nk细胞范文精选

作者：张梅,吴迪，徐汇,贺鹏程，李静，习杰英，蔡瑞波，刘亚琳

【关键词】 杀伤细胞,天然;,骨髓移植;,移植物抗宿主病;,造血重建

Effect of NK cell on GVHD and hematopoietic reconstitution after H2 haploidentical bone marrow transplantation in mice

【Abstract】 AIM: To explore the effect of natural killer (NK) cell on graftversushost disease (GVHD) and hematopoietic reconstitution after H2 haploidentical bone marrow transplantation in mice. METHODS: Murine model of H2 haplotype mismatched bone marrow transplantation was established by using Balb/c (H2d) mouse as recipient, and Balb/c (H2d)×C57BL/6(H2b)(H2d/b) mouse as donor. Lethally irradiated Balb/c (H2d) mice were transplanted with Balb/c (H2d)×C57BL/6(H2b)(H2d/b) bone marrow plus with donor peripheral T cells and/or NK cells. GVHD and hematopoietic reconstitution were observed and evaluated by clinical manifestations, pathological changes and WBC counting. RESULTS: In the bone marrow plus with T cells group, GVHD was induced in 90% mice and the recovery of the WBC needed 4 weeks averagely; but in the group plus with low concentration of NK cells, GVHD was induced in 20% mice and the recovery of the WBC was 3 weeks averagely; and in the group transplanted with high concentration of NK cells, GVHD was induced only in 10% mice and the recovery of the WBC was 3 weeks averagely. Compared with the group transplanted only with T cells, the incidences of GVHD in the later two groups decreased obviously (P<0.01), and the recovery of the WBC was in a shorter time (P<0.01). CONCLUSION: In mouse H2 haploidentical bone marrow transplantation, alloreactive NK cells can reduce the incidence of GVHD and promote hematopoietic reconstitution.

【Keywords】 killer cell, natural; bone marrow transplantation; graftversushost disease; hematopoietic reconstitution

【摘要】 目的: 研究自然杀伤(NK)细胞在单倍体相合骨髓移植中对移植物抗宿主病(GVHD)及造血重建的影响. 方法: 以近交系Balb/c（H2d）×C57BL/6（H2b）杂交F1代小鼠（H2d/b）为供鼠、Balb/c（H2d）为受鼠,在移植物中增加供者的外周T细胞和(或)NK细胞进行半相合骨髓移植，根据临床表现、病理检查及外周血白细胞(WBC)数,比较不同移植组GVHD发生及造血重建情况. 结果: 骨髓+T细胞组中90%的小鼠出现GVHD，外周血WBC平均在移植后4 wk恢复正常；而骨髓+T+低浓度NK细胞组中20%小鼠出现GVHD, 外周血WBC平均在移植后3 wk恢复正常；骨髓+T+高浓度NK细胞组中仅10%出现GVHD，外周血WBC也平均在移植后3 wk恢复正常. 后两组较骨髓+T细胞组GVHD发生率显著下降(P<0.01),外周血WBC恢复时间显著提前(P<0.01). 结论:在小鼠单倍体相合骨髓移植中,同种反应性NK细胞可降低GVHD发生率,促进造血重建.

【关键词】 杀伤细胞,天然; 骨髓移植; 移植物抗宿主病; 造血重建

0引言

结肠癌rko细胞p物质和nk?1免疫细胞化学检测

【关键词】 结肠肿瘤;rko细胞系;p物质;受体,神经激肽;免疫细胞化学

【摘要】

目的 探讨p物质及其受体神经激肽1(nk?1)在体外培养的结肠癌细胞系rko 中的表达及免疫细胞化学定位。方法 将rko细胞接种于提前放入盖玻片的6 孔板进行细胞培养,细胞融合30％时将盖玻片取出进行免疫细胞化学染色。结果 在rko 细胞系中p物质和nk?1呈阳性表达，p物质阳性表达多数位于细胞浆；而nk?1阳性表达多数位于细胞浆，少数位于细胞膜。结论 神经内分泌机制可能参与了结肠癌的发病过程。

【关键词】 结肠肿瘤;rko细胞系;p物质;受体,神经激肽;免疫细胞化学

immunocytochemical expressions of substance p and neurokinin?1 in rko cells of colon cancer

］

zhao ling?ling, chen hua, wang ji?gang (qingdao university medical college, qingdao, 266003, china);

摘要：过继免疫治疗是当前医学研究的重点内容，在细胞免疫中，A-NK细胞作为肿瘤过继免疫治疗（AIT）中的一种新型免疫效应细胞，具有短期内大量增殖，调节机体免疫能力，抗菌，抗病毒，抗衰老，抗肿瘤的特点受到普遍关注，临床应用也显示出广阔前景。本文追踪国际上研究进展就有关A-NK细胞生物学特性，免疫调节及临床应用的研究现况及进展作以简要综述。

关键词：过继免疫治疗；A-NK；临床应用

中图分类号：R473.73 文献标示码：A

近年来，随着人类疾病治疗学的进展，过继免疫治疗（AIT）成为免疫生物治疗中的主要疗法之一。从80年代后期，LAK、TIL、NK、CTL、DC、CIK等效应细胞陆续被发现，国内外的基础和临床应用报道层出不穷。1988年美国Pittsburgh大学首次从LAK细胞群体中分离纯化了一种具有高效杀伤活性的LAK亚群，由于它具有粘附在塑料表面的特征将其命名为A-LAK（ad herent LAK）。之后， 随着A-LAK研究的深入和进展，我们发现其与LAK之间有着诸多不同之处， 而与NK细胞具有相同的表面标志，相似的生物学活性，本课题组近年多以A-NK（activated NKcells）代替A-LAK这个名称。

1 A-NK的生物学特征

A-NK可来源于人外周写单个核细胞（PBMNC）、骨髓、淋巴结、脾细胞、脐带血等，其中后两者是最好的A-NK来源。美国Pittsburgh大学Vujanovic课题组最初分离制备A-NK时提出，A-NK可能来源于大淋巴细胞，因为在形态、表型特征和生物学活性方面，二者具有同源性[1]。1990年Melder通过A-NK形态及超微结构研究指出，初次分离的A-NK在粘附相及非粘附相之间周期性波动。动态观察有无IL-2条件下常规NK的粘附状态表明，只有相当少的一部分NK（1%～10%）具有自发粘附到塑料表面的特性，但在6000IU/mlIL-2存在时，一部分（4%～30%）NK也可以迅速转化为粘附NK，24h后这部分细胞又失去粘附活性。因此，IL-2诱导NK粘附作用只是非常迅速的一个过程。A-NK的超微结构与高度活化的NK一致，所有的A-NK均为球形，表面有众多绒毛和伪足。在粘附相，A-NK也是可动的，一般可沿着固体表面移动1μm/min，1个极性末端是有皱而毛糙的边角结构，另一端绒毛呈线圈样。用透射电镜也证实A-NK结构高度极化，一端为细胞核，另一端为细胞浆，颗粒丰富，骨架结构较大，具有多囊泡小体和活跃的Golgi小体[2]。此后研究进一步明确，A-NK来源于成熟静息状态的NK亚群，占全部单个核细胞的1%～4%，占总NK的15%～50%，与未成熟NK或活化的终末NK细胞不同。A-NK代表了表型和功能独特的NK亚群。用流式细胞仪（FACS）进行A-NK表面标志分析显示，A-NK表达CD56dim -CD16dim -β2 intergrinsbrightIL-2Rp75+表型，A-NK和NK一样，其表面有多种复杂的粘附分子（CAM）存在，并与其生物学活息相关。为了评价CAM在A-NK粘附特性中起的作用大小，Melder发现CD11c，CD11a，CD18分子在活化的NK与内皮细胞相互作用中起关键作用，与A-NK粘附于肿瘤血管而短暂停留于正常组织的现象有关。也有学者证实CD18相关的层粘连素CD11a，CD11b，CD11c，CD2在A-NK与靶细胞的相互识别中起重要作用。Gunji Y指出A-NK是大颗粒淋巴细胞，表达NK细胞表型膜标志（asialo GM1+， NK1.1+， Qa5+， Ly-6.2+， Thy-1.2+，但Lyt-2.2 and L3T4阴性），具有相对较高的细胞毒性[3]。图1为本课题组提取活化的A-NK免疫效应细胞，它通过突触粘附至癌细胞（扫描电镜）。图2显示A-NK细胞聚集，粘附至癌细胞周围，形成花环状，肿瘤细胞呈现空泡变性，细胞膜损伤、溶解等坏死征象（透射电镜）。

2 A-NK的肿瘤治疗研究

2.1 A-NK体外增殖能力和抗肿瘤能力 A-NK优点主要有2点：①是抗肿瘤能力强；②是体外扩增能力强。在自体条件培养基（AuCM）存在条件下，A-NK可于20d内扩增130～1100倍，临床级A-NK扩增倍数稍低，但也可于8～14d内扩增10～22倍。以22nmol/mlIL-2诱导下是否能迅速粘附到实体表面的能力，NK被分为两种不同亚群，A-NK和NA-NK[2]。分别培养二者作动态比较，A-NK增殖能力始终强于NA-NK，但诱导力迟于NA-NK。在抗瘤能力方面，A-NK结合并杀伤K562和Daudi细胞的能力明显高于NA-NK，并能侵润到肿瘤细胞囊球内部杀伤肿瘤细胞。大量体外实验表明，A-NK抗NK敏感性K562，NK抵抗性Daudi、Raji及新鲜肾细胞癌、子宫颈癌、卵巢癌的能力远强于常规LAK。体内实验也证明，A-NK和IL-2过继输注几乎能完全抑制在裸鼠体内建立的人头颈部鳞癌模型肿瘤的生长，对胃癌肝转移模型能明显减少肝内转移瘤数目并延长小鼠生存期[3]。A-NK/IL-2疗法对实体瘤的治疗结果很大程度上取决于A-NK在肿瘤部位的聚集能力。这种选择性聚集能力至少受五种因素影响：①肿瘤血管的构造和超微结构；②A-NK的不规则外形；③IL-2激活的A-NK刚性增强；④A-NK表面高度表达的CAM与机体血管及肿瘤微循环的相互作用；⑤肿瘤组织可能分泌一些趋化性介质，如TGFβ，IL 6等，吸引和促进A-NK聚集和粘附。实验发现静脉注射的A-NK很快就在肺脏和肺部转移灶聚集和停滞，只有相当少的一部分A-NK随后进入循环。到达肺部转移灶的A-NK一部分来源于血液，另一部分从周围的肺组织移行过来。而到达肿瘤特定部位的A-NK细胞数量多少是关系到疗效好坏的关键步骤。自从1991年日本Basse P提出局部输入A-NK可以更好地使其聚集在已建立的荷瘤鼠模型的肝癌或肺癌部位之后，A-NK的研究者们意识到其体内存活及分布情况与输入途径及IL-2剂量密切相关。Sacchi使用肿瘤局部注射A-NK和IL-2在建立的人头颈部鳞癌鼠模型中获得了良好疗效，并显著减少了全身治疗的副作用。1998年Heganaars使用荧光标记A-NK，在小鼠肝癌模型上比较了三种输注途径（通过肝动脉、门静脉和颈静脉给药）A-NK的选择性聚集情况，结果发现肝动脉途径A-NK在肿瘤部位聚集最多，其次是门静脉，而颈静脉途径最少。这说明局部注射A-NK比静脉给药的全身治疗具有更确切的效果和更大的潜力，A-NK的局部应用成为研究者们关注和提倡的给药途径[4-8]。

【中图分类号】R733.7【文献标识码】A【文章编号】1672－3783(2012)03－0343－01

【摘要】目的：观察枸杞多糖作用前后人白血病细胞株HL-60表面MICA的表达变化及对NK细胞杀伤活性的影响，为白血病免疫治疗打下实验基础。方法：用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测不同浓度枸杞多糖作用前后HL-60细胞培养上清中MICA的浓度；MTT法对不同浓度枸杞多糖作用前后NK细胞对HL-60杀伤活性的变化进行检测。结果：ELISA检测显示不同浓度枸杞多糖（6mg/ml,8mg/ml,10mg/ml）作用后HL-60细胞培养上清中MICA的浓度分别为(18.314±0.926)ng/l;(22.049±1.207)ng/l;(27.509±1.859)ng/l与作用前浓度(11.226±0.652)ng/l相比,差异有统计学意义 （P

【关键词】枸杞多糖；白血病细胞株HL-60； NK细胞；MICA ；白血病；杀伤活性

急性白血病（AL）是造血干细胞的恶性克隆性疾病，目前治疗包括传统的化疗、放疗、造血干细胞移植及新兴的分子靶向治疗和免疫治疗。各种方法因其有不同的局限性在临床上受到限制。近年来，免疫治疗已经成为白血病尤其是对微小残留病灶清除的研究热点，并取得了一定成功。

NK细胞是机体固有免疫的主要细胞，在肿瘤免疫中构成了第一道防线，N K细胞对靶细胞的杀伤活性与其细胞表面的受体和靶细胞表面的配体密切相关。［1］NK细胞对HL-60细胞具有一定的杀伤活性，但杀伤活性不高，需要大量的NK细胞才能达到治疗要求。而目前体外大量扩增NK细胞的技术还处于实验阶段。如何激活NK细胞活性并扩大其群体是研究NK细胞的重要问题。研究表明MICA表达阳性的肿瘤细胞对NK细胞的杀伤敏感性明显高于MICA阴性者。［2］因此，NKG2D结合MICA可介导NK细胞的杀伤活性。中药在抗肿瘤方面显示出了明显的优势，某些多糖成分（云芝多糖，灵芝多糖等）可通过激活NK细胞达到抗肿瘤作用。枸杞多糖(LBP)是传统中药材枸杞的主要成分之一，有增强机体免疫力，抗肿瘤等作用。有关枸杞体外抗瘤作用的报道较少，据此，本实验以枸杞多糖体外调节NK细胞为研究，观察枸杞多糖能否上调人白血病细胞株HL-60表面MICA的表达率,是否能增强NK细胞的杀伤活性，进而探讨NK细胞对白血病免疫治疗的新途径。

1 材料

1.1 培养液和试剂：RPMI-1640（Gibco公司）,胎牛血清（杭州四季青公司）,NK细胞 (兰州大学医学实验中心)， HL-60 (兰州大学医学实验中心)，枸杞多糖(咸阳瑞欣生物技术有限公司)，人组织相容性复合体1类相关基因A（MICA）酶联免疫分析试剂盒（R&D公司）,噻唑兰（MTT）（科昊生物工程有限责任公司）。

1.2 细胞培养:NK细胞接种在含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基中，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养，每4～5d进行换液，传代培养；HL-60细胞培养于含10 ％的胎牛血清RPMI1640完全培养基中，置于37℃，5%CO2 培养箱中培养，每3d进行换液，传代培养，8代以内用于实验。

【中图分类号】R55 【文献编识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0094-02

1.概述：NK细胞是一种非T细胞性、非B细胞性、非吞噬细胞性的具有细胞毒性效应的淋巴细胞。NK细胞是机体免疫系统的重要组成部分，在抗病毒感染免疫、肿瘤免疫、移植排斥反应以及免疫调节中起着十分重要的作用。

2001年WHO淋巴组织肿瘤分类将NK细胞肿瘤分为：（1）前体NK细胞肿瘤，即原始NK细胞淋巴瘤；（2）成熟NK细胞肿瘤，包括T-LGLL、ANKL、结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型（NK/TCL）。

侵袭性NK细胞白血病（ANKL）是起源于成熟NK细胞的恶性肿瘤，突出特点是NK大颗粒淋巴细胞（LGL，large granular lymphocyte）系统性增生（1），肿瘤细胞表达CD56，而表面CD3阴性。ANKL为高度侵袭性疾病，病程进展迅速，常伴有肝、肾、心等多器官功能衰竭，大部分患者诊断后数日或数周后死亡（2，3，4） 。ANKL最早由Imamura等于1990年发现，多见于亚洲和欧洲高加索地区，多在中青年发病，中位发病年龄30岁，男女发病率无差异，同时发现CD56作为NK细胞的标志。该病发病率低，但恶性程度高，侵袭性强，早期症状不典型，易误诊（5），治疗效果及预后极差。

2.病因及发病机制：本病的病因及发病机制尚未明确（6）。但多数病例报道（7，8，9）中发现，EB病毒感染的检测多数阳性，提示EB病毒感染与本病存在相关性（10），但目前EBV如何引起NK细胞克隆性生长知之不多。有部分研究表明ANKL的发生可能与癌基因的激活与抑癌基因的失活有关（11）。ANKL引起MOF（多器官功能衰竭）的机制除了白血病细胞浸润直接破坏器官功能外，是否与肿瘤细胞大量释放炎症因子、细胞因子、凋亡蛋白有关尚待进一步研究（12），Makishima等（13）研究发现，ANKL细胞中趋化因子CXCRI、CCR5和细胞因子IL一8、MIP一12、MIP―lB及 FasL呈阳性表达，血清可溶性FasL水平显著升高，提示细胞因子系统在ANKL细胞的迁移、侵袭中起到了重要作用，Fas和FasL的相互作用被认为是肝功能衰竭的机制之一。

3.临床表现及实验室检查：

3.1 临床症状：70%的ANKL患者起病时即可表现B症状：发热，体温>38.5℃，盗汗，体重下降。最常见的累及部位是骨髓、外周血、肝和脾，其次为淋巴结（约37%）。但任何器官均可累及，如皮肤、肾脏、肺、浆膜腔、中枢神经系统、扁桃体、纵隔及等。大多数患者呈侵袭性、爆发性的临床过程，短期内可出现多脏器功能衰竭。以肝功能衰竭为主，逐渐累及到其他脏器。病程中常出现弥散性血管内凝血和噬血细胞综合征，尤其是在终末期。噬血细胞综合征主要表现为：①发热>7 d，体温>38.5cC；②肝脾肿大；③外周血两系或三系减少，且非骨髓造血功能减低所致；④高甘油三脂血症和或低纤维蛋白原血症；⑤骨髓、淋巴结、脾脏内组织细胞增生并伴噬血细胞现象，无恶性肿瘤证据。

3.2 实验室检查：ANKL患者白细胞可表现为异常增高，以淋巴细胞为主，也有表现为白细胞减少。部分患者可出现血红蛋白及血小板减少。常出现凝血功能异常。疾病后期，几乎所有患者都会有肝功能异常和全血细胞减少。乳酸脱氢酶通常升高。

【摘要】 目的 探讨人神经胶质瘤细胞u251逃逸同种异体nk细胞免疫杀伤的机制。方法 以k562细胞为对照，应用ldh释放法检测不同效靶比时nk细胞体外杀伤u251细胞的活性。用rt?pcr检测k562和u251细胞mhc?ⅰ类链相关分子a和b (mica/b)、人巨细胞病毒糖蛋白ul16结合蛋白(ulbp1～3)基因，用流式细胞仪检测两细胞mica/b、ulbp1～3和hla?ⅰ分子的表达情况。效靶比20∶1时用单抗分别阻断k562和u251细胞表面mica、micb、ulbp1、ulbp2、ulbp3和hla?ⅰ类分子，观察nk细胞对其杀伤活性的变化。结果 同一效靶比时nk细胞杀伤u251细胞的活性明显低于杀伤k562细胞的活性，两者之间差异有统计学意义(p＜0.05)；k562和u251细胞均表达基因mica/b和ulbp1～3，但u251细胞仅低表达ulbp2分子。用单抗封闭mica/b和ulbp1～3分子后，nk细胞对k562细胞的杀伤活性明显降低，对u251细胞的杀伤活性无明显改变。封闭hla?ⅰ类分子后nk细胞对u251细胞的杀伤活性明显上升，对k562细胞的杀伤活性无明显改变。结论 u251细胞逃逸nk细胞免疫杀伤机制可能是由于u251细胞高表达hla?ⅰ类分子，不表达nkg2d的配体mica/b和ulbp1～3。 【关键词】 神经胶质瘤 然杀伤细胞 自然杀伤细胞受体 细胞毒性试验 hla?ⅰ分子

神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，其发病率占全部脑部肿瘤的50%以上。因其生长活跃，沿神经纤维呈浸润性生长，与脑组织无明显的界限，外科手术难以完全切除。加上脑组织对射线的耐受性差及血－脑脊液屏障对药物渗透的限制作用，恶性神经胶质瘤对化疗和放疗仅为中度敏感，大部分肿瘤会在原肿瘤周边0.5～3.0cm范围内复发[1]。所以需要其他辅助治疗方法来控制肿瘤的复发，以延长生存期，改善远期疗效。nk细胞是肿瘤免疫治疗的新的研究热点。随着临床和基础研究进展，人们发现部分神经胶质瘤细胞有逃避nk细胞免疫杀伤的生物学行为[2]。本研究以k562细胞为对照，探讨人神经胶质瘤细胞u251逃逸nk细胞杀伤的机制，为提高nk细胞免疫治疗效果，寻找新的免疫治疗方案提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和细胞株 nk细胞分离缓冲液和抗cd56免疫磁珠(miltenyi biotec公司)，amo?1(anti?mica, igg1)、bmo?1 (anti?micb, igg1)、m295(anti?ulbp1, igg1)、m310(anti?ulbp2, igg1)、m551(anti?ulbp3, igg1)(德国alexander. steinle教授惠赠)，fitc标记的鼠抗人hla?ⅰ类分子单抗（w6/32, igg2a）和山羊抗小鼠igg (ebioscience公司)，rpmi1640(gibco公司)，ldh杀伤活性检测试剂盒(promega公司)，trizol (invitrogen公司)，takara rna kit(amv)ver.3.0（takara公司），胎牛血清(杭州四季青公司)。人神经胶质瘤细胞株u251由中南大学湘雅医学院遗传研究所惠赠，人红白血病细胞株k562由本室冻存。用含10%胎牛血清的rpmi1640培养基，在37℃、5%co2、充分湿度的孵箱中培养，实验用细胞均处于对数生长期。

1.2 nk细胞的分离纯化 用梯度密度沉淀法常规分离5例健康个体外周血单个核细胞，pbs洗涤2次，计数细胞，按每107细胞加入80μl nk细胞分离缓冲液和20μl抗cd56免疫磁珠，4℃孵育15min，加入1ml的缓冲液，离心，弃上清。然后按108细胞/500μl缓冲液悬浮细胞，加入minimacs磁场中的分选柱，进行分离。用500μl缓冲液冲洗分选的阳性细胞，共3次。取下分选柱，置于无菌试管上，加入rpmi1640培养基1ml，用推注器推出分选的阳性细胞，获得cd3-cd56+细胞即为nk细胞。

1.3 nk细胞的细胞毒实验 用5%胎牛血清rpmi1640悬浮u251和k562细胞，作为靶细胞，加于96孔板中，每孔1×104细胞/50μl。以nk细胞为效应细胞，按不同效靶比(5∶1、10∶1、20∶1、40∶1)分别加入相应数量的效应细胞50μl。另设培养基对照孔，效、靶细胞自然释放孔，靶细胞最大释放孔，各组均设3个复孔。于孵箱中培养4h，靶细胞最大释放孔提前45min加10μl裂解液，离心，每孔吸取上清50μl转入另一96孔板中，加入50μl ldh底物反应液，室温避光放置30min，每孔加50μl反应终止液，酶标仪490nm处测od值。抗体封闭试验以效靶比20∶1时，amo1、bmo?1、m295、m310和m551分别与k562和u251细胞室温孵育15min，再加入nk细胞检测杀伤率。nk细胞杀伤率(%)=(实验组od平均值-靶细胞自然释放组od平均值-效应细胞自然释放组od平均值)/(靶细胞最大释放组od平均值-靶细胞自然释放组od平均值)×100%。

1.4 mhc?ⅰ类链相关分子a和b(mica/b)和人巨细胞病毒糖蛋白ul16结合蛋白(ulbp1～3) mrna的检测 引物参考文献[3]设计，由上海生工公司合成。收集k562和u251细胞，用trizol一步法直接提取总rna，紫外分光光度计测rna含量。取2μg总rna，加入20μl逆转录体系(25mm mgcl2 2μl、10mm dntp mixture 2μl、10×rt buffer 1μl、20μmol/l特异性下游引物0.5μl、rnase free ddh2o 3.75μl、rnase inhibitor 10u、amv reverse transcriptase 2.5u)混匀，50℃ 20min，99℃ 5min，5℃ 5min终止反应。直接在逆转录反应产物中加入40μl pcr反应体系(5×pcr buffer 10μl、takara ex taq 1.25u、20μmol/l上游特异性引物0.5μl、ddh2o 29.75μl)混匀。95℃预变性5min，95℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1min，35个循环，72℃ 10min终止反应。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析仪观察结果。

1.5 mica/b和ulbp1～3和hla?ⅰ分子测定 收集肿瘤细胞，pbs洗涤2次，计数细胞，分管，用直接标记法检测hla?ⅰ类分子，按1μg/106细胞浓度加入w6/32，4℃孵育30min，pbs洗涤3次。用间接标记法检测mica/b和ulbp1～3分子的表达，加入amo?1、bmo?1、m295、m310和m551一抗，4℃作用30min，pbs洗涤后再加fitc标记的山羊抗鼠igg1二抗，4℃孵育30min，pbs洗涤后上机，以同型igg1抗体( pharmingen公司)为阴性对照。用流式细胞仪分析1×104细胞中阳性细胞数，计算百分率。为减少误差，重复实验3次。

摘要：NK细胞和NKT细胞是淋巴细胞的亚群，他们有共同的表型和类似的作用。这两类免疫细胞能够对结核分枝杆菌（TB）的感染做出迅速的反应并参与到抗结核免疫应答中。近年来，基于NK和NKT细胞为基础的新抗结核疗法正在引起科学界的关注。而深入了解NK和NKT细胞在结核病中的效应作用、迁移形式和生存特性，将有利于将这些细胞应用到结核病免疫治疗之中。为此，本文综述了近年来NK和NKT细胞在结核病的进程中形成免疫反应的机制。

关键词：NK细胞；NKT细胞：结核；细胞因子

Progress of the study on NK cells in anti-TB immunity

Zhang Junai Xu Junfa

Abstract：Natural killer (NK) cells and natural killer T (NKT) cells are subsets of lymphocytes that share some phenotypical and functional similarities. Both cell types can rapidly respond to the cells infected tubercle bacillus and participate in antitubercular immune responses. In Recent years, this has prompted interest in the development of innovative antitubercular therapies that are based on the manipulation of NK and NKT cells. The use of these cells in TB immunotherapies awaits a better understanding of their effector functions, migratory patterns and survival properties in TB. Therefore, this article has reviewed the mechanism that NK and NKT cells forms immune response in the process of tuberculosis in recent years.

Keywords: NK cells;NKT cells; Tuberculosis; Cytokin

【中图分类号】R285.53 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783(2012)06-0603-03

人结核病是世界范围的疾病，它是由于结核分枝杆菌感染引起的，其主要感染人体的肺部。据统计，目前全世界约有1/3人口感染结核性分支杆菌，其中少数才有肺结核病并出现临床症状，90%的细菌是依靠自身免疫反应得以控制的，5%发展为早期进展性肺结核，5%会进展为结核病，发展为结核病的病例被认为是活动性或者是初次感染后肺结核[1]。近年来，随着结核菌株基因的变异、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的流行以及对结核病不正规的化疗等原因，造成结核病卷土重来。在有抵抗力的个体中，对此感染的控制需要加强Th1类细胞免疫反应，这种反应需要巨噬细胞和CD4+T细胞、CD8+T细胞和Tγδ淋巴细胞的参与，还有细胞因子IL-2、IL-12、γ-IFN、IL-18和肿瘤坏死因子α（TNF-α）与化学增活素如：RANTES, MCP-1, MIP-1α和 IL-8在对不同细胞亚群迁移到感染区域形成结节中起到重要的作用。NK细胞的表面标记物主要包括CD56、CD16、CD2、CD11a/CD18及其活化或抑制有关的受体。其中CD56和CD16是NK细胞相对特异性的标记。而NK细胞，和上皮细胞一起，是固有性免疫反应中必不可少的一部分[1]。如在心肺移植免疫抑制治疗后，患者出现肺结核，加激素治疗后得到好转，在其肺泡中出现与NK细胞特异相关的CD4-CD8-T淋巴细胞亚群产生的CD16+CD56+表型[2]。在NK细胞被清除的动物中，抗体和细胞因子应答减弱[3]，表明NK细胞在抗结核免疫中起到了重要的作用。NK细胞对肿瘤、病毒感染的细胞和细胞内寄生物具有强大的细胞毒素活性的特征。在缺乏TCR-CD3复合物和表面免疫球蛋白并且表达CD56抗原时，NK细胞是固有性免疫的关键组成部分[4]。休眠的NK细胞在血循环中，一旦被活化，他们就能够迁移和渗透到局部靶细胞感染的区域[4]，从而发挥其杀伤靶细胞的作用。最近也发现NK细胞除了具有固有性免疫也具有适应性免疫的作用[5]，并且证明了在结核性胸膜液细胞（PFCs）中持续存在人NK细胞表达的记忆相关标记物CD45RO[6]。从而打破了NK细胞只能通过固有性免疫抵抗结核分枝杆菌的看法，认为其也具有适应性免疫的特性。

【摘要】

目的:回顾性分析30例早期鼻腔NK/T细胞淋巴瘤的生物学行为特点，为临床放疗靶区的设计提供参考。方法:收集2005年3月至2013年9月间收治的30例经病理证实为早期原发于鼻腔的NK/T细胞淋巴瘤患者的资料，根据AnnArbor分期标准，所有患者均为IE/IIE期且都有影像检查资料可查，并以影像学为标准分析邻近受侵器官和结构的数目，同时分析颈部淋巴结的转移情况。结果:鼻腔周围结构受侵患者占所有患者的比例为76．7%(23/30)，其具体受侵如下:上颌窦为36．6%、筛窦与鼻咽同为30%、鼻翼为20%、翼突与蝶窦同为10%，翼腭窝及额窦、硬腭、眼眶、口咽同为3．3%;头颈部淋巴结转移的患者占所有患者的比例为46．7%(14/30)，其具体转移如下:I区与II区同为26．7%，III区为10%，VIIa为6．7%，IV区与IX同为3．3%。结论:在早期鼻腔NK/T细胞淋巴瘤放射治疗时，其靶区的勾画应该考虑受侵和转移几率均较高的结构和区域。

【关键词】

鼻腔;NK/T细胞淋巴瘤;生物学特性

原发于鼻腔、鼻窦的非霍奇金淋巴瘤(NHL)是一种特殊类型的淋巴瘤，发病率占全部恶性淋巴瘤的2%～10%。亚洲地区发病人群中，以NK/T细胞来源多见，而B细胞来源则较少见［1－2］。放化疗对只伴有局部侵犯的早期病例疗效较好，而局部广泛、区域淋巴结浸润及远处播散病例疗效较差。本研究收集了30例病理证实为原发于鼻腔的早期NK/T细胞淋巴瘤患者的资料，并以影像学为标准分析其邻近受侵器官和结构的数目，并同时对颈部淋巴结的转移情况进行分析，以研究早期鼻腔NK/T细胞淋巴瘤的生物学特性，为临床放疗靶区的设计提供参考。

1资料和方法

1．1临床资料收集2005年3月至2013年9月间在本院接受治疗的30例经病理证实为早期原发于鼻腔的NK/T细胞淋巴瘤患者的资料，男性患者20例，女性患者10例，性别比例为2∶1。患者的中位年龄为45岁，所有患者均根据AnnArbor标准分期为IE及IIE期，其中IE期患者为13例，IIE期患者为17例(见表1)，30例患者都有MRI影像检查资料可查。

1．2治疗方法因所收集的病例时间跨度较大，30例患者接受的治疗方式有所差别。其中单纯化疗者9例，单纯放疗者11者，化放疗结合的10例。放疗多采用高能光子线及电子线，照射范围和放疗剂量遵循以下原则:肿瘤局限于一侧鼻腔，未侵犯临近器官或组织的患者照射靶区包括双侧鼻腔、双侧前组筛窦和同侧上颌窦;肿瘤超出鼻腔时，靶区扩大至受累的临近器官或结构，如果前组筛窦受侵，应包括同侧后组筛窦。如果肿瘤临近后鼻孔或侵犯鼻咽，照射野应包括鼻咽。对于淋巴结的处理原则为IE期患者不必做颈部淋巴引流区预防照射，IIE期在原发病灶和受侵器官/结构照射时，需同时做双颈照射。每天按1．8～2Gy常规分割照射，中位剂量为55Gy。早年的化疗以CHOP、ECHOP方案为主，后期以GDP、DICE方案为主。Ⅰ期病例化疗4疗程，Ⅱ期化疗6疗程，如2疗程化疗后评价为无效者改用放疗或更改方案。

[摘要]目的 探讨原因不明反复流产（URSA）患者外周血中T淋巴细胞亚群和NK细胞的变化。方法 选取2014年3月～2016年3月辽宁省计划生育科研院附属医院门诊确诊为不明原因流产患者50例作为观察组，并选取同期就诊的30例健康早孕妇女作为对照组。采用流式细胞仪检测两组妇女的外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞水平。结果 观察组外周血中CD4+和CD4+/CD8+比率明显高于对照组，差异有统计学意义（P0.05）。观察组外周血中NK细胞比率也明显高于对照组，差异有统计学意义（P

[关键词]原因不明反复流产；T淋巴细胞亚群；自然杀伤细胞；流式细胞术

[中图分类号] R714.21 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）04（a）-0087-03

Molecular Genetics Laboratory，Liaoning Province Research Institute of Family Planning，Shenyang 110031，China

[Abstract]Objective To explore the changes of T lymphocytes sub-types and NK cells in patients with unexplained recurrent abortion.Methods The patients were collected in the Liaoning Province Research Institute of Family Planning from March 2014 to March 2016. The 50 patients with URSA were selected as the observation group and 30 patients with voluntary abortion were selected as the control group.Flow cytometry was used to measure the number of T lymphocytes sub-types and NK cells in the two groups.Results The percentages of CD4+ and ratio of CD4+/CD8+ was significantly increased in peripheral blood of unexplained recurrent abortion patients （P0.05）.The level of NK cell was also significantly increased in peripheral blood of unexplained recurrent patients（P

[Key words]Unexplained recurrent abortion；T lymphocytes sub-types；NK cells；Flow cytometry

反复自然流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指连续发生了2次或2次以上的自然流产，是一种常见的妊娠并发症[1]。其主要原因有染色体异常、感染、内分泌失调和凝血异常，而排除这些因素后，其中有40%～80%的患者原因不明，称为不明原因反复自然流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[2]。正常妊娠需要母体建立起一个对胎儿局部免疫耐受的环境，如果免疫微环境失调则会导致流产的发生[3]。URSA是育龄妇女常见的妊娠并发症，已经成为困扰育龄妇女和临床工作者的一大难题，其发病机制目前尚不清楚。免疫因素在维持正常妊娠起着关键作用，T淋巴细胞亚群及自然杀伤细胞（natural killer，NK）在妊娠免疫中越来越受到重视，本研究通过比较URSA患者与健康早孕妇女外周血中T淋巴胞亚群和NK细胞比率，探讨URSA患者外周血中免疫细胞的变化，同时为URSA患者治疗提供理论依据，避免流产的发生。

1资料与方法

作者：石铭 张静 韩博 石龙 【关键词】 NK细胞

【摘要】 目的 探讨肝炎患者外周血T淋巴细胞AgNORs含量及NK细胞活性变化。方法对198例肝炎患者及30例正常人进行T淋巴细胞AgNORs NK细胞活性及HBV-DNA含量检测。结果乙肝患者随着病情的加重，T淋巴细胞AgNORs含量逐渐降低，急性肝炎患者NK细胞活性与轻度慢性肝炎之间比较无差异外，与其他各型肝炎比较，差异均有非常显著性（P<0.01），各型肝炎间HBV-DNA含量差异无显著性。肝炎患者体内HBV-DNA含量对T淋巴细胞AgNORs含量、NK细胞活性无影响。结论 T淋巴细胞AgNORs含量及NK细胞活性在肝硬化患者中极度降低，可以作为一项监测肝炎患者病情轻重的指标。

关键词 乙型肝炎 AgNORs NK细胞

【Abstract】 Objective To study the change between the quantity of AgNORs in T Lymphocyte cell and NK activity in the peripheral blood of hepatits B.Methods We selected198patients of hepatitis B and30normal peoˉple，whomwere examined the quantity of AgNORs in TLymphocyte cell and NK activity.Results The quantity of AgˉNORs was reduced with the damage of the liver tissue.Among the patients，the NK avtivity changed significantly except the acute and mild patients，the quantity of HBV DNA is not evidently changed.It shows that there is no relation beˉtween the quantity of HBV DNA AgNORs and NK activity.Conclusion The quantity of HBV DNA and AgNORs reˉduced evidently in liver cirrhosis patients，it can be used as a factor to survey the damage of the liver.

Key words hepatitis B AgNORs NK

各种病毒感染均可导致机体免疫系统功能的变化。乙型肝炎病毒（HBV）感染后发的免疫系统改变是一令人普遍关注的问题。而T淋巴细胞及NK细胞则是机体免疫系统内功能最重要的一大细胞群，正常情况下T淋巴细胞及NK细胞群相互作用，维持着机体正常的免疫功能，当T淋巴细胞及NK细胞的活性发生异常时，就可导致机体免疫功能紊乱，并发生一系列的变化，机体的细胞免疫功能状态的好坏又与乙型肝炎病毒的清除密切相关。本课题通过对不同肝炎患者按照病理组织学诊断进行病理分级，来观察肝炎患者间外周血T淋巴细胞AgNORs含量和NK细胞活性变化。

1 资料与方法

1.1 病例选择 198例乙肝病人为我院2001年12月～2003年11月住院病人，病人肝穿诊断标准参照2000年全国第十次（西安）传染病与寄生虫病会议修订的诊断标准。