细胞生物学论文范文精选

1资料与方法

1.1HE染色切片脑组织病理形态学改变，进行病理分级。染色强度根据阳性细胞的百分比进行定性分级:病灶的表达＜20%为阴性(－)，＞20%为阳性(+)，以定性分级结果比较HSP70表达与星形胶质细胞瘤临床病理特点的关系。

1.2统计学方法应用SPSS17.0进行分析，采用非参数Kraskal-Wallis、Dunnet-t检验、χ2检验和应用生存分析。

2结果

2.1HSP70蛋白的分布与表达HSP70阳性物质呈棕色颗粒状，位于胶质细胞瘤的胞核和胞质中，以灶状或颗粒点状分布，不同病理分级HSP70免疫组化图片，见图1。HSP70在正常脑组织中呈基础分布，HSP70计数值平均为5.60±1.82，各级星形胶质肿瘤细胞中HSP70分布呈逐级上升趋势，经Spearman秩相关分析，肿瘤分级与HSP70分布呈正相关(r=0.685，P＜0.001)，具体分布情况，见表1。以正常脑组织为参照，肿瘤Ⅲ、Ⅳ级脑细胞中HSP70计数值分别为38.11±16.75、55.17±24.96，明显高于正常脑组织(P＜0.01)。肿瘤Ⅰ、Ⅱ级HSP70计数值分别为15.2±7.58、24.38±14.40。

2.2HSP70表达与星形胶质细胞瘤临床病理特点的关系62例星形胶质细胞瘤患者中，21例HSP70表达增高，与正常脑组织有差异(P＜0.05);HSP70表达情况与性别、年龄无关(P＞0.05);胶质瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期中表达阳性率。见表1。

2.3生存率比较随访观察患者5年生存率，HSP70阳性组5年生存率(36.1%)明显低于HSP70阴性组(61.5%)(P=0.029)。生存曲线图，见图2。

3讨论

摘要:医学细胞生物学是现代基础医学教育中一门非常重要的基础课程，它不仅是基础医学学科的前沿学科，而且与临床医学各学科紧密联系。医学细胞生物学课程内容繁杂、抽象，如何在有限的时间内，让临床专业医学生系统掌握医学细胞生物学的基础理论知识及实验技能，已成为医学细胞生物学教学改革的重要内容。本文结合郑州大学基础医学院临床专业课程规划的实际情况，在教学内容的安排、教学方法的使用、考试方式的优化等方面进行深入的思考，为提高临床专业医学细胞生物学教学质量提出几点建议。

关键词:医学细胞生物学;教学模式;教学改革

医学细胞生物学是一门以细胞生物学和分子生物学为基础，探索研究人体细胞发生、发育、增殖、衰老、死亡以及细胞结构与功能的异常与人类疾病关系的学科［1］。医学细胞生物学是临床医学、检验医学、口腔医学、预防医学等医学专业的一重要基础课，同时也是生理学、病理学、免疫学、组织胚胎学、药理学等医学基础课程以及后续临床课程的基础［2］。学习医学细胞生物学的基本理论知识有助于医学专业学生从分子细胞层面理解人体生命活动规律和疾病发生发展进程，为专业课学习和后续的科研工作奠定坚实的理论基础［3］。医学细胞生物学是一门实验操作性极强的学科，实验教学是这门课程教学工作中的重要实践环节，在培养学生动手能力、实践探索能力和科学创新能力等方面具有重要作用［4-6］。传统的教学理念和教学方法已经不能满足新时代的需要，如何能在有限的时间内，让学生系统掌握医学细胞生物学的基础理论知识，并熟练掌握基本实验操作技术，是新形势下医学细胞生物学教学改革的一项重要内容［7-8］。本文结合郑州大学基础医学院的实际情况，对医学细胞生物学理论课及实验课教学中存在的问题及改革策略进行探讨并提出建议，以提高医学细胞生物学教学质量。

1提高医学细胞生物学理论课教学质量的建议

1．1理论课教学内容的改革

首先，针对不同专业，因材施教。临床医学、检验医学、法医学、临床药学、预防医学等专业均需要开设医学细胞生物学。任课教师应该结合教学大纲并根据教材内容，为不同专业的学生制定相应的教学计划和授课内容，按照学校的课程设置，多方面、多角度、多层次因材施教，提高医学细胞生物学的课堂教学效果。其次，注重基础理论，由浅入深。注重教学内容的基础性，构建并完善由细胞基本结构及其功能、细胞重大生命活动现象及本质等所组成的理论教学体系，加强学生对基本理论知识及基础实验技术的理解。授课教师应该以真核细胞的结构与功能为教学重点，使学生对细胞的主要结构及其功能等有系统、全面的了解和认识。然后，精炼教材内容，突出重点。医学细胞生物学课程的内容较多，但课时有限，所以，任课教师应精炼教材内容，有的放矢授课。该门课程的必修内容是认识人类自身生命活动的基础，也是认识疾病发生、发展的理论基础。授课教师在授课过程中要注意精练授课内容，突出重点章节，同时，课后需要对本节课的内容进行归纳总结。

1．2理论课教学方法的改革

首先，使用启发式教学。授课教师应该在课堂上开展启发式教学，实现教师与学生的课堂互动。启发式教学相比传统单纯由教师讲课的教学方式更具有优势，可以更加有效地激发学生的学习兴趣。启发式教学不但注重知识的传授，更注重能力培养，因此，启发式教学可提高学生的思维能力和创新能力。其次，使用多媒体教学。医学细胞生物学课程中有很多细胞结构图和分子机制图需要制作成动画，以使复杂抽象的内容变得直观有趣，调动学生的学习主动性，增强学生的学习兴趣。同时，任课教师可以充分利用网络资源，搜集医学细胞生物学的视频课件资料并运用到课堂教学中。这样既可以拓展学生的学术视野，又可以提高学生的综合素质。然后，使用案例式教学。案例教学是在事实案例基础上的一种开放式、互动式的新型教学方式。医学专业学生不仅要掌握细胞的结构、功能，还应该熟悉细胞的病理改变与疾病发生发展的关系。但是由于医学细胞生物学课程的理论性强、内容抽象，所以任课教师应该积极探索案例式教学，以激发学生的学习兴趣，提高医学细胞生物学的教学质量。

1细胞凋亡测定

细胞凋亡采用FITC-PI双染色方法检测。制备转染后的GSCs细胞悬液，每管加入10μLFITC溶液，避光孵育30min后，每管加入10μLPI溶液，C6流氏细胞仪每管抽取10000个细胞进行分析。实验重复6次。细胞迁移及侵袭能力采用Transwell小室方法检测。制备转染后的GSCs细胞悬液，以每孔100μL含51×10细胞数接种于Transwell小室的上室，下室加入500μL高糖DMEM培养基（含10%胎牛血清），48h后取出小室，PBS清洗上室内的细胞，室温晾干后4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗3遍，至于吉姆萨染色液中染色30min，取出室温晾干后，置于显微镜直接观察拍照，随机选取5个视野计数染色细胞个数。细胞侵袭能力检测需在Transwell小室的上室内预先铺置基质胶，置37℃、5%CO细胞培养箱中26h后备用，余步骤与细胞迁移实验相同。实验重复6次。统计分析用SPSS18.0统计软件对数据进行处理。实验数据用表示，两组间采用t检验，多组间采用单因素方差分析和Bonferroni检验，<0.05认为有统计学差异。

2结果

2.1U87来源的GSCs的鉴定

如图1A所示，U87细胞置于干细胞培养基培养后形成细胞球，此细胞球同时表达Nestin（神经干细胞标志物）及CD133（肿瘤干细胞标志物），在图1B中，细胞球在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中进行分化培养2周后，细胞表达胶质细胞活化的典型标志物GFAP，以及神经元的典型标志物tubulinIII。以上结果说明在干细胞培养基形成的细胞球细胞为典型的胶质瘤干细胞，具有神经系统肿瘤干细胞的特征，并且具有多向分化能力。

2.2在GSCs中，miR-144呈现低表达状态

如图2所示，Real-timePCR结果显示，与non-GSCs相比，在GSCs中miR-144的表达明显降低（<0.01），说明miR-144可能参与了脑胶质瘤的发生和发展。

2.3转染后，miR-144的表达

1细胞生长曲线

采用MTT法绘制细胞生长曲线。取第7代近融合的肠上皮细胞,消化后调整细胞密度为1×105/mL的单细胞悬液,接种于96孔板中,每孔接种100μL,接种15板,每3d更换一次细胞培养液。每天于相同时间取出一板细胞,每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL,培养4h后,吸出孔内上清,每孔加入二甲基亚砜150μL,震荡10min后于酶联免疫检测仪以490nm波长测吸收值。共测定15d,以时间作为横坐标,光吸收值(D)作为纵坐标,绘制细胞生长曲线。1.8流式细胞术(flowcytometry,FCM)分析细胞周期常规方法收集第7代近融合的肠上皮细胞,PBS洗涤2次,在离心管中留约0.5mL的PBS,向细胞悬液中缓慢加入75%冰乙醇,–20°C固定过夜。检测前,1000r/min离心3min去除乙醇,PBS清洗1次,加入适量碘化丙啶染液(0.1%TritionX-100,10μg/mL碘化丙啶,50μg/mLRNase),室温避光染色30min,上机检测,计数10000个细胞,用MuticycleAV软件进行DNA细胞周期拟合分析。增殖指数(proliferativeindex,PI)指增殖细胞占总周期细胞的比例,S期细胞指数(S-phasefraction,SPF)指细胞周期中处于S期细胞所占的比例。采用PI和SPF分析细胞的增殖活性,PI(%)=(S+G2/M)/(S+G2/M+G0/G1)×100%,SPF(%)=S/(G0/G1+S+G2/M)×100%。1.9染色体核型分析参考已报道的方法[13],稍作修改。传代细胞以1×105/mL的密度接种至96孔板。48h后换液,给予浓度为2μg/mL秋水仙素处理3h;消化收集细胞,37°C低渗(0.075mol/LKCl)处理20min;用新鲜配制(4°C预冷)的卡诺固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)预固定20min,离心去除上清,再视细胞量加入新鲜固定液0.5~1mL,以移液枪重悬沉淀;取出–20°C预冷的玻片,30cm高度滴片;空气干燥,吉姆萨工作液染色10min,脱色,在显微镜下选择分散良好,形态清晰的染色体中期分裂相,进行拍照,用Photoshop软件进行染色体核型分析。

2结果

2.1IEC-P.A.的细胞形态与超微结构

用嗜热菌蛋白酶和I型胶原酶联合消化参环毛蚓肠组织,获得的大量隐窝单位和散在细胞。隐窝单位培养48h即能贴壁,72h开始辐射出零星细胞;而散在的肠上皮细胞贴壁所需时间较长,接种一周才可形成少量的细胞集落(图1A),15d开始贴壁,但附着不稳定,稍振动即浮起。约28~30d细胞生长至85%~90%汇合,可进行传代培养。原代培养时有较多的细胞碎片,且上皮细胞与成纤维细胞夹杂生长,传至第3代以后,细胞碎片明显减少,类圆形上皮细胞数量增多,形态较一致。传代后细胞生长稳定,培养13~15d可见肠上皮细胞汇合成细胞单层,呈典型“铺路石样”镶嵌排列,边界清晰,互不重叠(图1B)。透射电镜下观察培养的肠上皮细胞,可见细胞结构完整,直径为8±2μm,具有典型的肠上皮隐窝细胞特征。微绒毛从细胞表面伸出,排列整齐(图2A),近绒毛端胞质中分布丰富的线粒体,其嵴清晰可见(图2B),细胞核周区域有大量的粗面内质网(图2C)。

2.2IEC-P.A.的生长曲线

第7代参环毛蚓肠上皮细胞的生长曲线见图3,体外培养的肠上皮细胞存在着明显的潜伏期,接种培养7~9d后才能进入对数生长期,经过大约4d的对数生长期后,至13~15d开始进入平台期,且能相对较长时间维持在这一时期。

2.3FCM分析IEC-P.A.细胞周期

一、深化课堂改革，推行创新课堂

1.课程设置合理化

研究生课程体系的设置做到适时调整，丰富选课资源的同时，加强学生选课的自主性，充分考虑学生的个性化培养的需求。

2.优化教学内容

创新型人才培养模式改革首要是课程改革，而课程改革首先要解决的问题是教学内容的优化。研究生创新能力的培养应该是建立在知识、能力、素质的辩证统一的基础上。知识作为能力和素质的载体，是不可或缺的重要一环，研究生阶段知识的获取不应该局限于本科阶段的某一本教材的重复拓展。我们在课堂设计中集思广益，打破教材的局限，以学生兴趣为出发点，设置了十个小的专题题目，专题内容涉及细胞生物学的基本技术及其创新、前沿知识、热点领域，并充分考虑细胞生物学与医学的密切关系。如细胞通讯、细胞信号跨膜转导及其与疾病的关系，端粒、端粒酶和肿瘤的关系及其研究进展，细胞骨架与运动和神经系统疾病的关系举例（原因分析、分子细胞学调整、研究进展）等。学生既能从中巩固提炼的基本理论框架，又能获得丰富的前沿信息，在学习中还有助于科研方向的确立和科研思维的培养。

3.改革教学方法

我们在前几年的教学中留心对研究生的理论基础、能力水平和喜欢的教学模式做了问卷调查，相对于本科生研究生阶段学生的特点突出表现为：已经具有比较广泛、系统的理论知识基础，并具备一定的分析问题的能力，更向往自由的思维和互动表达。综合研究生的特点和现代教育技术的发展，我们在课堂教学中试行教学方法改革，彻底改变教师灌输知识的单一模式，更多地让学生自主学习，教师担负引导、组织实施、总结和考评的职责，更多的时候也是讨论和争论的主体之一，变师徒关系为伙伴关系。具体实施是依据学生兴趣分组，3~4人/组，组内分工协作，依据自己所选的感兴趣的专题查阅资料，开展讨论并推举一人以PPT文稿的形式图文结合在课堂上汇报讲解，同学可以自由提问，教师做针对性的点评、补充。创新的课堂组织从学生的兴趣出发保障了自主学习的效率，协作中锻炼了学生的团队意识和合作能力，课堂表达和提问互动有效地活跃了学习气氛，调动了学习的积极性，并提高了学生综述及表达能力。此种形式受到了选课学生的一致好评，也吸引了更多的研究生加入我们的学习队伍中。

4.考评手段合理化

1教学内容的改革

医德教育不只是人文社科类教师的职责，而是全体教师的职责，医德教育应贯穿渗透于整个专业教育中。在医学细胞生物学实验课中，时刻加强学生医德医风的教育。比如，在实验操作中教育学生认真细致，因为将来他们面对的是鲜活的生命，他们在对病人的诊断和手术操作中不容许一点失误，否则将会造成无法弥补的后果。因此，在实验课上要求学生每一步操作都要小心翼翼，将实验操作想象成对病人的手术。另外，一些学生在写实验报告时出现错别字，不善于总结分析实验结果，这时要提醒学生在未来的工作中一旦病例上出现错误或者没有对病人的病情进行认真的分析都可能导致严重的医疗纠纷。通过这些在实验课中发现的问题教育培养学生一丝不苟、严谨细致的工作态度，提高医学生的整体医德医风。

2教学方式的改革

兴趣是学习最好的老师，但是现在单的教学方式往往使学生处于被动地位。因此，改变学生的学习地位，配合多元化的教学方式来调动学生学习的积极性成为亟待解决的问题。

2.1变被动学习为主动学习

中国当前的教育模式几乎仍是填鸭式教学，而实验课的教授更是老师讲解为主，学生完全处于被动地位。许多学生在实验过程中不知前因后果，只是草率结束实验，课后将实验内容抛之脑后，一无所知。为调动学生的主观能动性，在实验开始前，只是简单介绍相关的知识，提出实验目标。然后由学生在课下预习实验内容，查找资料，熟悉每一个实验步骤的原理、所需试剂的作用及配备方法，做好充足的准备工作。在实验结束后，分组讨论在实验过程中出现的问题，及对结果的多样性进行分析，鼓励大家畅所欲言，探讨该次实验内容能够用于解决哪些实际的问题。最后，要求学生认真整理出一份实验报告。在整个实验过程中，老师只起到引导、鼓励及评价的作用，而使学生处于主动地位。突然之间的角色转变使很多同学学习起来有些吃力，但是坚持一学期下来，发现学生的自主学习能力明显提高，这正是“授之以鱼，不如授之以渔”。

2.2变传统教学为多元化教学

现在一些高校的实验课教学方式仍为传统的板书讲解，这种教学方式早已不符合时代的发展。为使学生更直观生动的了解实验过程，将实验过程制作成录像，上课前通过多媒体播放教学示范录像。例如，对于原代培养细胞实验，前期的准备工作繁琐，耗时长，不可能每个同学都参与，这时通过播放教学示范录像[6]，使学生深刻了解整个实验的来龙去脉。另外，在实验课上由“老师讲”变为“学生讲”。课前要求学生预习实验目的、原理及注意事项等，上课时随机挑选学生为大家讲解，其他同学对讲解的内容进行补充和纠正。在显微镜的使用实验课中，将学生分为2～3人的小组，小组中的每位同学分别操作显微镜，其他同学在旁观看，指出这位同学在操作过程中存在的问题，进而加深学生对显微镜使用方法及注意事项的印象。

【摘要】目的比较人羊水源性及脐血源性的间充质干细胞(MSCs)分离、培养及其生物学特性，为组织工程选取种子细胞提供实验依据。方法用贴壁分离培养的方法分离两种来源的间充质干细胞，观察其形态与生长曲线，并用细胞化学染色的方法测定其生物化学特性。结果两种来源的标本均可成功分离出MSCs，但是孕中期羊水源性MSCs增殖能力要明显强于新生儿脐血源性的MSCs，二者有相似的生物化学特性。结论孕中期羊水与新生儿脐血来源的MSCs是很好的组织工程种子细胞,新生儿脐血来源的MSCs的增殖能力相对较弱，应用受到一定的限制。

【关键词】孕中期羊水;间充质干细胞;脐血

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)具有多向分化潜能,是细胞治疗及基因治疗的理想种子细胞。已有研究显示羊水[1]和脐血[2]可以分离出MSCs，那么这两种来源的MSCs有哪些异同呢?为此本研究将对孕中期人的羊水及新生儿的脐血进行间充质干细胞的分离与培养，并对其基本生物学特性进行了比较研究，为组织工程选取种子细胞提供基础性实验依据，现报告如下论文。

1材料与方法

1.1标本来源

羊水标本取自2008年3月至2010年3月吉林医药学院附属465医院妇产科，妊娠在15～22周的引产羊水35份;32份脐带血标本取自正常足月剖腹产或足月正常产乙肝病毒检测阴性的孕妇。取标本前均征得孕妇本人同意，研究获得吉林医药学院附属465医院道德伦理委员会批准。

1.2主要试剂与仪器

PRMI1640(GIBCOBRL)，胎牛血清(GIBCOBRL)，马血清(GIBCOBRL)，1.077×103g/LFicoll淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，细胞化学染色试剂盒(BASO公司)，CO2培养箱(FormaScientific公司)，荧光倒置显微镜(TE300,Nikon公司)。

1、Real-time

RT-PCR检测耐药相关基因MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCA的表达取对数生长期细胞，TRIzol试剂提取细胞总RNA，反转录试剂盒合成cDNA，SYBYGreen方法进行实时荧光定量PCR实验。引物设计由Invitrogen公司合成，见表1。PCR反应体系：cDNA1μl，2×SYBRGreenPCRMastermix12μl，引物F/R（上下游引物的终浓度各为15pmol/μl）各0.3μl，DEPC水11.4μl，共25μl。PCR循环设置：50℃2min95℃10min（95℃15s60℃1min）×40个循环（生成扩增曲线）95℃15s60℃15s95℃15s（生成溶解曲线）。SDS2.2软件分析处理数据，管家基因校正目的基因的表达，得到相对定量结果。1.6耐药细胞的保存耐药细胞SKOV3/TAX30分别冻存于含0、10、30nmol/L紫杉醇药物的冻存液里。于冻存后1、3、6月分别复苏细胞，观察复苏情况，MTT法检测IC50。1.7统计学方法对有关数据采用SPSS13.0软件进行独立样本t检验（independentsamplet-test）、单因素方差分析（OnewayANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1耐药细胞的建立

SKOV3经300μg/ml大剂量的紫杉醇作用2h后,大部分细胞死亡漂浮，剩余细胞肿胀，伸出树枝状突起呈蜘蛛状，胞质见空泡形成、颗粒增多。少量存活的细胞克隆生长，恢复生长至对数期消化传代，再进行下一次冲击；SKOV3经10~30nmol/L小剂量的紫杉醇作用24h，约50%的细胞死亡，细胞体积增大，形态不规则，胞质内颗粒增多，贴壁性变弱，给药24~72h内最明显，96~120h后逐渐恢复原状。经两种诱导方法获得的耐药细胞系，分别命名为SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30。

2.2耐药细胞的生物特性

2.2.1耐药指数MTT实验结果显示，耐药细胞及其敏感细胞的IC50值及耐药指数，可见小剂量浓度递增诱导的耐药细胞SKOV3/TAX30耐药性较强，见表2。2.2.2平板克隆形成实验在无药物作用时，SKOV3敏感细胞较两种耐药细胞系的克隆形成能力强，见图1A的d组，SKOV3敏感细胞的克隆形成数为（934±16.37），SKOV3/TAX300的克隆形成数为（440±13.75）,SKOV3/TAX30的克隆形成数为（579±9.50）。与敏感细胞SKOV3相比，两种耐药细胞克隆形成数少，差异有统计学意义（P均=0.000），见图1B。而在相同浓度紫杉醇作用下，耐药细胞形成的克隆明显多于敏感细胞。在紫杉醇浓度为5nM时，SKOV3/TAX30可形成（1206±9.50）个克隆，SKOV3/TAX300可形成（870±32.30）个克隆，而SKOV3形成的克隆数仅（202±6.08），差异有统计学意义（P均=0.000）；当紫杉醇浓度进一步升高为50nM和500nM时，SKOV3/TAX30和SKOV3/TAX300形成的克隆数仍明显高于敏感细胞SKOV3。紫杉醇浓度为50nM时，SKOV3细胞与SKOV3/TAX300细胞形成的克隆数相比，差异有统计学意义（P=0.013）,SKOV3细胞与SKOV3/TAX30细胞形成的克隆数相比，差异也有统计学意义（P=0.000）；紫杉醇浓度为500nmol/L时，SKOV3细胞与SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30细胞形成的克隆数相比，差异有统计学意义（P=0.009、0.0001），见图1B。2.2.3生长曲线倍增时间的差异SKOV3敏感细胞和两种耐药细胞系在相同条件下培养7天，细胞增殖产生一定的差异。耐药细胞的生长较敏感细胞减慢，生长曲线的斜率减小，见图2。同时，根据生长曲线计算出SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30细胞的倍增时间分别为28.90h、24.0h，与敏感细胞的倍增时间20.84h相比也有所延长。

2.3耐药相关基因

1材料与方法

1．1组织块贴壁法分离培养hUC-MSCs脐带取自正常分娩的新生儿(征得其父母同意)。首先用含双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗脐带3次，去除杂物;用无菌的手术剪刀将脐带剪成3～4cm的节段，再沿长度方向剪开，以暴露脐带胶质部分，去除血管;置于含双抗的PBS中清洗3次，去除血污，再剪成约0．5cm3的组织块，以胶质部分贴于基底平铺于24孔板中，每孔2～3块，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育1～2h;待组织块自然粘附于皿底部后加入含双抗、FBS的低糖DMEM培养基，继续置于培养箱内培养，每3d更换一次培养基，待观察到有小三角形或梭形细胞从组织中铺展出时，取出组织块。整个分离过程注意无菌操作。待细胞生长至70%～80%汇合时，即可传代。利用倒置相差显微镜观察细胞形态。取第5代细胞，采用细胞免疫荧光技术鉴定hUC-MSCs的表面标记物CD44。

1．2肝细胞标志基因的检测按照总RNA提取试剂盒的操作说明分别提取hUC-MSCs和人肝癌细胞HepG2的总RNA，用RNase-FreeDNaseⅠ去除基因组，最后检测RNA的浓度和纯度，立即进行反转录合成cDNA或保存于－80℃备用。采用Prime-ScriptTMⅡHighFidelityRT-PCR试剂盒反转录2μgRNA得cDNA，取2μL用于PCR。根据GenBank提供的人肝细胞标志基因序列，使用PrimerPremier5．0软件设计引物，引物序列和产物大小见表1。GAPDH为内参对照。PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环;最后72℃延伸5min。PCR产物用20g/L的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶分析系统下拍照。

1．3PAS糖原染色按照PAS染色试剂盒的说明书操作，对第5代hUC-MSCs和HepG2进行糖原染色，在倒置相差显微镜下观察并照相。

2结果

2．1hUC-MSCs的分离、培养、传代及鉴定组织块贴壁培养3～4d时，可观察到组织块间隙铺展出小三角形或长梭形的细胞，继续培养至7d左右，可观察到局部细胞呈集落生长，此时，在无菌条件下取出组织块，更换新鲜培养基，继续培养1周左右，细胞可达80%～90%汇合，即可传代。用胰酶/EDTA消化后细胞呈亮而圆的单个分散状，以1∶3的比例进行传代，约4h贴壁，2d后迅速生长。倒置相差显微镜下可观察到细胞较大，轮廓清楚，内部有清晰的应力纤维，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显，呈典型的成纤维细胞样形态(图1A);持续培养大约2周时，细胞基本达到完全汇合，形态发生一定的变化，胞质变得狭窄，内部的应力纤维也不明显，呈平行排列或漩涡生长(图1B)。连续多次传代，细胞保持稳定的、相对均一的成纤维细胞样形态以及较强的增殖能力。经鉴定分离培养的细胞CD44呈阳性表达，且具有良好的均质性。

2．2肝细胞标志基因的表达以HepG2作为阳性对照，用RT-PCR检测hUC-MSCs的肝细胞标志基因的表达情况，结果见图2，hUC-MSCs表达ALB、CK18、G6P、GLUL和MET，不表达TAT。

2．3PAS糖原染色结果对hUC-MSCs和HepG2进行PAS糖原染色，染色结果显示两种细胞的细胞质中均有紫色颗粒物形成，即均呈糖原阳性反应(图3)。

1教学方式的改革

兴趣是学习最好的老师，但是现在单一的教学方式往往使学生处于被动地位。因此，改变学生的学习地位，配合多元化的教学方式来调动学生学习的积极性成为亟待解决的问题。

1.1变被动学习为主动学习

中国当前的教育模式几乎仍是填鸭式教学，而实验课的教授更是老师讲解为主，学生完全处于被动地位。许多学生在细胞生物学实验过程中不知前因后果，只是草率结束实验，课后将实验内容抛之脑后，一无所知。为调动学生的主观能动性，在实验开始前，只是简单介绍相关的知识，提出实验目标。然后由学生在课下预习实验内容，查找资料，熟悉每一个实验步骤的原理、所需试剂的作用及配备方法，做好充足的准备工作。在细胞生物学实验结束后，分组讨论在实验过程中出现的问题，及对结果的多样性进行分析，鼓励大家畅所欲言，探讨该次实验内容能够用于解决哪些实际的问题。最后，要求学生认真整理出一份实验报告。在整个实验过程中，老师只起到引导、鼓励及评价的作用，而使学生处于主动地位。突然之间的角色转变使很多同学学习起来有些吃力，但是坚持一学期下来，发现学生的自主学习能力明显提高，这正是“授之以鱼，不如授之以渔”。

1.2变传统教学为多元化教学

现在一些高校的细胞生物学实验课教学方式仍为传统的板书讲解，这种教学方式早已不符合时代的发展。为使学生更直观生动的了解实验过程，将实验过程制作成录像，上课前通过多媒体播放教学示范录像。例如，对于原代培养细胞实验，前期的准备工作繁琐，耗时长，不可能每个同学都参与，这时通过播放教学示范录像，使学生深刻了解整个实验的来龙去脉。另外，在实验课上由“老师讲”变为“学生讲”。课前要求学生预习实验目的、原理及注意事项等，上课时随机挑选学生为大家讲解，其他同学对讲解的内容进行补充和纠正。在显微镜的使用实验课中，将学生分为2～3人的小组，小组中的每位同学分别操作显微镜，其他同学在旁观看，指出这位同学在操作过程中存在的问题，进而加深学生对显微镜使用方法及注意事项的印象。

2考核方法的改革

随着对实验课的重视程度提高，细胞生物学实验课成绩在总成绩中所占比例也相应增加。实验课的考核不再只依靠实验报告，而在于对学生实验原理的掌握及实验操作能力的评价。通过课前提问形式，了解学生的预习情况并给予一定评分。在实验课结束时，随机抽取部分学生，考核其对该次实验中关键技术的掌握，如显微镜、离心机、天平等仪器的正确使用及临时装片的制备，并叙述在操作过程中的注意事项等，从而对学生的操作技能进行测试。另外，在批改实验报告时，主要依据学生对实验数据的分析及总结程度给予评分，强化学生的分析思考能力。