微生物多样性分析
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微生物多样性分析范文第1篇
中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）13-0036-03
Study on Soil Microbial Diversity in Heavy Metal Contaminated Soil
Li Yan1 et al.
（1Anhui Huajing Resources and Environment Technology Co.，Ltd.，Hefei 230094，China）
Abstract：In this paper，the research methods of microbial diversity of heavy metal contaminated soils in recent years are summarized，and their advantages and disadvantages and their application are analyzed. The research methods of microbes are also discussed.
Key words：Heavy metal pollution；Soil microbes；Microbial diversity；Research methods
近年来，由于农药、化肥的大量使用，以及冶金、采矿业的迅猛发展，土壤重金属污染日趋严重[1]。重金属污染不仅会严重影响农产品以及农作物的品质，而且会通过食物链进入人体，危害人体健康。土壤是微生物栖息的最重要环境之一，提供了微生物生长所必要的营养物质。土壤微生物种类十分丰富，主要分为细菌、真菌、古菌以及放线菌等。土壤微生物是土壤有机质以及土壤养分C、N、P、S等循环转化的动力，参与土壤中有机质的分解、腐殖质的形成、土壤养分的转化循环等[2]。土壤微生物在土壤生态系统中扮演者十分重要的角色[3]，对环境的变化反应灵敏[4]，其群落多样性和相对组成，是评价环境质量的重要参数[5]。一旦土壤生态系统受到污染，土壤微生物就会发生相应的变化[6]。有研究报告指出，土壤重金属污染能明显影响土壤微生物的活性及结构[7]，李晶等[8]研究也表明，土壤微生物对重金属胁迫特别敏感，可通过微生物群落结构的变化来反映土壤质量和健康状况[9]。因此，研究土壤微生物具有十分重要的意义。本文对研究微生物传统以及各种新型研究方法进行了分类介绍，并对各种方法的优缺点以及适用场合进行说明。
1 土壤微生物研究方法
1.1 传统的分离纯培养和稀释平板计数 在固体琼脂培养基上接种培养微生物，可利用微生物的表面特征差异，在固体培养基上对微生物进行分离纯化，也可利用该方法对微生物在平板上进行简单的计数[10]。同时可以通过配制不同成分的培养基对微生物进行筛选驯化，从而得到我们需要的菌种。此种方法的优点是成本低，便于对微生物的状况做出初步的判断。缺点是由于自然界中存在大量的不可培养的微生物，且存在很多对温度要求苛刻并微生物，如嗜低温菌和嗜高温菌，传统的固体培养基的培养温度并不能满足这些微生物的生存所需温度。
1.2 Biolog微平板法 Biolog微平板原理是基于测定微生物对单一碳源利用程度的差异来表征微生物的生理特性[11]。Biolog微平板由对照孔和95种不同单一碳源孔组成并在其中添加染料，当接种纯培养的菌液时，其中一些孔的营养物质被利用，使各孔呈现出不同的颜色，从而形成微生物特有的代谢指纹，可通过与标准菌种的数据库做对比，从而可鉴定出被测菌种。与传统培养方法相比，此方法可以估算微生物群落代谢多样性和功能多样性。同时可根据各孔的颜色差异来反映出微生物群落的均匀度，从而可以反映出群落的稳定性[12]。该方法的缺点是当环境差异不大时，这些指数并不能较敏感地区分菌群之间的差异[13]。同时由于不同的生长和竞争的结果，菌种之间会相互影响导致种群发生变化，影响测定结果[14]。
1.3 磷酸脂肪酸分析法（PLFA） 磷酸脂肪酸存在于活细胞的细胞膜中，具有属的特异性，不同属的微生物通过不同生化途径而形成不同的磷酸脂肪酸（PLFAs）[15]。因此，土壤中的PLFAs组成和含量变化在一定程度上可反映土壤中微生物量和群落的动态变化。通过对微生物的磷酸脂肪酸进行提取，并依据其中的特征脂肪酸指示的微生物种类[16]，可对土壤中微生物群落特征进行表征。此种方法具有对试验条件要求低、无需对微生物进行培养、测试功能多和稳定性好等优点[17]。但PLFA法也具有一定的局限性。该方法只能鉴定到属，PLFA图谱并不能给出一个实际的微生物种类组成，仅能反映微生物群落的概图[18]；另外，该方法容易受微生物生理状态影响[19-20]；古菌不能使用PLFA图谱进行分析，因为它的极性脂质是以醚而不是以酯键的形式出现[21]。同时由于目前尚未建立土样中所有微生物的特征脂肪酸，并且在很多情况下，还无法确定土样中某些脂肪酸与特定微生物或微生物群落的对应关系[22]。
1.4 变性梯度凝胶电泳技术（PCR-DGGE） 该技术是以复杂的环境样品如土壤为研究对象，直接提取微生物DNA，利用通用引物进一步对提取的DNA进行PCR扩增。将扩增产物开展DGGE凝胶电泳分析[23]。DGGE不是将分子量不同的DNA分开，而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同，将序列不同的DNA分开[24]。该方法的原理是根据DNA的解链特性，不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所需要的变性剂浓度不同。在普通的聚丙烯酰胺凝胶基础上加入变性剂，根据其迁移行为决定于其分子大小和电荷的原理能够将长度相同但序列不同的DN段区分开[25]。该方法具有可靠性高、重现性强、方便快捷、分辨率高等优点[26]，但同时也存在一定的局限性。DGGE还不能全面分析土壤中全部微生物，该方法只能检测出土壤中相对丰度大于1%的微生物[27]；同时DGGE对实验要求较高，凝胶浓度、温度、电压等电泳条件选择不当时，就会发生共迁现象[26]，即同一条带不止包含一种微生物，微生物的种类被低估。
1.5 高通量测序技术 高通量测序技术也称“下一代”测序技术，1次并行能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。以Illumina公司的Solexa，ABI公司的SOLiD，和Roche公司的454技术为代表[28-29]。该技术对于研究土壤微生物具有极大的意义。该技术极大地降低了微生物测序成本，实验了大规模土壤微生物直接测序[30]；同时该方法极大地提高了测序通量，丰富了研究的信息量，便于研究者更加深入地了解所研究课题。但同时该方法也存在一定的局限性，主要局限性如下：海量数据分析难的问题，该测序方法所测数据之深，所获信息之大，都极大地加大了实验研究者分析数据的难度；数据去伪存真难的问题，在土壤微生物高通量测序中，存在物种丰富度被高估的情况[30]，对高通量测序结果去伪存真，探索新的统计学方法成为研究者面临的一大难题[31]。
1.6 基因芯片技术（GeoChip） 基因芯片（GeoChip）是研究土壤微生物非常有效的技术手段，作为新一代的核酸杂交技术，可用于检测环境微生物参与物质循环、污染物降解等过程中参与的功能基因[32]。该方法是在芯片上含有编码各种与生态学和生物功能过程或生物降解作用有关酶的基因[33]。由此可见，功能基因芯片为土壤微生物研究提供了全新有力的技术分析工具，有利于更加有效地利用微生物对污染土壤进行修复[34]。基因芯片技术具有高密度、高灵敏度、自动化和低背景水平等显著优点[35]。但是任何技术都存在一定的局限性，基因芯片技术也不例外。该技术虽能检测出微生物在生物学过程中所发挥作用的功能基因，但是却不能直接表征微生物的群落多样性组成和丰富度。应结合DNA与mRNA测序，可以更加真实全面地反映土壤微生物群落结构信息及其生理活动[34]。同时该方法在取样、标记、杂交条件、图像处理、数据归一化以及所得数据的质量评估等都会带来很多误差[36]。
2 不同方法在重金属污染土壤中的应用
刘云国等[37]在湖南临乡桃林矿区土壤中采用稀释涂布法在马丁固体培养基上筛选出一株高抗铜、锌菌株；张秀等[38]利用Biolog微平板法来分析生物质炭对镉污染土壤微生物多样性的影响；孙婷婷等[39]利用磷酸脂肪酸分析法来分析羟基磷灰石-植物联合修复对Cu/Cd污染植物根际土壤微生物群落的影响；郑涵等[40]利用PCR-DGGE分析方法对锌胁迫对土壤中微生物群落变化的影响进行了评价分析；江玉梅等[41]利用Illumina平台高通量测序技术分析重金属污染对鄱阳湖底泥微生物群落结构的影响；路桃香对植物非根际土壤微生物进行454高通量测序。
目前对于微生物研究方法有很多种，有最先进的技术，也有传统的实验方法，每种方法都各有优缺点，因此，在研究土壤微生物时，应结合土壤特征以及研究目的合理选择研究方法。如条件允许的情况下，可以结合多种技术方法同时使用，可以更好地研究土壤微生物的群落特征。
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微生物多样性分析范文第2篇
Abstract: At present,with the rapid development of China's economy,the current extensive economic growth mode has the low utilization of water resources,resulting in shortage of water resources. China's economy is not yet developed,due to inadequate sewage treatment facilities and higher operating costs,many cities discharged the majority of untreated urban sewage into water bodies,causing pollution of water environment. Water pollution has become one of the main factors that restrict China's urban construction and economic development. In the author's opinion,sewage treatment technology is desperately needed.
关键词:污水治理;水源保护;生态学分析
Key words: sewage treatment;water conservation;ecological analysis
中图分类号:TU992文献标识码:A文章编号:1006-4311(2010)15-0170-01
0引言
水是人类社会生产和生活必不可少的宝贵自然资源,也是生物赖以生存的环境资源。工业革命以来,随着科技进步和社会生产力的极大提高,人类创造出前所未有的物质财富,加速推进了文明发展的进程。与此同时,人类的生产生活活动产生的污染也造成了水环境质量不断恶化和水资源危机的加剧,水环境污染与水资源短缺已演变成备受全世界关注的资源环境问题,严重地阻碍着经济的发展和人民生活质量的提高,继而威胁着人类的未来生存和发展。
1我国污水治理的技术环境
在污水治理设备方面,总体技术也落后于国际先进水平,仅为国际20世纪70-80年代的水平。这些污水治理设备仅仅可以满足一般工业废水和生活污水的处理需求。由于处理设备单机产品多,系列化程度低,成套装置生产不足,严重缺乏生产高新生物技术处理设备的能力。我国生产的用于城市污水治理的动力设备,如鼓风机、水泵等,普遍存在能耗较大的问题,造成我国城市污水治理设施的运营费用居高不下,在一定程度上也制约了我国城市污水治理产业的发展。[1]
2我国的污水治理技术
2.1 厌氧生物处理技术厌氧生物处理技术的能耗较低,可以回收生物能(如:沼气),污泥产量较低。厌氧微生物可以对好氧微生物所不能降解的有机物进行降解或部分降解;对温度、pH等环境因素要求较高。但整体来说,经厌氧生物处理的出水,水质较差,需要进一步利用好氧法进行处理,伴随气味较大,对氨氮的去除效果不理想。
2.2 好氧生物处理技术常用的好氧生物处理工艺有三大类:活性污泥法、生物膜法、膜生物反应器工艺。
①活性污泥法工艺。活性污泥法主要包括传统性污泥法污水处理技术、氧化沟技术、间歇式活性污泥处理技术(SBR,Sequencing Batch Reactor)和AB法污水处理技术。SBR法的工艺流程简单,且造价低,主体设备只有序批式间歇反应器,无需二沉池和污泥回流系统,初沉池也可省略。具有布置紧凑,占地面积小的特点,可根据水质和水量情况灵活运行,具有良好的脱氮除磷效果。[2]②生物膜法工艺。污水的生物膜处理技术既是传统的,又是发展中的污水生物处理技术。迄今为止,属于生物膜处理法的工艺有生物滤池(普通生物滤池、高负荷生物滤池、塔式生物滤池)、生物转盘、生物流化床、曝气生物滤池(BAF)、生物接触氧化、纯氧生化处理等。生物滤池是早期出现、至今仍在研究、发展中的污水生物处理技术,而后三种则是近几十年来开发的新工艺。③膜生物反应器工艺。膜生物反应器MBR是二十世纪未发展起来的新技术,它是膜分离技术和活性污泥生物技术的结合。它不同于活性污泥法,不使用沉淀池进行固液分离,而是使用中空纤维膜替代沉淀池,因此具有高效固液分离性能,同时利用膜的特性,使活性污泥不随出水流失,在生化池中形成超高浓度的活性污泥浓度,使污染物分解彻底,因此出水水质良好、稳定,出水细菌、悬浮物和浊度接近于零。生活污水处理后可直接回用,在污水处理方面具有传统工艺所不具备的优点。
2.3 污水的自然处理技术污水的自然生物处理方法主要是利用自然的生态系统如土地、湿地等,通过生态系统中的动物、植物与微生物协同作用,去除污水中污染物的一种方法。我国在“七五”期间就已经对废水土地处理技术进行了广泛的研究,解决了许多技术上的问题,“八五”期间又列入了国家攻关重点项目,这也为我国推广应用土地处理系统创造了条件。[3]
3PLFA方法分析曝气生物滤池微生物的研究
3.1 PLFA方法在水体微生物群落结构和生物多样性分析中应用在现有的关于水中微生物群落的研究中,PLFA一般只能定性的、粗略的区别革兰氏阳性、阴性、好氧细菌、厌氧细菌、放线菌、真菌等,很少能用来定性的测量指定种属的微生物。目前,只有少数几种PLFA生物标志物可以指示某些种属的细菌,如硫酸盐还原细菌等。地下水中原生动物的PLFA标志物的发现有助于了解深层含水层中微生物食物链结构和微生物的活性,在地下水的微生物修复方面具有重要意义。[4]
3.2 PLFA方法在沉积物微生物群落结构和生物多样性分析中应用江、海等沉积物的微生物区是由复杂的微生物群落组成,它能够完成主要的矿化反应,这对营养元素的循环和大部分深海食物链的形成具有重要作用。使用PLFA谱图分析方法能够获得有关沉积物中微生物生物量和群落结构的信息,沉积物样品可以不进行处理,也可以是冷冻或冻干的。PLFA法在沉积物微生物群落结构和生物多样性分析中的应用,对污水治理技术的提高有着重要的现实意义。
4结语
水是人类赖以生存的三大生命要素之一。在我国,经过几十年的改革开放,经济得到了迅猛发展,同时也带来了诸多环境问题,尤其是水污染十分突出,严重制约着社会经济和环境的可持续发展。随着我国工业、农业的迅速发展和人们生活水平的提高,水体污染现象越来越严重,直接威胁着人类的生命健康和整个生态系统的稳定性。严峻的水形势迫切要求我们必须大力进行污水处理及其资源化,同时由于我国经济水平尚不发达,更迫切需要我们研究、推广和应用处理高效、投资节省、运行低耗的污水处理新技术。
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微生物多样性分析范文第3篇
【关键词】DGGE；微生态；纯培养
1.DGGE技术的原理
变性梯度凝胶电泳（DGGE）是根据小片段DNA分子（1kb以下）的熔解温度不同来分析DNA分子的多样性，理论上可以检测到单个碱基替换的DNA分子。DN段在丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于自身的物理性状，熔解状态的DNA分子片段在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度比双链DNA分子慢[4]。当DN段处在变性剂浓度不断增加的凝胶系统中，随着电泳的迁移就会部分融化，达到一定变性剂浓度时DNA就会熔解为单链的分子，这些离散的碎片集中在一个比较狭窄的变形梯度范围内，这样不同的DNA分子在不同变性剂浓度下熔解，在整个电泳图谱中成楼梯式排列。通过对比熔解状态下DN段的多态性，就可以推测有碱基突变或序列差异的DNA分子片段。
为了提高检出率可在DNA一端加入一个高熔点区―GC夹（GC clamp）；GC夹就是在一侧引物的5′端加上一个30～40bp的连续GC碱基，这样在PCR产物的一侧可产生一个GC夹的高熔点区，从而使相应的部分序列处于低熔点区而便于检测分析；这样，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%[4]。
2.DGGE技术在微生物生态学中的应用
自然界中85%～99.9%的微生物是不可纯培养的[5]，并且微生物的形态具有难观测性和可变性，在传统的实验方法下不能提供足够的微生物学信息，这严重阻碍了对自然环境中微生物构成及特征的客观认识。PCR-DGGE 技术在微生物生态学中的一个最主要的应用就是分析微生物群落构成，Muyzer 等人于1993年首次将DGGE技术应用于微生物膜系统和生物菌苔的群落多样性分析。此后，该技术被广泛应用于各种微生物生态系统的检测，绝大部分研究都是通过扩增原核生物 16S rDNA 基因来研究各生态系统中的古细菌或细菌的群落多样性[6]，或者用真菌的通用引物扩增18SrDNA 基因，从而研究真菌的群落多样性，另外除了通过rDNA基因来分析微生物群落结构组成外，还可以通过扩增功能性基因来研究功能基因及功能菌群的差异。
Lam等利用DGGE技术对真菌18SrDNA的序列进行分析，研究Magnolia liliifera叶片中真菌的多样性，结果在叶片的不同部位得到通过培养和形态学研究未能得到的14株不同菌株[7]。Eeva等对挪威红杉残枝样本直接进行DNA提取，利用DGGE分析通过FR1和NS1引物对扩增的1650 bp rDN段，结果得到了46株木材腐烂真菌，为真菌群体中难培养的菌株的检测提供了新的方法[8]。Zhou等对藏灵菇发酵液里的真菌和细菌的DNA进行提取后，扩增细菌16SrRNA和真菌28SrRNA上的相应片段，之后用DGGE进行分析得到11株优势菌株，并且在不同样本之间细菌存在78～84%的相似度，酵母存在80-92%的相似度[9]。
PCR-DGGE 技术在微生物生态学中的另一个重要应用是检测微生物的动态变化。宋亚娜等运用16SrDNA和18S rDNA特异性引物对，将土壤中提取的总DNA进行PCR扩增后，通过DGGE技术对PCR产物进行分析，研究不同间作和轮作种植体系对作物根际真菌和细菌菌落结构的影响，结果表明，间作明显改变玉米的根际细菌、真菌的菌落结构[10]。Takada利用PCR-DGGE研究化学熏蒸后对散土和菠菜根部土壤中真菌群落的变化，结果表明，三氯硝基甲熏蒸两个月后，在散土和菠菜根部土壤中真菌的多样性都减少，并且一年后真菌的多样性并没有完全恢复到原来的水平，但是菠菜根部土壤中真菌减少量比散土中要少，1，3-二氯丙烯处理两个月后，真菌的多样性只发生微小的改变，并且六个月后就与对照组没有显著差异了[11]。
PCR-DGGE技术还可用于发现新的微生物菌株。Santegoeds等通过DGGE分析细菌16SrRNA上的基因片段来检测多次富集培养的菌藻系，得到了14条独特的16SrRNA基因序列，其中有10个细菌株的基因是以前利用纯培养手段及单纯的分子技术方法均没有发现的[12]。
3.DGGE技术的局限性及改进方法
DGGE 技术作为一种分子生物学手段在研究微生物群落的动态行为和复杂性方面发挥着重要的作用，是目前被普遍接受的的分子生物学工具，但是作为一种分子水平上的技术，除了具有多数分子技术所固有的缺点之外（如PCR产物偏差等），本身也有一定的应用局限性。
首先，利用DGGE分离的PCR产物一般要求DNA长度在200～ 700bp范围内[1]，超出该范围DGGE的分辨率会下降，然而这些序列只能提供有限的系统发育信息，不利于判断微生物所属的系统类群。其次，DGGE通常显示的是微生物群落中的优势种群，Muyzer研究发现该技术只能对菌体数量大于总菌量1%的菌群进行分析[1]。再次，每种菌可能含有数目不等的rRNA基因[13]，则可能会导致群落中菌株数量被过多的估计从而夸大群落差异性和多态性。另外，如果选用的条件不是特别适宜就不能保证将每类DN段完全分开，这样序列不同的DN段迁移到凝胶的同一位置，导致同一条带中含有不同种类的细菌[14]。
对于DGGE存在的这些缺限我们可以通过各种手段加以改善，例如可以优化电泳及PCR的条件从而减少误差，并且在进行DGGE之前通过软件来分析检测PCR过程中形成的嵌合体，另外，可以与其他技术方法相结合，如纯培养、直接形态观察、原位杂交、核酸探针检测技术等，这样不仅更客观的从多方面反映环境中微生物的多样性信息，还可以与其他方法相互补充，从而不断提高分子微生物生态学的研究水平。DGGE技术与传统方法或其它分子生物技术的结合进一步促进了人们对微生物生态的认识；随着分子生物学技术的快速发展，DGGE技术将会得到不断的补充和完善，必将在微生物生态研究中发挥更大的作用。
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微生物多样性分析范文第4篇
[关键词] 杭白芍；根际；变性凝胶梯度电泳；微生物多样性；高效液相色谱；芍药苷
[收稿日期] 2013-12-13
[基金项目] 中国博士后科学基金项目（2013M531484）；浙江省博士后科研项目（BSH1301033）；浙江省高校中青年学科带头人学术攀登项目（pd2013215）
[通信作者] 袁小凤，博士，副教授，主要研究方向为药用植物学，Tel：（0571）86633051，E-mail：
白芍为毛茛科芍药属植物芍药Paeonia lactiflora的干燥根，在中国有悠久的栽培历史，驰名中外，其根并入药，能养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳。临床用于血虚萎黄，月经不调，自汗，盗汗，肋痛，腹痛，四肢挛痛，头痛眩晕。主产浙江、安徽、四川等地。此外，山东、贵州、湖南、湖北、甘肃、陕西、河南、云南等地亦产。浙江产杭白芍的品质最佳，居全国芍药之首，是著名的道地药材“浙八味”之一。杭白芍为多年生草本，其生长周期4～6年，生产实践中以4年收获白芍根最为常见，药典规定白芍饮片含芍药苷（C23H28011）不得少于1.2%[1]。目前，在我国耕地面积降低以及后备耕地资源不足的情况下，为提高耕地利用率，有必要研究1～4年的杭白芍其药效成分的累积动态及中药品质，了解生长年限对杭白芍品质的影响，探索采收种植4年杭白芍的合理性。
研究表明，道地药材是一个与生态环境、遗传密切相关的开放的复杂系统[2]。道地药材的道地性与产地的气候、土壤理化条件等环境生态方面关系密切[3]。其中，土壤微生物是土壤生态系统的核心，它们直接或间接参与了土壤中几乎所有的物理、化学和生物学反应，对土壤肥力及植物生长代谢非常重要，对道地药材内在成分的质量影响最大[4]。目前有关杭白芍的研究主要集中在药效、栽培和加工等方面，对于白芍的土壤微生物等关注不多，而了解其微生态环境对杭白芍生长的作用，以及杭白芍的生长年限反过来对微生态环境的影响，有助于阐明杭白芍道地性形成的微生态作用机制。因此，作者栽培并收集了1～4年杭白芍的根，同时收集其根际土壤，利用HPLC检测根中芍药苷含量，利用PCR-DGGE检测土壤菌群多样性，分析杭白芍根际土壤微生态与杭白芍品质的关系，为探索中药道地性与环境生态的相关性提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 实验设计和样品采集 野外栽培实验设在规范栽培基地磐安，实验分4组：2011年栽培的杭白芍（一年生）；2010年栽培的杭白芍（二年生）；2009年栽培的杭白芍（三年生）；2008年栽培的杭白芍（四年生）。实验地设在同一块地，土壤类型完全相同，每一组1 m×5 m，相邻而种，整个实验过程设专人管理。2011年的7月12日晴天下午14：00左右采样，用五点取样法分别采集一至四年生杭白芍根及其根际土壤[5]。采样时，刨去表层土壤，将白芍整个植株挖出，轻轻抖掉根系上的大块土壤，收集仍旧黏附于根部的土壤颗粒，每组大概随机采集10株左右，所收集的土壤混匀，过20目筛，以去除动植物残体和石块，此为根际土。将混合的根际土装入50 mL无菌离心管，每组3管，放入冰盒，速带回实验室，保存于-20 ℃冰箱中，用于菌群多样性检测。同时采集50 g左右的根际土装入无菌袋中，这部分土样将自然风干，用于土壤理化性质检测。非根际土为对照土，是指与根际土相对应的土壤，采自与植物杭白芍根际有一定距离的同一地块中，采集后现场处理方法同根际土。此外，采挖芍药根，除去根茎及须根，洗净，刮去粗皮，入沸水中略煮，使芍根发软，捞出晒干、切片、打粉后待用[1]。每个样品3个重复。
1.2 土壤pH、有机质及酶活的检测 采用电极法[6]测土壤pH，低温外热重铬酸钾氧化-比色法[7]测土壤有机质，苯酚-次氯酸钠比色法[8]测土壤脲酶活性，磷酸苯二钠比色法[8]测定土壤磷酸酶活性。
1.3 土壤总基因组DNA提取及PCR扩增 称取1.0 g土壤样品进行总基因组DNA的提取，具体的提取步骤按照UltraCleanTM土壤DNA提取试剂盒说明书进行，提取完成后用1%的凝胶电泳进行检测，将获得的DNA放置-20 ℃冰箱保存。将提取的土壤DNA作为模板，使用Eppendorf的PCR system 2700型基因扩增仪，采用细菌通用引物对F357和R518（F357： 5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′；R518： 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′），同时，在上游引物F357前加了GC夹CGCCCGCCGCCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCC[9]，以提高变性凝胶梯度电泳DGGE的分离效果。
PCR反应体系50 μL包括20～50 ng的DNA模板，25 pmol引物，100 μmol・L-1 dNTPs，2.5 μL的二甲基亚砜（DMSO）以及5 U的Taq DNA聚合酶。采用Touchdown-PCR策略：94 ℃预变性4 min，前20个循环，94 ℃变性45 s，65 ℃退火75 s（每个循环下降0.5 ℃），72 ℃延伸1 min；后10个循环为94 ℃变性45 s，55 ℃退火75 s，72 ℃延伸1 min，最后再72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR产物进行纯化（Axygen DNA分离纯化试剂盒，美国），-20 ℃冰箱保存。
1.4 DGGE及测序 利用DGGE（BioRad，美国）分离PCR产物。制备变性梯度胶，使其变性梯度为30%～60%，电泳缓冲液为1×TAE。DGGE电泳条件为：电压160 V，温度60 ℃，时间6.5 h。电泳结束后，SYBR-green I染色30 min，将染色后的DGGE胶用凝胶成像系统Gel Doc 2000（BioRad，美国）拍照保存，用于多样性分析。DGGE电泳之后，选择相对比较清晰的条带进行割胶回收，用F357/R518引物进行PCR扩增，纯化PCR产物。分子克隆选用pMD18-T载体，宿主为Escherich coli DH 5α（Takara，日本）。将质粒送检测序（Invitrogen，上海），运用Blastn程序将所测序列与GenBank进行同源比对（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast），并在RDP Ⅱ数据库中（http：//rdp.cme.msu.edu）对序列进行种属鉴定。
1.5 芍药苷含量的检测 根据《中国药典》2010年版规定，利用高效液相色谱法检测杭白芍根部芍药苷的含量[1]。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）为流动相；检测波长230 nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2 000。取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成60 mg・L-1芍药苷溶液，即得对照品溶液。取本品中粉末0.l g，精密称定，置50 mL量瓶中，加稀乙醇，即为供试品溶液。将供试品利用HPLC进行芍药苷含量的检测。
1.6 数据分析及处理 利用软件Quantity One 4.4（Bio-Rad，美国）分析DGGE图谱。根据DGGE胶条带的位置和强度计算Shannon指数[10]。数据采用SPSS 16.0统计软件作Pearson相关性分析和主成分分析。实验数据用±s（STDEV）表示，方差分析认为，P
2 结果与分析
2.1 不同生长年限土壤的部分理化性质差异 检测发现土壤呈酸性，非根际土pH达3.86，而种植杭白芍能显著降低土壤酸度，并且随着栽培年份的增加，pH逐渐上升，酸度逐渐下降，二年生和三年生的pH无显著性差异。随栽培年份增加，根际土壤的有机质基本呈逐渐下降的趋势，但不同组间无显著性差异。脲酶和磷酸酶活性均呈现出先降后升高的趋势，但只有磷酸酶活性呈现出组间的显著性差异，见表1。总之，随着杭白芍的生长，到第4年杭白芍收获时，土壤pH、酶活均达到最高水平，而有机质则为最低。此外，与非根际土相比，根际土壤的pH、有机质含量以及酶活性差异非常明显，体现了杭白芍的根际效应。这些均说明杭白芍的生长会影响土壤的理化性质，而这种影响必定与根泌物相关，从而使土壤性质呈现一定的动态变化。
2.2 不同生长年限土壤细菌多样性 对不同生长年限杭白芍根际和非根际土进行细菌多样性分析，见图1。从DGGE图谱可看出，一至四年生的杭白芍根际土中有不少为共有条带。与非根际土相比，根际土的DGGE条带显示出明显的差异，表明杭白芍的根能吸引一些细菌的生长和聚集，即杭白芍在土壤菌群的组成上可能起主要的决定作用。比较不同年限的根际土发现，一至四年生的杭白芍根际大部分都是共有条带，其差异主要体现在条带的亮度，进行重复实验，其结果相同，这表明栽培年限对杭白芍根部的细菌群落影响不大，进一步证明其土壤根际菌群的组成主要受到杭白芍物种的影响。
衡量物种多样性的方法有许多，本文采用Shannon-Weiner指数[10-11]。结果表明，不同生长年限的杭白芍根际土之间的Shannon指数有差异，排序为三年生（3.61）>四年生（3.59）>二年生（3.39）>一年生（3.38），可以看出，随着杭白芍生长年限的延长，根际土壤的细菌多样性整体呈上升趋势。此外，与非根际土相比，杭白芍根际土的多样性指数显著高于非根际土，说明杭白芍的生长促使在细菌在根部富集，体现出明显的根际效应。
为进一步了解杭白芍土壤菌群结构，将DGGE图谱中比较清晰的条带进行割胶回收（图1），共回收了21条带，进行分子克隆后测序，在NCBI和RDP数据库中比对，结果见表2。测序结果表明，21个克隆全部为未培养菌，条带长度在168～194 bp，主要隶属于γ变形菌Gammaproteobacteria（5条带，24%），α变形菌Alphaproteobacteria（3条带，14%），放线菌Actinobacteria（4条带，19%），酸杆菌Acidobacteria（2条带，10%），厚壁菌门Firmicute（2条带，10%）以及未知菌（5条带，23%），说明杭白芍的根际土壤中的优势细菌为γ变形菌、α变形菌、放线菌、酸杆菌以及厚壁菌。从图1可以看出，S6（uncultured Actinobacterium clone E1B-B3-114，放线菌），S8（uncultured Bacterium clone mus-c48，酸杆菌Gp1），S9（uncultured Bacterium clone 106.52，α变形菌），S10（uncultured Alphaproteobacterium clone 3OL8，α变形菌），S11（uncultured bacterium RNA B1001R002_G23，酸杆菌Gp1），S15（uncultured Bacterium RNA，未知菌）是根际土的特有条带，说明杭白芍根际特有菌主要为α变形菌，酸杆菌Gp1和放线菌。S1，S2，S5，S7条带在非根际土特有，而且非常亮，经比对发现除S2为未知菌外，其余均为γ变形菌，说明γ变形菌为非根际土中的优势菌群。
2.3 不同生长年限杭白芍的芍药苷累积动态 按照药典[1]规定，从实验基地采回杭白芍根后，洗净，除去头尾和细根，置沸水中煮后除去外皮、生晒、切片、打粉后备用。从不同栽培年份的杭白芍的新鲜根可以非常明显看到侧根的生成以及次生生长。随着杭白芍的生长，根系越来越发达，根的次生生长导致木质化比例增加，周皮的颜色加深，主根越来越粗，而侧根也越来越多。与一至三年生的杭白芍相比，四年生的根的生物量显著增加，因此可以说，产量因素是选择四年生杭白芍入药的原因之一。将采来的样本处理好后，利用高效液相色谱法对不同生长年限杭白芍的芍药苷含量进行了测定，见图2。随着生长年限的延长，芍药苷的含量逐渐上升，其中一年生的含量最低，质量分数为3.26%，四年生的芍药苷含量最高，质量分数达3.41%，但不同年份含量的统计性差异未达到显著水平。由于一至四年生的杭白芍的芍药苷含量均远远超过国家标准，说明生长年限对芍药苷的含量的影响不大，应该不是选择四年生杭白芍入药的主要原因，之所以选择四年生杭白芍入药其主要因素应该是产量而不是芍药苷的含量。综合外观性状质量、产量以及指标成分含量分析，栽培杭白芍以四年生最为适宜。
2.4 土壤性质与芍药苷含量的相关性分析 为了探索土壤对杭白芍生长的影响，对不同年限杭白芍根际土壤的pH、有机质、酶活以及土壤细菌多样性、芍药苷含量的相关性进行了分析（Spearman，1-tailed），结果见表3。pH与有机质呈极显著负相关，磷酸酶和脲酶活性呈显著正相关，芍药苷含量与土壤pH、细菌多样性呈显著正相关，与有机质呈显著负相关。以上关系表明，芍药苷的累积与土壤pH、有机质和细菌多样性密切相关。
3 讨论
pH对土壤微生物群落有着复杂的作用，它可以通过影响营养吸收及根外细胞酶的分泌，进而影响土壤微生物的生长，一般来说，弱碱性适合细菌和放线菌的生长，酸性适合真菌的生长[12]。土壤pH与栽培方式和种植年限密切相关，刘建霞等分析种植年限与黄瓜温室土壤理化性质变化规律的关系发现，土壤pH随种植年限的延长显著降低[13]。许多研究均发现在持续一定年限后，设施栽培普遍出现土壤酸化和盐渍化等现象[14]，在一些不适合连作的作物中表现尤为明显，与本研究结果正好相反。分析认为，这可能跟作物是否适合连作有关。不适合连作的植物多为一年生草本，而杭白芍为多年生半灌木，需连续种植4～5年才采收，这种栽培模式不同于连作，杭白芍在生长过程中与土壤的互作可能与其他易产生连作障碍的作物不同，其根泌物的成分可能会导致pH上升而不是下降，当然杭白芍根泌物的成分还有待下一步实验证明。同时，随着杭白芍的栽培年限延长，细菌多样性也明显上升，该结果与连作障碍的作物也不同[15-16]。事实上，不同作物连作对土壤微生物的影响特性是不同的[17]，而作物连作对土壤生态系统中微生物的这种不同影响，可能也是有的作物不能连作，而有的作物能够连作的原因之一[18]。
酸杆菌广泛存在于自然界，在许多生态系统中发挥重要作用，主要分为8个类群Gp1-8，大多为嗜酸菌，目前对它们的了解还很少[19]。其中，Gp1类群对土壤pH非常敏感，当土壤pH6.5时在土壤中几乎检测不到[20]。研究发现，杭白芍的根际土壤pH均
在植物生长过程中，根系作为植物和土壤的接触部分，在从土壤中吸收水分、养分的同时，通过根分泌的方式向根周围释放出各种化合物，产生根际效应，进而调控或影响植株的生长发育[23]。土壤微生物在植物根际的定殖及分布也会受到根系生长发育、环境条件等因素的影响而表现出较为明显的根际效应，并且根际微生物在调节根际微生态系统的动态平衡、提高药材对环境的适应性等方面起着非常重要的生态效应[24-25]。根系分泌物是植物根系与根际微生物相互作用的信息物质和决定因素[26]，由于根根际效应往往导致根际及根表面的微生物种群密度和种类要明显高于非根际土[27-29]。杭白芍也不例外，其根际土壤pH、有机质含量、酶活性以及细菌多样性明显高于非根际土，体现出典型的根际效应，这与杭白芍根际向环境中释放有机化合物有关。
HPLC检测结果表明，一年生的杭白芍其芍药苷质量分数已达3.26%，符合药典规定，也就是说从药效成分的含量方面来看，一年生的根就可入药，但生产实践中，一般要4年以后才采收，究其原因，可能主要跟产量和效益有关。杭白芍为多年生亚灌木，一年生的根部与4年的根相比，由于根的次生生长导致地下部粗厚的程度和产量大大增加。此外，相关性分析表明，芍药苷的累积与土壤pH、有机质和细菌多样性关系密切，研究发现在道地产区磐安杭白芍的芍药苷含量相当高，初步证明杭白芍的道地性与磐安土壤微生态环境密切相关。在下一步的实验中，将研究杭白芍的根分泌物的组成以及非道地产区与道地产区的杭白芍对比，进一步探索杭白芍道地性形成的微生态作用机制。
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Effects of growth years of Paeonia lactiflora on bacterial community in
rhizosphere soil and paeoniflorin content
YUAN Xiao-feng， PENG San-mei， WANG Bo-lin， DING Zhi-shan
（College of Life Science， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China）
[Abstract] To explore the relationship between microecological environment and Paeonia lactiflora， the effects of growth years of P. lactiflora on rhizosphere bacterial communities were studied by PCR-DGGE and the paeoniflorin content determined by HPLC. Results showed that the soil pH increased with growing years of P. lactiflora. In the fourth year， soil pH and enzyme activity reached the highest level， while organic matter content was the lowest. The bacterial diversity had a positive correlation with growing years varied from 3.38 to 3.61. Sequencing results demonstrated that Gammaproteobacteria， Alphaproteobacteria， Actinobacteria， Acidobacteria and Firmicutes were predominant bacteria kinds in the soil of P. lactiflora. Gammaproteobacteria was only detected in the bulk soil， while Alphaproteobacteria， Acidobacteria_Gp1， Actinobacteria were only in the rhizosphere soil and the bacterial community among different growing years were similar except few species. HLPC results showed that paeoniflorin content was 3.26%， 3.30%， 3.36%， 3.41% separately from one to four-year-old P. lactiflora with an upward trend. The correlation analysis indicated that the paeoniflorin content had a positive correlation with soil pH and bacterial diversity， conversely， had a negative correlation with organic matter content. During the growth years the rhizosphere bacterial diversity increased without changes of predominant bacteria and the paeoniflorin content increased without significant differences while its production increased significantly， which was different from the plants showing replanting diseases. This is in line with the farming practice choosing 4-year-old P. lactiflora， but not the 1-3 year old one. In addition， the accumulation of paeoniflorin is closely related to soil pH， organic matter content and bacteria diversity， confirming that the geoherblism of P. lactiflora is closely related with microbial environment in the soil.
微生物多样性分析范文第5篇
关键词：高速公路；绿化；生物多样性；景观
在改革开放的三十多年时间里，我国交通事业得到突飞猛进的发展，交通基础设施建设如火如荼，高速公路建设速度更是令人咋舌，所取工作成就世界瞩目。截至今年，我国高速公路历程已超过5万公里，位于世界第二位。但是就我国高速公路事业进行分析，公路数量和规模十分可观，但是绿化问题还较为突出，严重制约了我国高速公路事业的发展，甚至阻碍了我国经济的进步。因此，在这里我们有必要对高速公路绿化生物多样性进行探究，为日后工作的顺利开展提供理论参考。
一、生物多样性概述
所谓的生物多样性主要指的是地球上所有生物在生态化系统中构成的多样化发展程度，是由植物、动物以及微生物在环境中构成的差异性体系。在目前的生物多样化研究中，主要包含了基因多样性、物种多样性、景观多样性和生态多样性等。但是在共奏中，因为人类对自然的干扰和影响，使得整个生态系统发生了变化甚至退步，这些问题的出现不仅造成严重的环境问题，而且引发严重的生态危机。因此，生物多样性可谓是人类赖以生存和发展的基础，是人类最为宝贵的财富，它在人类社会发展中有着重要的意义。因此，在目前的工作中保护生物多样性、保持生态平衡已经迫在眉睫，是我们工作中最为关心的问题。
目前，生物多样化已成为全球关注的焦点，随着我国经济的发展，高速公路事业快速发展的同时也产生了严重的生态破坏，因此在高速公路绿化建设中，我们必须要从生物多样化出发，做好生物多样性的应用，从而保证高速公路运行质量和效益。
二、生物多样性在高速公路绿化工作中的应用
1、高速公路绿化景观中的应用
1.1.生物多样性是高速公路绿化的基础
在传统的高速公路施工建设中，因为人为、技术以及材料的因素，造成严重的环境破坏和生态失衡问题。随着环境问题的不断加剧和可持续发展战略的日益落实，传统的这种高速公路施工方法越来越无法满足人们节能、高质的生活需要，这就要求我们在工作中对这些功能加以修复和处理。在目前高速公路施工中，绿化施工主要在原来被破坏的植被和生态系统上进行保护和恢复的方法，要求在施工中不仅要能建设出科学的景观效果，而且能产生一定的生态效益。要想达到这种建设目的，在工程施工建设中做好生物多样性分析不容忽视，是实现绿化生态效益的基础，也是提高公路建设质量的关键。
1.2可以维持公路绿化生态系统的平衡和稳定
生物多样性在整个自然发展中有着重要的意义，是生态系统的重要基础。在生态领域，各种物种之间存在着相互制约、相互支配和相互促进的关系，通过这些物种的相互作用从而形成了一个稳定、科学的生态环境，这也符合了生物多样性的生态环境发展要求，更是一种相互依存的关系。基于这种条件，在目前高速公路绿化设计中，我们需要加强人工造林体系建设，这样才能够整整意义上维持一个相对稳定和平衡的发展状态，为社会经济的发展做出应有贡献。
2 生物多样性在高速公路绿化中存在的问题
2.1盲目引进外来树种，造成不良后果
在过去的高速公路建设中，由于绿化经验不足和工作人员素质低的影响，多数高速公路绿化建设中都采用了已经成功的案例，并且对这些设计方法和流程未加研究和思考，这使得在绿化设计中出现了严重的影响。主要是因为植物习性的不同使得一些外来植物受到地理因素、气候因素和环境问题的影响不仅无法达到良好的生长目的，甚至是出现死亡现象，造成严重的社会经济损失。另外，由于大量外来植物的乳清，使得生物多样性受到一定的影响，更为严重的是这些外来植物如果携带有病菌，直接会产生大面积植物病症的出现，由于缺乏自然天敌，这些病害一经出现，都有可能给当地植物造成毁灭性的打击。
2.2唯美至上。物种搭配不合理，生态效益差
在做高速公路绿化景观设计时只追求表面的视觉效果，强调了美学，而忽视了生态学和生态配置的理念。在建造高速公路人工植被时，从审美角度考虑过多，从生态系统生物多样性角度考虑的少。因此，造成部分高速公路绿化植物品种单一，不讲究植物搭配，不能构成植物群落，无法形成稳定的生态系统，从而造成生态效益较差的现状。
3 保护高速公路绿化生物多样性途径
3.1 合理设计
合理进行公路绿化体系的设计布局，通过绿化点、线、面相结合，建立高速公路绿化的生态网络体系。在高速公路绿化设计和建设当中，应将生物多样性的保护作为重要原则，将各部位的绿化作为一个有机的整体，通盘考虑，整体设计。
3.2特色性建设
每一条高速公路及高速公路的每个部位的环境条件都是不相同的，高速公路绿化有着很高的异域性，加强绿化特色性建设是增加和保护生物多样性建设的有效途径之一。充分挖掘和利用地带性的物种资源，有节制地引进外域特色物种，构筑具有地域性植被特征的生物多样性格局。在保护、推广优良乡土树种的基础上，合理引进外来树种对高速公路进行绿化，充分体现当地应具备的生物多样性，以利完善的生态系统的形成.
4保护高速公路绿化生物多样性
随着人们对生物多样性保护的关注，生物多样性的保护在高速公路绿化设计中也应得到相应的重视。生态系统的稳定性和高效性是靠构成生态系统的各个成分之间以及它们与生存环境形成的相互协调的关系来维持的。而要形成一个稳定完善的生态系统体系，生物多样性在其中起着不可忽视的作用，因此，在高速公路绿化建设中，要以生态平衡和稳定为科学指导思想，以生物多样性为基础，适地适树，乔、灌、草合理配置，注重近自然生态环境的营造，创造出一个有地方特色的能发挥最大生态效益和景观效益的绿色生物防护体系。
三、结束语
因此，在对高速公路绿化生物多样性的利用上，要对外来种可能造成的入侵保持高度警惕，防患于未然，对已经引进的物种要严格筛选、驯化和管理，避免出现不良后果。■
参考文献
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微生物多样性分析范文第6篇
关键词：土壤微生物；DNA提取；PCR；DGGE
中图分类号：Q939.96；Q523 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）01-0216-04
Screening the Extracting Method of Total Microbial DNA from Soil
ZHOU Wei1，HUANG Jin-yong2，LI Xin-wei1
（1. Luohe Medical College of Higher Education， Luohe 462002， Henan， China；
2. Bioengineering Department， Zhengzhou University， Zhenzhou 450001， China）
Abstract： Three methods were designed to extract microbial DNA directly from the soil， and the different extraction methods were evaluated comprehensively for the DNA quality and applicability of the molecular biology by PCR and DGGE. The results suggested that the combination of enzymatic and chemical methods could obtain the highest DNA yield and integrity， which was suitable for PCR， and the most abundant bands could be obtained by DGGE. This development of the highly effective DNA extraction method provided a foundation for studying in molecular ecology of soil microbes.
Key words： soil microbe； DNA extraction； PCR； DGGE
收稿日期：2013-05-10
作者简介：周 伟（1981-），男，河南南阳人，讲师，主要从事遗传学方面的研究，（电话）13938025634（电子信箱）。
微生物在土壤生态系统物质循环和能量转化过程中起重要作用，目前通过纯培养技术只能获得土壤中仅极少数的微生物种类，不能充分体现微生物群落的真实组成[1]。而基于DNA分析的分子生物学技术的引入，降低了对培养技术的依赖性，可以直接对土壤中微生物进行研究[2]。由于土壤中含有大量理化性质复杂的物质，而且微生物与土壤颗粒吸附紧密，不易从中提取DNA；同时土壤中微量的腐殖酸和重金属可能抑制分子生物学操作过程中酶的活性、降低转化效率以及DNA的杂交特异性[3，4]等。因此，从土壤样品中高效地获得高质量的DNA是后期土壤微生物分子生物学研究的前提。
土壤中微生物DNA提取的关键在于细胞的裂解，本研究通过对不同的裂解手段进行组合，设计了3种从土壤中直接提取微生物总基因组DNA的方法并对后期扩增效果进行比较分析，以期建立一种高效、简便的土壤微生物DNA提取方法，为分子水平上研究土壤微生物提供参考。
1 材料与方法
1.1 土壤样品
2011年在河南省漯河市孟庙镇进行取样。供试土壤取自常年以冬小麦-春玉米茬口种植的农田，秸秆全部还田，采用五点取样法取土样，取样深度为0～20 cm，混匀后于-20 ℃保存。
1.2 试剂与仪器
溶菌酶、蛋白酶K购自Sigma公司，所用maker（λ-HindⅢ digested Marke，DNA Marker DL 2000）、凝胶回收试剂盒、PCR Kit购自TaKaRa公司。TGRADIENT温度梯度PCR仪为德国Biometra公司生产，全自动数码凝胶成像与分析系统由天能科技（上海）有限公司生产。
1.3 方法
对提取土壤微生物DNA方法中不同的细胞裂解方式进行组合，设计3种土壤基因组DNA的提取方法。
方法a：酶法与化学法相结合[5]。5 g土壤中加入25 μL蛋白酶K、13.5 mL TENC（50 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl、1% CTAB），混匀后置于37 ℃摇床225 r/min震荡30 min；然后加入1.5 mL SDS混匀，65 ℃水浴震荡2 h；6 000 r/min离心15 min，取上清液。原离心管中加入9 mL TENC、1 mL SDS，混匀后水浴1 h，6 000 r/min离心15 min，取上清液。合并所得上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇，充分混匀后10 000 r/min离心15 min，取上清液，等体积加入异丙醇，混匀后放入冰箱中4 ℃过夜，10 000 r/min离心15 min，弃上清，加入2 mL预冷的70%乙醇洗涤2次，干燥后加入500 μL TE溶解。
方法b：化学法和冻融法结合使用[6]。5 g土壤中加入20 mL TENS（50 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl、1% SDS），70 ℃水浴1 h，6 000 r/min离心10 min，取上清液。在沉淀中加入1.5 mL TEN（50 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl），放置在-20 ℃冰浴和65 ℃水浴中反复冻融，循环5次。10 000 r/min离心10 min，取上清液。合并所得上清液，后续DNA溶解步骤与方法a相同。
方法c：酶法、化学法及冻融法配合使用[7]。5 g土壤中加入10 mL PBS，混匀后置于30 ℃摇床150 r/min震荡15 min，10 000 r/min离心20 min，弃上清液。取沉淀加裂解液Ⅰ（50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、100 mmol/L EDTA）7.5 mL，50 mg/mL溶菌酶2.5 mL，37 ℃水浴2 h，10 000 r/min离心15 min取上清液。沉淀加裂解液Ⅱ（0.15 mol/L NaCl、0.5 mol/L Tris-HCl、10% SDS）10 mL，循环放置在 -20 ℃冰浴和65 ℃水浴中反复冻融，循环3次，10 000 r/min离心15 min取上清液。合并上清液，后续DNA溶解步骤与方法a相同。
1.4 DNA质量与纯度的检测
提取的DNA通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，120 V电泳45 min，凝胶成像系统中观察结果并拍照。DNA纯度采用紫外分光光度计法进行比较，将所溶解的DNA溶液分别在230、260、280 nm波长下的吸光值进行测定。
1.5 不同提取方法对后期试验适用性的分析
对细菌保守的16 S rDNA基因以及其V3可变区进行扩增，并对V3可变区进行DGGE电泳，根据PCR扩增效果以及DGGE电泳分离结果进行比较，分析3种提取方法所获得的DNA是否适合后期分子生物学试验。
1.5.1 PCR扩增及电泳 本试验所用16S rDNA引物为BR8-27（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）和BL1541-1522（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA
-3′），V3可变区引物为338L（5′-CTACGGGAGGCA
GCAG-3′）/518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′），可对所有真细菌及大部分古细菌的相应目的片段进行有效扩增。PCR反应体系（50 μL）：10×PCR Buffer（含Mg+）5 μL，dNTP （2.5 mmol/L） 4 μL，引物（10 mmol/L） 各1 μL，Taq酶（5 U/μL） 1 μL，土壤 DNA 1 μL，超纯水定容至50 μL。16 S rDNA按以下循环程序扩增：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35次循环；72 ℃延伸5 min。V3可变区按以下循环程序扩增：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35次循环；72 ℃延伸5 min。反应结束后，分别取5 μL PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶上，80 V电压下电泳15 min，电泳结束后在凝胶成像系统中观察并拍照。
1.5.2 目的片段检测 用Bio-Rad公司的D-Code system基因突变检测系统对V3可变区进行DGGE电泳分离，采用10%聚丙烯酰胺凝胶，变性剂梯度为40%～60%，加30 μL PCR产物，60 ℃，1×TAE，130 V电泳5 h，电泳凝胶采用银染方法显色。
2 结果与分析
2.1 基因组总DNA提取效果
利用3种方法提取土壤微生物DNA，电泳结果显示（图1）：方法a所得基因组DNA在23 130 bp左右出现一条较亮条带，说明提取的DNA较完整；方法b所得产物出现较大范围的弥散，表明DNA在提取过程中发生部分断裂，影响了DNA的完整性和质量；而方法c得到的产物分子量低于4 000 bp，且较为分散，表明DNA在提取过程断裂较为严重。
从土壤中提取的微生物DNA常含有蛋白质和腐殖酸，影响DNA的质量。OD260 nm/OD280 nm和OD260 nm/OD230 nm的值可分别检测DNA中蛋白质和腐殖酸的污染程度，一般认为OD260 nm/OD280 nm在1.5～2.1之间，OD260 nm/OD230 nm大于2.0时说明所获得的DNA具有较高纯度。表1中结果表明，方法a提取的土壤微生物DNA OD260 nm/OD280 nm比值与理论值接近，蛋白质污染较轻，而OD260 nm/OD230 nm偏低，说明所提取的DNA存在一定程度的腐殖酸污染。方法b和方法c所得DNA的两项比值均低于正常值，表明提取的土壤微生物DNA中腐殖酸含量较高，蛋白污染较严重。另外，OD260 nm数据显示方法a所得DNA有最大吸收值。结果表明，3种提取方法中方法a所得土壤微生物DNA的纯度和含量最高。
2.2 不同方法提取的DNA扩增效果检测
用16 S rDNA基因以及其V3区通用引物进行PCR扩增，3种提取方法所得DNA对目的基因的扩增效果如图2、图3所示，方法a所提土壤微生物DNA扩增得到的PCR产物亮度较高，表明其产量及浓度较高，而方法b所提DNA扩增得到的产物亮度要比方法a弱很多，表明产物的量较少，扩增效果稍差，而方法c所得DNA扩增得到目的产物并没有在电泳中观察到，可能是由于产物的量过低，或没有得到扩增，说明该方法提取的DNA质量较差。
2.3 PCR产物的DGGE电泳
通过DGGE电泳对扩增得到的16 S rDNA V3可变区进行分离，结果如图4所示。由方法a所获得的土壤微生物DNA经过PCR-DGGE电泳分离，能够得到13条不同强度的条带，而方法b所获得的DNA只分离出7条。通过比较可以看出，方法a所获得的分离条带明显较多，且分离结果清晰，通过DGGE电泳能够较好地体现土壤中细菌组成的丰富程度以及种群分布的差异，而方法b所体现的微生物种类相对较少，但相应条带所对应的种群密度与方法a保持一致。另外，方法b提取的DNA能够分离出方法a没有扩增到的条带，说明这2种提取方法对部分细菌的裂解能力存在差异。由此可以推测，不同方法对细菌DNA的提取存在一定程度的选择性，不可能完全体现出土壤中所有细菌的组成。
3 小结与讨论
土壤微生物DNA提取方法主要可分为细胞提取法[8]和原位裂解法[9]。细胞提取法是先将细胞从土壤中分离出来，然后通过细胞裂解提取DNA。该方法虽然可得到纯度较高的DNA，但由于绝大部分细菌与土壤颗粒吸附牢固，不宜洗脱，导致细胞产量低，提取的DNA量少，反映的微生物群落具有片面性。原位裂解法是直接对土壤样品进行裂解提取基因组DNA，该方法提取的DNA一般产量较高，能够更好地反映土壤中微生物的群落组成，但是由于在提取过程中会有一些土壤有机成分被提取出来，从而影响后期的分子生物学分析[10，11]。常用的原位裂解方法包括化学法、酶法或物理法，各种方法的作用原理不同，因而其提取效果也各有差异。化学法主要通过化学试剂对细胞进行破碎和DNA抽提，酶法主要通过酶的作用造成细胞裂解，而物理法则是通过外力作用使细胞破裂，本试验采用的3种方法分别基于不同的裂解原理进行组合。
在这3种裂解原理中，化学法相对温和，但对不同类型细胞裂解能力不同；酶法对细胞破裂具有专一性，但活性易受土壤中化学成分的影响；物理方法能彻底破碎细胞，但裂解时对DNA剪切程度比较大[12，13]，本试验的结果也证实了以上结论。化学试剂与酶的联合使用，能够对土壤中的DNA进行有效的裂解。由于化学裂解过程比较温和，蛋白酶不但提高了对细胞的破碎能力，又降解了部分蛋白质，从而较好地保证了整个基因组DNA的完整性和纯度。而在化学裂解过程中进行冻融，能够使细胞充分破碎，DNA得率较高，但同时造成DNA断裂。化学、物理和酶法联合使用，虽然对细胞裂解效果较好，但同时使DN段大量断裂，造成DNA的质量与提取效率过低。另外，CTAB法对去除蛋白质和其他污染物有较好的效果，使方法a所获得的DNA纯度较其他两种方法要高。DNA质量的差异造成了以方法a为模板的扩增效果明显优于其他两种方法，扩增产物含量和质量均比较高，有利于后期分析试验的进行。通过对3种方法提取土壤微生物DNA效果的电泳检测比较，用2种不同引物对PCR扩增结果以及DGGE电泳结果进行比较，表明化学法和酶法联合使用适宜提取土壤微生物的DNA。
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微生物多样性分析范文第7篇
呼伦贝尔草甸草原是世界草地资源研究和生物多样性保护的重要区域之一[1],也是我国主要畜牧业基地。近年来由于不合理管理和超限度的开发利用,草原退化日趋严重。草地退化的核心问题是土壤退化[2]。过度放牧是人类活动影响土壤退化的主要驱动因素[3]。因此研究不同放牧强度对呼伦贝尔草原土壤的影响,对该区域草地畜牧业可持续发展具有重要的指导意义。土壤微生物是草地生态系统的重要组成,通过分解动植物残体参与草地生态系统的能量流动和物质循环[45],影响着土壤活性,即养分[6]。土壤微生物量只占土壤营养库的小部分,是土壤养分转化的源和库,影响着生态系统中植物营养和土壤肥力[7],可反映出土壤养分的有效性状况及土壤生物活性[8]。土壤酶参与土壤中的各种代谢过程和能量转化,作为土壤生态系统变化的预警和敏感指标,可客观地反映土壤肥力状况[910]。为此,本研究拟通过围栏小区控制放牧强度,研究不同放牧强度下草地土壤微生物数量、微生物量和酶活性变化及其相互关系,为进一步认识退化草地,改良草地提供参考依据。
1材料与方法
1.1研究区域概况研究区位于内蒙古呼伦贝尔市海拉尔区,中国农科院呼伦贝尔草原生态系统国家野外科学观测研究站放牧样地,N:49°19′349"49°20′173"、E:119°56′521"119°57′854",海拔666m680m,属温带半干旱大陆性气候,年均气温5°C2°C,最高、最低气温分别为36.17°C和48.5°C,无霜期110d左右。年平均降水量350mm。土壤为黑钙土或栗钙土。植被类型为羊草+杂类草草甸草原[11]。
1.2放牧样地设计试验区围成面积相等的6个小区,作为6个放牧强度,每个小区面积5hm2,试验区总面积30hm2。以500kg肉牛为一个标准家畜肉牛单位,在草地面积一定,放牧天数相同条件下,用250300kg的放
牧肉牛头数来控制不同放牧强度的实施,6个放牧强度肉牛头数分别为0、2、3、4、6、8头,即载畜率分别为G0.00:0.00Au/hm2、G0.23:0.23Au/hm2、G0.34:0.34Au/hm2、G0.46:0.46Au/hm2、G0.69:0.69Au/hm2、G0.92:0.92Au/hm2[12],放牧试验于2009年610月、2010年610月进行,共经历两个放牧期。
1.3试验方法
1.3.1样品采集与预处理:于2010年8月进行试验区采样,各试验区分别用土钻采集010cm、10cm20cm土层深度的土样,按混合采样法取10个点的混合样,除根系和石砾,过2mm筛。将采集的土样分成两份:一份4°C冰箱保存,用于土壤微生物数量及微生物量的测定;另一份室内风干,用于土壤酶活性的测定。1.3.2测定及分析方法:土壤微生物各类群数量的测定采用稀释平板法。所用培养基:细菌为牛肉膏蛋白胨培养基;放线菌为改良高氏1号培养基;真菌为马丁氏孟加拉红培养基。每一类群设3个重复,3个稀释度,各类群培养基分别接种后,细菌30°C培养2d、真菌和放线菌28°C培养4d和7d后,进行计数。土壤微生物量的测定采用氯仿熏蒸—浸提法[13]。土壤酶活性测定法[10]:过氧化氢酶采用高锰酸钾滴定;转化酶采用3,5-二硝基水杨酸比色;蛋白酶采用Folin-Ciocalteu比色;脲酶采用苯酚次氯酸钠比色。所得数据采用Spss17.0统计软件进行方差分析和相关性分析。
2结果分析
2.1微生物类群组成及其数量土壤微生物类群组成及数量见表1。微生物类群主要由细菌、真菌和放线菌组成,各放牧区细菌数量有绝对优势,占总数的90.02%95.58%;其次是放线菌,占4.21%8.90%;真菌最少,仅占0.10%0.26%。微生物总数在010cm土层,G0.92最高,10cm20cm,G0.34最高,两层均为G0.00最少。从放牧强度对草原土壤微生物数量影响的显著性分析来看,各类群微生物数量均在G0.00最低。细菌数量在010cm和10cm20cm土层表现为G0.23、G0.34显著高于G0.00(P<0.05),与010cm相比,10cm20cm土层,G0.00下降了35.9%,G0.23下降了36.98%,G0.46下降了47.90%,G0.92下降了57.81%。真菌数量在010cm土层随放牧强度增加而增加,G0.92显著高于其他试验区(P<0.05),是G0.00的2.57倍,是G0.34的1.59倍,而在10cm20cm土层,真菌数量表现为各放牧区均显著高于G0.00(P<0.05),且与010cm相比,在10cm20cm土层G0.00下降了56.42%,G0.23下降了54.34%,G0.46下降了57.65%,G0.92下降了72.63%。放线菌数量与细菌和真菌变化趋势并不一致,其两层变化趋势相似,随放牧强度的增加表现为先升后降,G0.34最高。
2.2土壤微生物量不同放牧强度下,土壤微生物量碳、氮含量的变化如表2。其中微生物量碳、氮含量分别在254.17529.12mg/kg和19.1239.60mg/kg之间,受放牧强度的影响很明显,在010cm,微生物量碳、氮含量均以G0.92最高,显著高于G0.00(P<0.05)。在10cm20cm土层,土壤微生物量碳在G0.23最高,显著高于各试验区(P<0.05);微生物量氮在G0.23和G0.34较高,显著高于其他试验区(P<0.05)。土壤微生物量碳、氮垂直方向有明显的下降趋势,与010cm土层比较,10cm20cm土层微生物量碳在G0.00下降了11.9%,G0.23下降了22.19%,G0.46下降了45.78%,G0.92下降了51.96%;微生物量氮在G0.00下降了11.83%,G0.23下降了14.89%,G0.46下降了30.8%,G0.92下降了46.66%。
2.3土壤酶活性土壤过氧化氢酶表征土壤腐殖化强度和有机质积累程度[14],脲酶和蛋白酶直接参与土壤含N有机化合物的转化,其活性强度常用来表征土壤氮素供应强度[15];转化酶促进糖类的水解,加速土壤碳素循环[16];各放牧区土壤酶活性如图2,在010cm土层,过氧化氢酶G0.00最低,显著低于各放牧区(P<0.05),放牧区之间无显著差异;转化酶在010cm土层,G0.34最高,显著高于G0.00;在10cm20cm土层,过氧化氢酶和转化酶各试验区均无显著差异。蛋白酶在010cm和10cm20cm土层,各放牧区均显著高于对照区(P<0.05),脲酶在各土层各试验区均无显著差异。2.4土壤微生物数量、微生物量及酶活性的相互关系2.4.1土壤微生物数量与微生物量的相关性:短期不同放牧强度下土壤微生物数量、微生物量相关性分析如表3所示:细菌和真菌数量与微生物量碳极显著相关(P<0.01),与微生物量氮显著相关(P<0.05);放线菌数量与微生物量碳、氮均显著相关(P<0.05)。微生物数量与微生物量碳、氮密切相关,说明土壤微生物量能在一定程度上反映参与调控土壤中能量和养分以及有机物转化所对应的微生物数量,是土壤微生物生物活性的一种表现。
2.4.2土壤微生物数量、微生物量与酶活性的相关性:微生物数量、微生物量及酶活性相关分析结果如表3所示:细菌数量与过氧化氢酶、转化酶极显著相关(P<0.01),与蛋白酶显著相关(P<0.05);真菌数量与蛋白酶极显著相关(P<0.01);放线菌数量与过氧化氢酶、转化酶极显著相关(P<0.05);微生物量碳与蛋白酶极显著相关(P<0.01),与过氧化氢酶、转化酶显著相关(P<0.05);微生物量氮与蛋白酶极显著相关(P<0.01)。土壤酶活性之间,过氧化氢酶与转化酶极显著相关(P<0.05),与蛋白酶显著相关,转化酶、蛋白酶和脲酶之间相关性不显著。土壤酶活性在一定程度上反映土壤微生物活动的强度。
3讨论
3.1放牧对土壤微生物组成、数量和生物量的影响在草地生态系统中,家畜通过采食、践踏及排泄物直接影响土壤,或通过这三者对植被和微生物的作用间接影响土壤[14]。但土壤表现出的是三者综合作用的结果[17]。本研究中,各放牧区微生物数量、微生物量碳、氮均高于对照区。因为放牧活动使植物根系分泌物量增加,光合作用能量增加,加之放牧牲畜排泄物的影响,均使土壤养分增加,故有利于微生物的生长繁殖。放牧对不同土层微生物的影响并不一致,微生物数量及微生物量碳、氮在土壤表层(010cm)以G0.92居高;而在较深层(10cm20cm),则随放牧强度的增加呈先升高后降低的趋势。原因为:土壤表层随放牧强度的增加,牲畜的排泄物增加,土壤养分增加,微生物生长、繁殖迅速。而较深层排泄物的渗透作用降低,加之高强度的放牧,结果是排泄物对微生物的正面影响小于放牧践踏和啃食对其的负面影响,所以在G0.23和G0.34居高。由于放牧对土壤微生物的影响是双向的,其负作用滞后于放牧行为。即短期高强度放牧对土壤表层微生物数量、微生物量的促进作用会随着放牧时间延长而逐渐降低[18],所以这种促进作用可能是暂时的。
微生物多样性分析范文第8篇
关键词: A - A - O工艺，变性梯度凝胶电泳，浓度，硝化细菌的结构
Abstract: The experimental use of PCR-DGGE technology to study the impact of the DO concentration of Nitrifying Bacteria in the structure of the AAO process, provide a reliable basis for system optimization.
Keyword: A-A-O process; DGGE; DO Concentration; Nitrifying Bacteria in structure
中图分类号： U664.9+2 文献标识码：A 文章编号：
1引言
大中城市污水处理厂多采用生物方法处理城市生活污水及工业废水，该法最主要优点是处理效果好，费用低。处理工艺中起主要作用的是生物反应段,活性污泥是生物处理功能主体，通过对活性污泥中微生物群落结构多样性分析对于在节约能源的前提下提高污水处理效率具有重要意义。
研究活性污泥中微生物多样性开始采用PCR-DGGE技术，并取得了较好结果。实验结合A-A-O工艺,研究好氧反应器内DO浓度改变时，相应硝化细菌群落结构变化情况。
2材料和方法
2.1关于A-A-O的设置
装置工艺参数如下：进水流量:30L/d;在三个反应池中水力停留时间：1.5h、1.5h、6 h；总回流比:300%；SRT:15天；装置启动和运行稳定共120天。好氧反应区DO平均浓度值为0.5、1.5、2.5、3.5、4.5mg/L。
2.2 基因组DNA提取采用SDS裂解法。
2.3 PCR扩增
2.3.1实验所用引物
AOB菌群所用引物为CTO189fAB/CTO189fC∕CTO653r亚硝化螺菌
所用引物为 P338f∕Ntspa0685硝化杆菌所用引物为 P338f∕Nb1000f
2.3.2 PCR反应体系及反应条件
. PCR反应体系组成: Taq聚合酶0.4μL,10×反应缓冲液5μL，4×dNTP 1μL,引物2μL,模板DNA 1μL,最后加双蒸水至体积50μL。扩增程序：94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5 min，重复步骤35次，72℃后延伸8min。
2.4 变性梯度凝胶电泳
2.4.1琼脂糖凝胶、凝胶板的制备及PCR的加样
称琼脂糖，放入锥形瓶中，再加入缓冲液，置微波炉加热至完全溶化取出摇匀，待冷却后，加入EB。 将冷却琼脂糖凝胶，倒入制胶板内，待凝胶凝固后加入缓冲液。取样品及缓冲液混合后打入胶板孔。
2.4.2电泳及观察
电泳电压为170V，结束后，放入凝胶成像系统内拍照。
3实验结果与分析
DO对A-A-O工艺硝化菌群群落结构影响
(1)DO浓度对AOB群落结构影响
DGGE分离结果如图3-5所示，得到共有8种AOB细菌，条带标为AOB1-AOB8。有三条条带（AOB2、AOB4、AOB6）一直比较稳定而且亮度比其他条带强，所对应菌种为AOB优势菌种。条带AOB7随DO浓度降低而逐渐减弱，当DO浓度为1.5mg/L时消失。AOB3在浓度为4.5、3.5、2.5mg/L使出现，而AOB5仅在DO浓度为2.5、3.5mg/L时出现。AOB1仅在DO浓度为0.5mg/L时出现。AOB8在浓度高时条带较弱，而浓度较低时条带才变强。
从图3-6可以得到L1和L2的相似性为1，表明DO浓度为4.5、 3.5mg/L时，AOB群落稳定，几乎没有任何变化。L1和L2与L3的相似性为0.92， L4与L5的相似性为0.89，可见群落结构相对较稳定。从图3-7，可以看到随DO浓度降低，AOB菌群香侬多样性指数也降低，但不是很明显。表明AOB菌群没有出现优势群落明显减少，可见DO浓度降低对AOB菌群代谢活性影响较小。
(2)DO浓度对Nitrospira群落结构影响
图3-5、3-8、3-11为不同DO浓度对AOB、Nitrospira、Nitrobacter群落结构影响
DGGE分离结果如图3-8所示，可得到共有11种菌，条带标为Np1-Np11。从图可以看出DO浓度对Nitrospira群落结构影响比较大，且DO浓度较高时，物种相对比较丰富，而随DO浓度降低，Nitrospira菌群优势群落逐渐变得单一，其中Np5为该菌群优势菌种。DO浓度大于等于2.5mg/L时，Np4、Np7、Np10能够在系统中保持一定数量。
从图3-9可以得到L1-L3泳道和L4-L5泳道的内部相似性比较高，但是2组之间确存在较大差别，表明在一定DO浓度范围内Nitrospira群落结构
较稳定，但在DO浓度在4.5-2.5mg/L和2.5-0.5mg/L时各DO浓度段优势菌群存在差异较大。相似性最高的是L4与L5，相似性达88.9%，相似性最低的是L4与L3，相似性低至18.2%，说明Nitrospira群落发生明显群落交替现象，DO浓度对其影响巨大〔1〕。
图3-6、3-9、3-12为不同DO浓度条件下AOB、Nitrospira、Nitrobacter菌群DNA相似性树状图
Nitrospira菌群香侬多样性指数如图3-10所示，表明当DO浓度处于
4.5-3.5mg/L时，达到最大值0.8，表明在DO浓度较高情况下，活性
污泥中Nitrospira菌群种类丰富。随DO浓度降低，香侬多样性指数逐
渐减小至0.4左右。说明低DO浓度对Nitrospira菌群有明显抑制作用。
(3)DO浓度对Nitrobacter群落结构的影响
Nitrobacter群落DGGE分离结果如图3-11所示，可以得到Nitrobacter
共有9种，条带标为Nb1-Nb9。还可以看出DO浓度对Nitrobacter群落
图3-7、3-10、3-13分别为AOB、Nitrospira、Nitrobacter的香侬多样性指数
结构具有很大影响。但是优势菌群条带Nb7、Nb8和Nb9在各种浓度条件下同样比较稳定而且亮度比其他条带强。DO浓度降低时，Nitrobacter群落结构丰富度也随之下降。Nb1在DO浓度为2.5mg/L和4.5mg/L时出现，Nb3和Nb5仅在DO浓度为3.5mg/L时出现，Nb4和Nb6仅在DO浓度为4.5mg/L时出现。
图3-12可以得出，L3-L5泳道相似性高达85%以上，而其与L1和L2相似性却在70%以下。可见在DO浓度降低的过程中，发生了明显的群落交替现象。从图3-11可以看出，此时除了优势菌群Nb7、Nb8和Nb9外，没有其他菌种。图3-13可以看出，DO浓度为0.5mg/L-4.5mg/L范围内，Nitrobacter菌群香侬多样性指数范围为0.6-0.8。可见低DO浓度对Nitrobacter菌群结构也存在抑制作用。且当DO浓度小于2.5mg/L时，Nitrobacter香侬多样性指数高于Nitrospira，此时Nitrobacter占NOB主导地位。
4结论
本实验研究 DO浓度对A-A-O系统硝化功能菌群落多样性的影响，得出结论：（1）实验利用PCR—DGGE 技术分析了DO浓度改变的情况下硝化细菌群落结构变化情况，可判别在脱氮过程中起到主要作用的硝化功能菌。（2）DO浓度降低过程中，AOB菌群香侬多样性指数降低，但不是很明显。可见DO浓度降低情况下对AOB菌群代谢活性影响较小。Nitrospira菌群在DO浓度大于等于2.5mg/L时，菌群种类丰富，随DO浓度降低，香侬多样性指数逐渐减小。说明低DO浓度对Nitrospira菌群有明显抑制作用。当DO浓度低于2.5mg/L时，Nitrobacter细菌香侬多样性指数高于Nitrospira，可见此时Nitrobacter菌占NOB主导地位，当DO浓度大于等于2.5mg/L时，两者香侬多样性指数差别不大，一起承担系统硝化作用。