x.2013.20.13

摘 要 目的：观察小量预注法预防鱼精蛋白毒性反应的临床效果。方法：心内直视手术200例，体外循环结束，随机分为两组，每组100例：鱼精蛋白中和肝素时预注法（A组）从中心静脉注入0.2mg/kg的鱼精蛋白，3分钟后再缓慢注入其余量，给药过程中发生鱼精蛋白毒性反应时暂停给药，待毒性反应缓解后继续给药，与鱼精蛋白首次注入量1mg/kg的对照组（B组）比较临床效果。结果：B组发生毒性反应的时间早于A组，两组差异有统计学意义（P0.05）；Pmax升高的程度B组明显大于A组，差异有统计学意义（P

关键词 心内直视手术 体外循环 肝素 鱼精蛋白 毒性反应

鱼精蛋白作为心血管术中和肝素抗凝作用的主要用药，在临床应用广泛，但鱼精蛋白引起的毒性反应常常危及患者的生命安全，增加临床治疗的难度。本文分析小量预注法预防鱼精蛋白毒性反应的临床观察，探讨预防鱼精蛋白不良反应的方法。

资料与方法

临床病例分组及方法：体外循环下心内直视手术患者200例，年龄6～75岁，其中男104例，女96例，肝素初始用量3mg/kg，经颈内静脉注入，维持ACT>600s，肝素追加量（U）为（600-实测ACT值）×体重（kg），中和量鱼精蛋白（mg）与肝素（mg）比例（0.8～1.5）：1，肝素1mg=125U。CPB结束、循环稳定5分钟左右，按鱼精蛋白静脉注入方法随机分为A、B两组，每组100例。小量预注法鱼精蛋白组（A组）：从中心静脉注入0.2mg/kg的鱼精蛋白，3分钟后再缓慢注入其余量，给药过程中发生鱼精蛋白毒性反应时暂停给药，待毒性反应缓解后继续给药；对照组（B组）：鱼精蛋白首次注入量1mg/kg。

观察指标：使用多功能监护仪监测SABP、DABP、CVP、HR、SPO2，机械通气参数TV 8～10ml/kg，10～14次/分，监测Pmax、Pmean、TV、PaO2、PETCO2。记录各组发生鱼精蛋白毒性反应的发生率（%），发生毒性反应距首次注入鱼精蛋白的时间、及发生毒性反应时SABP、Pmax的变化。

鱼精蛋白毒性反应标准：参照Oe及Weiler标准，将患者输注鱼精蛋白期间体循环动脉收缩压下降30mmHg确定为鱼精蛋白毒性反应，并排除输注鱼精蛋白后由于以下原因引起者：过度搬动或压迫心脏、出血、严重血容量不足、严重心律失常、严重酸碱平衡紊乱、严重电解质紊乱。

从2011年上半年开始，南京、武汉、南通等地鱼精蛋白纷纷告急，由于这个急救药的缺货，一些心脏手术不得不停做，医院和患者四处求药无门。国家药监局相关人士表示，目前的缺货状态下，除了协调企业进行生产，对于其他公司提出生产报批要求的，也会紧急办理，在流程上给予“绿色通道”支持。类似鱼精蛋白的低价紧缺药品并非个案，很多救命药都面临鱼精蛋白般的窘境。

“今天上午集团刚刚开了内部会议，部署了鱼精蛋白的生产和供应，预计接下来每个月供应可以提高到8万~9万只。”9月13日，上海医药总裁徐国雄表示。

被卷入“鱼精蛋白断货风波”的上海第一生化药业，是上药集团的全资子公司。从今年开始，第一生化药业与过去的原料供货商终止合作，原料供应的短缺直接导致市场上的鱼精蛋白供应告急，很多心脏病手术被迫停摆。

徐国雄告诉记者，目前全国有3家企业手握鱼精蛋白的生产批文，但另外2家两三年前就已经停止生产这个品种，目前全国只有上海第一生化一家还在供应。

独家生产供应告急

鱼精蛋白是从鱼类新鲜成熟中提取的一种碱性蛋白质的硫酸盐，用于因注射肝素过量所引起的出血及自发性出血，尤其对于心脏手术中采用了体外循环的患者而言，术后必须使用，且无其他药品可替代。

从2011年上半年开始，南京、武汉、南通等地鱼精蛋白纷纷告急，由于这个急救药的缺货，一些心脏手术不得不停做，医院和患者四处求药无门。

国家药监局相关人士表示，目前国内只有三家公司拥有鱼精蛋白的生产批文，分别是“上海第一生化药业有限公司”、“悦康药业集团北京凯悦制药有限公司”以及“多多药业有限公司”。目前的缺货状态下，除了协调这些企业进行生产，对于其他公司提出生产报批要求的，也会紧急办理，在流程上给予“绿色通道”支持。目前拥有鱼精蛋白生产批文的三家企业中，北京悦康药业集团已在药监部门的协调下开始生产。

【关键词】婴幼儿；心脏术；鱼精蛋白；不良反应

鱼精蛋白在体外循环心脏手术中是不可替代的药物，但在使用过程中不良反应时有发生。重度不良反应死亡率高、预后差。临床亦未找到满意的防治措施[1]。近半年来我院出现了两例婴幼儿心脏手术过程中严重鱼精蛋白反应并抢救成功，现报道如下：

1病例

例1：男，1岁7个月，8Kg，在全麻体外循环下行室间隔缺损修补术、卵圆孔缝闭术。体外转流停机并拔除腔静脉插管后，经静脉缓慢滴注鱼精蛋白32mg，5分钟后突然血压由90/55mmHg骤降至30/20mmHg，心率由140次/分减慢至60次/分，心腔空虚，心跳微弱呈蠕动状，心肌颜色变为暗红色，气道压力升高，气道中可以吸出大量淡血性痰液。立即心脏按压，再次肝素化，快速重新插入腔静脉管后建立体外循环，再次转流，并行左心引流。同时应用甲强龙，静脉应用肾上腺素、多巴胺、硝酸甘油等。4分钟后心率、血压逐渐回升。心肌颜色较前鲜红。心肌收缩力改善。经过420分钟的再次转流，心肌颜色鲜红，心脏收缩良好，心脏无过度充盈，心率、血压平稳。先减停左心引流后逐渐缓慢停止体外循环。心率、血压稳定。未再次使用鱼精蛋白中和肝素。延迟关胸，返回监护病房。术后16小时给予关胸。术后第4天脱呼吸机，术后第8天转入普通病房。痊愈出院。随访3月恢复良好。

例2：男，1岁6个月，10kg。在全麻体外循环下行室间隔缺损修补术、卵圆孔缝闭术，手术过程顺利，术后送ICU治疗。返回ICU15min后，突然出现心率减慢，血压下降，随之出现心室纤颤，立即给予胸外心脏按压，床旁开胸探查，见心脏充盈明显，心肌呈暗黑色，收缩无力，立即转入手术室迅速建立体外循环，再次转流，全流量辅助，并行左心减压。经过540分钟的辅助后，心脏收缩力有所改善，心肌颜色鲜红。缓慢停机后，延迟关胸，转入ICU治疗，经过积极的脏器功能维护、腹膜透析等治疗50小时后，顺利关胸。术后6天各脏器功能明显恢复，无明显神经系统并发症，转入普通病房。痊愈出院。随访6月恢复良好。

2讨论

鱼精蛋白是体外循环手术中和肝素的最常用药物，使用过程中毒性反应时有发生，严重的毒性反应死亡率高、预后差，已成为心脏直视手术中病人死亡的主要原因[2]。

2.1鱼精蛋白反应的临床分型1985年Horrow[3]将鱼精蛋白反应分为三型：I型：快速给药反应，动脉或静脉给药时所出现的短暂血压下降，对有低血容量和左心功能不全者更易发生。Ⅱ型：过敏样反应，可再分为A：过敏毒素反应，由抗原抗体反应所致；B：即刻过敏反应，由补体介导产生；C：迟发性过敏样反应，表现为非心源性肺水肿和全身广泛组织器官水肿，可在30s内发生，也可潜隐起病，死亡率亦很高，术前无法预测。Ⅲ型：灾难性肺血管痉挛反应，在少量鱼精蛋白注射后便可即刻发生，之前可无鱼精蛋白接触史，对有肺动脉高压和肺循环异常者尤易发生，推测此时病变的肺血管内皮合成前列腺素能力降低，不能抵抗血浆血栓素如的作用。此三型反应时常交叉存在无法截然分开。另外，国内学者方强等[2]将该毒性反应分为四种临床表现型：I型-低血压型；II型-过敏或类过敏型；III型-灾难性肺动脉高压型；IV型-延迟性非心源性肺水肿型。

文章编号：1009-5519（2007）13-2016-01中图分类号：R47文献标识码：B

自1999年以来，我院进行体外循环心脏手术52例。其中分别出现鱼精蛋白过敏6例，抑肽酶过敏3例，均经抢救治疗脱险，平安回病房。但同时出现鱼精蛋白和抑肽酶过敏仅1例。现分析如下：

1病例介绍

患者，女，52岁，二尖瓣置换术。患者按常规采用全身复合麻醉气管内插管，全身肝素化为3 mg/kg。预充液：复方氯化钠、甘露醇、碳酸氢钠、肝素等CPB前在预充液中一次性加入抑肽酶200 KIU。体外循环停止时用鱼精蛋白中和肝素，肝素与鱼精蛋白的比例为1∶1.5。

转流后动脉压快速下降为35 mmHg，转流中氧合器储血室液面短时间内快速下降为750 ml，红细胞压积呈动态性升高伴有皮肤潮红和皮疹，并同时出现室颤，考虑为抑肽酶过敏。心脏复跳后用鱼精蛋白中和肝素时再次出现血压下降，手术直视下见心率变慢变弱，心脏充盈扩张，考虑为鱼精蛋白过敏。立即给予扩容，适当提高灌注流量，降温，应用肾上腺素、钙剂、组织胺受体拮抗剂及皮质激素，减慢给鱼精蛋白的速度并电极除颤复律等多项措施后，血压逐渐恢复正常，氧合器液面逐步稳定。

2讨论

2.1体外循环手术中，由于同时应用的药物比较多，包括物、抗生素、抑肽酶、鱼精蛋白、血液制品及体外循环预冲液等，这些药物进入体内后往往成为新的抗原，若机体此前接受过同种的或化学性质相似的致敏原就会导致抗原抗体的相互作用而引起过敏。但引起过敏反应的主要为抑肽酶和鱼精蛋白。

2.2抑肽酶是一种天然的多肽丝氨酸蛋白酶抑制剂。它抑制纤溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶，既可阻断内源性凝血通路，又保护了外源性通路，既有血小板保护作用，又有全身抗炎作用，它能减少体外循环产生的炎性酶，增加抗炎细胞因子释放，大大减少失血量。但抑肽酶是生物制品易发生过敏反应，应注意观察及时处理。用药时最好在体外循环开始后使用并坚持先用实验剂量，待稳定后无异常反应再全部注入。

作者：王凯，温伟红，王涛，张瑞，秦炜炜，雷小英，杨安钢

【关键词】 HER2；,单链抗体；,鱼精蛋白

Construction and expression of human antiHER2 ScFv/Ck/tP fusion protein in E.coli and identification of its activity

【Abstract】 AIM: To construct a fusion protein gene of human antiHER2 ScFv/light chain constant region/truncated protamine (ScFv/Ck/tP) and analyze the binding activity of the expressed protein. METHODS: Two pairs of oligonucleotide primers were designed and used to amplify the ScFv and the Ck gene. After they were linked as ScFv/Ck, the synthesized tP coding sequence was added in the 3′ terminus of it, then the fusion protein gene ScFv/Ck/tP was cloned into expression vector pET32a and expressed in E. coli BL21 (DE3). Expressed protein was detected by SDSPAGE and Western Blot and purified by NiNTA chelating agarose. The antigenbinding activity of the ScFv/Ck/tP fusion protein was confirmed by cellular ELISA, and the DNA binding ability was confirmed by gel shift assay. RESULTS: Restriction endonuclease digestion and DNA sequencing proved that ScFv/Ck/tP was correctly cloned into expression vector. SDSPAGE and Western Blot analysis showed that ScFv/Ck/tP fusion protein was successfully expressed in E. coli BL21. Cellular ELISA confirmed that it had specific antigen binding activity; gel shift assay assured that it had DNA binding ability. CONCLUSION: The ScFv/Ck/tP fusion protein expressed in E. coli could specially bind with both HER2 antigen and DNA.

【Keywords】 HER2; single chain antibody; protamine

【摘要】 目的：构建人抗HER2单链抗体(ScFv)/人轻链恒定区（Ck）/鱼精蛋白截短体(tP)融合蛋白基因，在大肠杆菌中表达、纯化并分析该融合蛋白的活性. 方法：设计引物扩增人抗HER2单链抗体e23sFv基因和轻链恒定区编码序列(Ck)，连接成ScFv/Ck片段，人工合成tP序列，连接于ScFv/Ck末端，构建成ScFv/Ck/tP融合基因，将其克隆入原核表达载体pET32a后，在大肠杆菌BL21(DE3)LysS中诱导表达，表达产物经SDSPAGE和Western Blot鉴定后，用NiNTA螯合层析介质纯化. 细胞ELISA分析ScFv/Ck/tP融合蛋白抗原亲合活性，凝胶迁移实验检测ScFv/Ck/tP融合蛋白与DNA的结合活性. 结果：成功构建了人抗HER2 ScFv/Ck/tP融合基因，经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了可溶性表达. 表达的ScFv/Ck/tP融合蛋白保持了与抗原的结合活性，同时具有结合DNA的能力. 结论：ScFv与Ck，tP融合后，同时具有抗原和DNA结合活性，为该ScFv用于HER2阳性肿瘤的靶向基因治疗奠定了基础.

【关键词】 HER2；单链抗体；鱼精蛋白

0　引言