细胞研究
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细胞研究范文第1篇
肿瘤研究的难点和基本问题之一是那些肿瘤细胞能够无限地生长。传统的观点认为肿瘤的生长是所有肿瘤细胞一起增殖的结果，通过对造血系肿瘤的研究发现，肿瘤细胞的生长繁殖和干细胞之间有许多相似之处，因此提出了肿瘤干细胞学说[1]。认为肿瘤的生长是肿瘤组织中极少量的肿瘤干细胞无限增殖的结果，而其周围的肿瘤细胞的增殖能力是十分有限的。近年来的研究表明，在白血病以及部分实体瘤中(如乳腺癌、脑瘤等)，只有一小部分肿瘤细胞具有无限增殖能力，并可形成新的肿瘤灶，这种细胞称之为肿瘤干细胞(tumorstemcell，TSC)。这些研究对肿瘤研究领域和肿瘤的治疗产生深远的影响，为临床肿瘤治疗提供了新的方向和视觉角度。本文就TSC的生物学特性、分离纯化鉴定技术及其临床意义作一综述。
1 肿瘤干细胞理论的提出
早在19世纪中期就有人在显微镜下发现肿瘤细胞与干细胞十分相似，但由于当时技术水平的限制，研究没有进一步的深入。但随后又有学者发现，在多发骨髓瘤和白血病患者中，仅有很少量的肿瘤细胞集落能够在体外克隆增殖，在异种移植实验中，将白血病细胞接种NOD/SCID小鼠[2]，仅有1%到4%的细胞能够在脾内形成集落，表明并不是所有的肿瘤细胞都能无限的增殖，只有小部分肿瘤细胞具有致瘤源性。早期对很多其他实体瘤，如对卵巢癌、肺癌、神经母细胞瘤的研究中，Hamburger等人[3]也发现仅有1/1000或1/5000的肿瘤细胞能在琼脂中形成克隆。
肿瘤的生成是一个长期的过程，一个正常细胞转变为肿瘤细胞至少要发生4-7次的突变，这需要几年甚或几十年的时间，在一些细胞更新快的组织如皮肤表皮、肠道黏膜和血液等，衰老细胞迅速死亡脱离机体，而这些组织恰是肿瘤的好发部位。在肿瘤组织中，一些具有很强肿瘤形成能力的细胞叫肿瘤驱动细胞[4，5]，由于肿瘤驱动细胞多具有与干细胞相似的自我更新能力和一定的分化潜能，并具有一些与正常干细胞相同的细胞标记蛋白，因此肿瘤驱动细胞又被称为肿瘤干细胞。随着研究的深入，人们发现干细胞和肿瘤干细胞有许多共同的特性，都具有自我更新能力和不定分化潜能，而且还有类似的细胞表面标志，提示肿瘤干细胞起始于正常干细胞，这些细胞通过积累、突变获得不确定的增殖能力而转化成为肿瘤干细胞或成为肿瘤起始细胞。鉴于肿瘤干细胞的以上生物学特性，有学者将肿瘤干细胞定义为：能分化出不同表型的，并能自我克隆产生子代致瘤性细胞的肿瘤细胞。
2 肿瘤干细胞的分离与鉴定
肿瘤干细胞的分离纯化技术较为复杂，在无菌条件下提取出肿瘤病人的肿瘤细胞，用蛋白酶等消化，充分吹打成悬浮液，随后用流式细胞仪(FACS)根据不同的细胞表面标志(包括细胞表面分子阳性和阴性细胞)进行筛选[6]，把分离出的细胞以不同浓度分别接种于NDO/SCID小鼠上，比较各组成瘤能力，筛选出优势细胞表面标志。通过9-12周的肿瘤接种生长期，可观察到某部分小鼠罹患了肿瘤，而有些则完全没有，把这部分种植阳性肿瘤小鼠的表面物质进行筛选，成为优势表面标志，其次针对几种优势细胞表面进行组合(例如A+B2C+)，筛选出各组合的细胞群，并按不同浓度组再次接种NDO/SCID小鼠，比较各细胞群成瘤能力，采用逐级联合筛选策略，最终确定目的细胞。
肿瘤干细胞的鉴定方法尚未成熟，目前尚难从形态学鉴定干细胞，只能从功能学角度来分析肿瘤干细胞。在乳腺癌肿瘤干细胞提纯实验中，Al-Hajj等[5]发现ESA+、LIN-、CD44+、CD24-/LOW细胞不仅有很强的成瘤能力，而且可以在小鼠体内连续传代，表明其自我更新复制能力。体外克隆形成能力亦可作为肿瘤干细胞鉴定方法，胶质瘤肿瘤干细胞体外培养显示其具有极强的肿瘤形成和自我复制能力。此外，还可以通过肿瘤干细胞和正常干细胞某些表面标志具有相似性的特点进行肿瘤干细胞鉴定，如AML的干细胞与造血干细胞都有CD34+、CD38-，两者差异仅在于Thy1-和Thy1+。
与造血系统肿瘤相比，实体瘤干细胞难以分离和鉴定。主要的原因：①在肿瘤组织制成单细胞悬液的过程中，蛋白水解酶对细胞表面抗原的破坏，会影响干细胞的鉴定；②许多实体组织自身的干细胞表面标志物尚未确定。
3 肿瘤干细胞与肿瘤
3.1 人类白血病干细胞的研究
肿瘤干细胞的研究是自1997年Bonnet等[7]发现人类白血病干细胞开始的。他开创性地发现人类急性髓系白血病中白血病干细胞的存在，他对不同表型的白血病细胞进行原代克隆培养，发现只有表型为CD34+，CD38-，Thy-的白血病细胞才能在体外形成克隆，而其他的则克隆能力很弱。尽管CD34+，CD38-，Thy-这类细胞所占比例很少，大约为0.2%，但把它们移植到糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠（NOD/SCID小鼠）之后能形成类似于人类急性髓系白血病的肿瘤细胞。
3.2 乳腺癌干细胞的研究
最近对乳腺癌的研究进一步证实，实体瘤也有干细胞存在。Al-hajj[8]首次成功的从人类乳腺癌中分离出肿瘤干细胞，极大的推动了对实体瘤干细胞的研究。他通过特异性的细胞表面标志（上皮细胞特异性抗原ESA、乳腺/卵巢癌特异性标记B38.1、黏附分子CD44等）分离纯化出乳腺癌初始细胞。乳腺癌初始细胞的特征细胞表型为Lin-，ESA+，B38.1+，CD44+，CD24-/low，此类细胞虽然所占比例很少，但只要约200左右个细胞即可在小鼠乳腺中形成肿瘤，而其他表型的肿瘤细胞则无致瘤能力。
3.3 人类神经干细胞瘤的研究
Singh等[9]宣布已经从人类不同类型的神经系统肿瘤中分离、纯化和鉴定出神经系统肿瘤干细胞，这些细胞具有显著的增殖、分化和自我更新能力。神经系统肿瘤干细胞中自我更新能力最强的干细胞是临床恶性度较高的成神经管细胞瘤，可以用表达神经干细胞表面标记物的CD133片段来分离，CD133+细胞在体外可增殖分化成肿瘤，并且再生肿瘤具有与原肿瘤类似的表型。
3.4 人类肺癌干细胞的研究
Kim等[10]在2005年报道支气管肺泡干细胞很可能就是肺癌的源头。研究者以一种非小细胞肺癌小鼠模型开始实验，首次从小鼠肿瘤的最初阶段分离到这种干细胞，将其命名为支气管肺泡干细胞。他们用流式细胞仪筛选发现，这类干细胞表达干细胞抗原Sca-1和CD34，但不表达血小板内皮细胞黏附分子PECAM和CD45。这个发现，进一步支持了肿瘤干细胞学说。
3.5 前列腺癌干细胞的研究
在对前列腺及前列腺癌的研究发现，起源于不同时期干细胞的前列腺癌有着不同的临床和生物学特征[11]。例如，早期的前列腺干细胞表达神经内分泌标记CgA，因而起源于早期干细胞的前列腺癌可转移到多个部位，并且表现更多的表型，异质性高；后期的前列腺干细胞表达PSA，起源于后期干细胞的前列腺癌转移到骨骼，并且表型较局限，同质性高（只有腺癌）。同理，起源于中期干细胞的前列腺癌既表达CgA，又表达PSA。肿瘤起源的干细胞越成熟，则肿瘤细胞的成分越单一。
4 展望
目前，治疗肿瘤的手段很多，但主要是针对肿瘤细胞而非肿瘤干细胞。通过对血液系统和实体瘤的研究，肿瘤干细胞概念日益引起人们的重视。这一概念的提出，为肿瘤的治疗提供了靶向性或选择性杀伤肿瘤干细胞从而根治肿瘤及防止肿瘤复发这一新途径。如果不能有效的杀死肿瘤干细胞，即使肿瘤组织消退了，剩余的肿瘤干细胞仍然可以不断复制而导致肿瘤复发，导致治疗失败。假如未来抗肿瘤的治疗明确针对肿瘤干细胞，也许会获得更多可喜的成果。
目前，对肿瘤干细胞的研究处于起始阶段，尽管在很多肿瘤中肿瘤干细胞已经得到确定，但尚有很多肿瘤疾病的肿瘤干细胞未得到确定，是否所有肿瘤都有肿瘤干细胞？其发生机制如何，这些都需要深入研究。无论如何，对肿瘤干细胞的研究已经成为当前肿瘤研究的热点。它在理论上丰富了肿瘤为主的理论，在临床实践中它提示人们一味杀伤肿瘤细胞(虽然它们也不断地增殖)并不能治肿瘤，原因是肿瘤干细胞往往处于休眠状态，或者说停滞于细胞周期的G0/ G1期。肿瘤干细胞的这种行为使得它们能逃逸当前的标准治疗方法，一旦“时机”成熟，或者一旦撤去抑制性药物，它们便会迅速增殖，成为复发的“源泉”。为此，今后的研究方向应是寻找对肿瘤干细胞有特异性杀伤作用的分子或者在“唤醒”休眠干细胞的同时也予以标准的化疗或放疗，这样方便“根治”。
相信，随着对肿瘤干细胞研究的不断深入，在肿瘤细胞的信号传导、细胞之间分子的比较、肿瘤发生的途径、基因表达等方面的研究的重心都将转移到对肿瘤干细胞研究上来，对肿瘤的治疗会产生深远的影响。
参考文献
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细胞研究范文第2篇
1 DPSCs的发现和生物学特性
牙髓是结缔组织,位于牙齿髓室和根管内，有一定修复再生的能力。由于成牙本质细胞是一种终末细胞,一旦分化后就不再分裂，因此普遍认为在成牙本质细胞遭受损伤后，牙髓内存在的未分化前体细胞可分化为成牙本质细胞，并分泌细胞基质。但直到2000年，Gronthos等[1]才首次正式提出DPSCs的概念,把具有克隆形成能力的高增殖率的牙髓细胞命名为DPSCs，在试验中应用酶消化法对成人第三磨牙牙髓细胞进行体外培养，并与骨髓基质干细胞( bone marrow stromal cells, BMSCs)进行比较,结果表明,这两种细胞具有相似的免疫表型，但DPSCs具有更高的克隆形成率和增生率,经体外诱导后能形成分散而高密度的钙化小结，当将DPSCs与HA /TCP支架共同培养后回植到小鼠背侧皮下，能观察到类似牙本-牙髓复合体样的结构。Miura等[2]发现人脱落乳牙(stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)的牙髓中含有多能干细胞,具有高度增殖和克隆形成的特性，当将体外扩增的DPSCs 和SHED 与羟磷灰石/磷酸三钙(hydroxyapatite/tricalcium phosphate, HA/TCP)联合植入免疫缺陷小鼠的皮下时可形成牙本质- 牙髓样结构。Young等[3]分离猪第三磨牙牙胚，制备单细胞悬液，并接种到可降解的聚合物支架上，植入大鼠肠系膜内生长20～30周，可成功地构建出牙齿结构，包括含成熟牙釉质的釉器官、牙本质、成牙本质细胞、髓室、上皮根鞘和成牙骨质细胞，证实了在猪第三磨牙有上皮和间充质干细胞的存在。
DPSCs 在形态上类似人骨髓成纤维细胞集落形成单位（colony forming unit fibroblast,CFU-F）[1]，大多数细胞呈长梭形，体积较小。透射电镜下，DPSCs 的核呈卵圆形，约占胞体体积的80%～90%，核仁大而明显，常染色质居中，异染色质少，分布于核周。胞浆很少，核浆比例大。细胞器较少，核糖体丰富,这些形态特征也体现了DPSCs的未分化或低分化状态。自我更新是干细胞的重要特性， Gronthos等[4]从3个月的原代DPSCs移植物中分离出基质样细胞,在体外培养扩增后植于小鼠皮下,结果形成牙本质-牙髓复合体样结构。对形成的牙本质样结构进行免疫组化检测, 发现其牙本质涎蛋白(dentin sialo protein,DSP)表达阳性,证实DPSCs具有自我更新能力。多向分化能力也是干细胞的特征之一，在不同的微环境下，DPSCs 可分化为多种细胞，矿化诱导培养基中，DPSCs能够形成与前期牙本质相似的球状矿化基质并表达成牙本质细胞特异性标志牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）[5]；在脂肪诱导培养基中，DPSCs培养物中出现油红“O”阳性的脂滴，并伴随脂肪细胞特异性的pparγ2 和lpl基因表达上调；此外，DPSCs 还在mRNA 和蛋白水平表达神经前体细胞和神经胶质细胞的标志：神经巢蛋白（ nestin）和神经胶质纤维酸性蛋白（ glial fibrillary acid protein，GFAP），这说明体外培养的DPSCs有向神经样细胞分化的潜能[5]。其他学者也成功地诱导了DPSCs 向成牙本质细胞、肌管样细胞以及脂肪细胞的分化[6-7]。
2 DPSCs的定位、分离和鉴定
Gronthos等[1]推测DPSCs可能来源于血管周围的微环境(perivascular niche)。Shi等[8]研究发现，DPSCs和BMSCs存在于它们起源组织的微血管周围。Tecles等[6]选取拔除的根尖孔未形成的第三磨牙分为三组：一组制备累及牙本质的浅洞，一组制备暴露牙髓的深洞，一组不做处理，分别观察牙髓内干细胞的活化和迁移，结果表明血管周围存在干细胞。干细胞表面的分子标记是鉴定和研究干细胞功能的重要手段，目前发现明确的干细胞标记不多，对DPSCs的标记物研究也不够深入。Gronthos等[1]应用免疫组化技术研究DPSCs的表面分子标记，并与BMSCs比较。结果表明，均表达与内皮细胞(血管细胞粘附分子1、CD146)、平滑肌细胞(α2平滑肌肌动蛋白)、骨细胞(碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨连接素、骨桥素、骨钙素)和成纤维细胞(Ⅲ型胶原、成纤维细胞生长因子2)有关的分子标记。DPSCs不表达骨基质蛋白、骨涎蛋白，而在BMSCs为低水平表达。用Northern blotting方法研究发现DPSCs不表达成牙本质细胞的特异性标记物牙本质涎磷蛋白( dentin sialophosphop rotein, DSPP)，说明DPSCs处于未分化状态,尚未分化为成熟的成牙本质细胞。为进一步比较DPSCs和BMSCs的性质，Shi等[7]应用基因芯片技术研究DPSCs和BMSCs的基因表达情况,发现两者在人类将近4 400个基因表达水平上是一致的，包括表达细胞外基质成分、细胞粘附分子、生长因子、转录调节因子等的基因。但同时发现，DPSCs较高表达ⅩⅤⅢα1型胶原、胰岛素样生长因子2、盘状结构域酪氨酸激酶、NAD ( P) H2维生素K3氧化还原酶、周期素依赖性蛋白激酶6等；BMSCs较高表达胰岛素样生长因子连接蛋白27和Ⅰα2型胶原。Liu等[9]研究发现,DPSCs分化时，初始Runx2、TGFβ相关基因、胶原代谢相关基因上调、碱性磷酸酶活性上升，后均下降；而细胞外基质磷糖蛋白(matrix extracellular phosphoglyco protein, MEPE)是DPSCs分化过程中唯一下降的标记物，作者认为MEPE是矿化的抑制剂,在DPSCs分化时下调，可作为DPSCs分化时的检测指标。最近Mokry 等[10]研究表明，牙髓干细胞表达STRO-1、vimentin、CD29、CD44、CD73、CD90、CD166等间充质干细胞的细胞标志物，同时表达Sox2, nestin及 nucleostemin干细胞标志物。
3DPSCs的多向分化能力与相关因素的调控
牙髓干细胞是来源于神经嵴和间充质的多潜能干细胞[11]，研究发现其细胞群主要是来源于神经嵴细胞群，细胞标志物为low affinity nerve growth factor receptor (LANGFR)和间叶细胞群，标志物为1-integrin receptor subunit。这两个细胞群都具有多向分化的功能。牙髓干细胞的多项分化能力即可塑性(plasticity)在国内外的很多实验中得到验证。Yu等[12]认为牙髓干细胞的分化方向取决于局部的微环境，他们在试验中发现利用猪牙胚细胞条件培养基能诱导牙髓干细胞形成更加合理组织学结构的牙本质-牙髓复合体。Iohara等[13]研究发现，BMP2能够刺激牙髓细胞分化为表达牙本质涎磷蛋白DSPP的成牙本质细胞。Saito等[14]也发现,BMP2能促进牛和人单层培养和三维胶丸培养的牙髓细胞分化为成牙本质细胞。Keklikoglu等[15]认为转化因子AP21家族的成员FosB在成牙本质细胞和牙髓未分化间充质细胞的分化和增生方面有重要作用。Moioli等[16]的研究,TGF2β能诱导DPSCs向成牙本质细胞分化。Liu等[17]研究表明牙本质素是MEPE的一个肽片段,它能下调P16，促进DPSCs的增生，在牙髓修复中扮演重要角色。Gronthos等[1]发现DPSCs在含有L2抗坏血酸22磷酸、地塞米松、无机磷酸盐的矿化诱导液培养基中培养5～6周后,经染色表明有钙结节形成。Yamada 等[18]的研究表明，人DPSCs高表达DMP1，而DMP1在未分化间充质细胞分化和牙本质矿化中起重要作用。Arthur 等[19]体内和体外实验中，分别加入了各种生长因子如EGF及FGF等，均发现牙髓干细胞可以分化为具有功能活性的神经元。Francesca Paino等[20]认为黑素细胞和牙髓细胞均源于神经嵴细胞群，在试验中DPSCs在没有外加定向诱导因素下，表达TRP-2、TRP-1、gp100/Pmel and MART-1抗原，且能自主分化为完全成熟的黑素细胞。Demarco 等[21]最近研究把三维多聚乳酸支架置于拔除的第三磨牙髓室内，用晶体盐或胶体做成孔剂辅料，把牙髓干细胞接种于其内，发现与牙本质相关的形态发生因子在诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞的分化中起着重要的作用，且DPSCs的微环境对细胞的行为和分化也有重要的影响。Jing WANG等[22]用纳米纤维多聚乳酸支架进行DPSCs体内体外定向分化研究，发现BMP-7 和 DXM复合因子及纳米纤维多聚乳酸支架可大大提高DPSCs向牙髓牙本质复合体的定向分化能力。Gronthos等[23]实验成功对DPSCs进行了脂肪诱导，而Norsat等[24]证明DPSCs具有神经分化分化能力。
4DPSCs向 iPSCs 的重组转化
诱导多潜能性干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是通过在分化的体细胞中表达特定的转录因子，以诱导体细胞的重编程而获得的可不断自我更新且具有多向分化潜能的细胞。由于iPSCs既避免免疫排斥，又不涉及伦理道德问题，因此具有广泛且重要的临床应用价值。在2006年日本学者Takahashi和Yamanaka[25]研究小组采用体外基因转染技术, 从24个因子中筛选出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4个转录因子, 通过逆转录病毒将上述4个转录因子导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞, 在小鼠ES细胞的培养条件下获得了Fbx15+的多潜能干细胞系, 该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形成畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似, 而在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠ES细胞, 故将其命名为iPSCs，从那开始全世界众多实验室开始了iPSCs研究[26-28]，相继从狗、猪、猴和人等哺乳动物的皮肤细胞、肝细胞、羊水细胞、CD34血细胞、骨髓干细胞及牙齿干细胞等成体细胞成功获得了iPSCs。其中牙髓组织在临床上易于获得，不牵涉伦理问题而得到广泛关注。Tamaoki[29]和Xing YAN等[30]研究小组利用病毒载体把c-Myc、Klf4、 Oct4、 Sox2 和Lin28、Nanog、Oct 4、 Sox2因子导入牙髓干细胞中，成功获得了iPSCs。
迄今为止，关于DPSCs的研究，国内外学者做了大量的工作，取得了很大的进展。但是DPSCs的研究仍面临许多问题,如DPSCs有无特异性细胞标志物? DPSCs的鉴定标准? DSPCs的潜在分化能力和如何定向诱导DPSCs的分化? Telomere在DPSCs体外培养和体内增殖过程中的作用机制？DPSCs向 iPSCs的成功转化载体和重组因子的优化？这些问题说明DPSCs应用于临床还有很长的路要走,需要相关学者更多的基础和临床研究。
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细胞研究范文第3篇
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。
成体干细胞因不涉及伦理和法律问题逐渐成为当前干细胞研究的主流方向。自Gronthos等⑴首次报道从体外培养的成人牙髓组织中获得集落状生长的细胞，该细胞可被诱导分化为成牙本质样细胞并形成牙本质样结构，由此提出了牙髓干细胞（DPSCs）的概念，由于其高度增殖能力和多向分化潜力，备受人们关注。本文将从牙髓干细胞的分离，标记及生物学特性作一简要综述。
【中图分类号】R254【文献标识码】A
1 牙髓干细胞的分离培养
从临床拔出的牙齿中可以很容易的分离出人的牙髓组织，再用酶消化法从牙髓组织中分离出单个的牙髓细胞。低浓度接种后，牙髓干细胞可以在培养皿中贴壁生长，培养10-14天后，形成单克隆集落。应用BrdU，单个克隆的增值速率明显不同，常规培养条件下只有20%的细胞克隆群体倍增次数能超过20。这意味着在多克隆来源的细胞中，最终生存的主要是这一小部分高增值性克隆的细胞后代。
2 牙髓干细胞的分子标记
目前的研究表明尚无有效鉴定和分离牙髓干细胞的方法和特异性分子标记。 Shi 等⑵通过研究发现 DPSCs 存在于它们起源组织（颌突上皮和外胚间充质）的微血管周围，利用 STRO-1 能结合牙髓组织血管周细胞抗原的特性分离出 DPSCs，结果显示牙髓细胞中含有大约 10% ～20%的 STRO-1 阳性 DPSCs。CD146 作为免疫球蛋白超家族成员，已知是脉管周内皮细胞抗原标志，DPSCs也有表达。Mokry等⑶研究表明，牙髓干细胞表达STRO-1、vimentin、CD29、CD44、CD73、CD90、CD166等间充质干细胞的细胞标志物，同时表达Sox2，nestin 及nucleostemin干细胞标志物。
3 牙髓干细胞的生物学特性
3.1高度增殖能：；Gronthos等⑷在体外培养的的第一代牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞（BMSSCs）中加入 Brdu 后检测细胞的增生率。结果发现 DPSCs 的增生率高于 BMSSCs，DPSCs 约有 72% 阳性细胞，而BMSSCs 约有46%阳性细胞。同时发现 DPSCs 的克隆形成率为 0.22% ～0.70%，远高于BMSSCs 的 0. 024% ～0.031%。
3.2自我更新能力：Gronthos等以羟基磷灰石-磷酸三钙陶瓷颗粒为载体，将人DPSCs 植入到免疫缺陷裸鼠背部皮下，6周后病理检测发现了牙本质牙髓复合体样结构，表达牙本质特异性蛋白-牙本质涎磷蛋白。说明DPSC具有自我更新能力。Reya T等研究表明Wnt 信号通路在自我更新过程中起到重要作用，而Scheller等⑸发现Wnt信号负面调节成牙本质细胞样分化。在含有碱性成纤维细胞生长因子的培养基中，DPSC能持续保持自我更新能力，并且比无碱性细胞因子的培养基中期细胞比率高⑹。
3.3多向分化能力：成牙本质诱导分化：Iohara等⑺研究表明在体外骨形成蛋白能促进牙本质涎磷蛋白和基质金属蛋白酶的表达，当把BMP2和牙髓侧群细胞混合植入切碎牙髓组织上时更能促进修复性牙本质的形成。Alsanea等⑻研究表明当在DPSC的胶原模拟穿孔修复支架上加入牙本质基质蛋白1（DMP1）后，也能促进牙本质再生。
成骨诱导分化：2007年d'Aquino等⑼和Otaki等⑽先后报道了人恒牙牙髓干细胞体外诱导可向骨组织分化，初步证实了人恒牙牙髓干细胞的成骨功能。Liu等⑾发现将牙髓干细胞移植至加入骨形成蛋2的纳米羟磷灰石/聚乳酸支架上可加速骨形成能力。并且比骨髓间充质干细胞、骨膜细胞表现出更高的成骨细胞能力，因此，牙髓干细胞可成为组织工程中很好地种子细胞。
成神经组织诱导分化：张智慧等⑿在体外诱导大鼠牙髓干细胞分化出现神经元形态，移入成年大鼠脑内发现细胞能够存活。Fernandade 等⒀研究发现当 DPSC移植至脊髓受损的小鼠体内，可恢复其神经机能障碍，说明DPSC具有促进中枢神经系统神经再生潜力。Leong等研究发现这种神经系统的恢复不是由于神经的替换，更多是由于依赖于DPSC旁分泌的调节作用。
成肌肉组织诱导分化：Yang等将克隆的异位干细胞DPSC移植至肌缺损的小鼠体内，DPSC可在小鼠体内存活，并表达抗肌萎缩蛋白和肌球蛋白重链，并且体内成肌分化能力比父母异构细胞更显著。Gandia等将DPSC移植至急性心肌梗死兔子体内，发现DPSC可提高左心室功能，促进血管生成，减少梗死区域。
成脂肪诱导分化：李景辉等从正畸治疗减数拔除的恒前磨牙中分离牙髓组织，应用酶消化法获得牙髓细胞，单抗Stro-1标记、免疫磁珠阳性分选系统分选获得牙髓干细胞，第3代牙髓干细胞用成脂肪向诱导培养基向脂肪细胞诱导分化，结果证明人恒牙牙髓干细胞经成脂肪向培养基诱导后表现出脂肪细胞特性，说明了人恒牙牙髓干细胞在体外具有分化为脂肪细胞的潜能。
4 牙髓干细胞的免疫调节作用
DPSC的免疫调节功能是由于通过副分泌机制的可溶性因子和细胞因子，通过抑制T淋巴细胞和调节性T细胞上调导致免疫耐受。Zhao等研究发现DPSC表达Fas配体，并且Fas配体可诱导T细胞凋亡，当通过干扰RNA将Fas配体敲除，可减低其诱导T细胞凋亡能力，说明Fas配体调控DPSC的免疫调节特性。
5 牙髓干细胞的应用展望
牙髓干细胞的多分化潜能和诱导潜能，让我们看到了多种组织修复的希望。如：利用DPSC体外扩增后复合支架材料移植于死髓牙根管内，可让死髓牙恢复为活髓牙；对于脊髓损伤的患者，利用DPSC的多分化能力，修复神经损伤；牙缺失后的牙槽骨萎缩，外伤后骨缺损，通过组织工程学进行骨修复。牙髓干细胞的研究才刚刚起步，许多问题有待于我们解决，如牙髓干细胞的特异性标志物，分化机制，合适的支架材料及生长因子的等，相信随着这些问题的解决，牙髓干细胞在再生医学方面将会大放异彩。
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细胞研究范文第4篇
1巨噬细胞及其极化
巨噬细胞是天然免疫系统的重要成员之一，具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤等多种生物学功能［4］。巨噬细胞通过与外界刺激信号相互作用进而分化为具有不同功能亚群的过程称为极化［5］。巨噬细胞此种可塑性具有组织特异性，并且受自身与系统信号的调节。由于对周围组织、病原体或激活的淋巴细胞来源的不同信号的应答，巨噬细胞可分化为M1与M2两种不同功能的极化类型。M1型巨噬细胞被认为是活化巨噬细胞，受脂多糖、γ-干扰素、肿瘤坏死因子或巨噬细胞集落刺激因子的极化，进而产生多种抗菌剂及炎症介质，如IL-6、活性氧和一氧化氮等［6，7］。相反，M2型巨噬细胞受IL-4与IL-10等极化，可分泌精氨酸酶、基质金属蛋白酶、TGF-β、IL-10和其他抑制免疫、血管再生与组织修复的细胞因子。根据受极化信号的不同，M2型巨噬细胞可分为M2a、M2b、M2c与M2d［8］。在恶性肿瘤的发生发展过程中，巨噬细胞可被极化为具有促进肿瘤发生发展功能的M2型巨噬细胞，也称为肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associatedmacrophage，TAM)。TAM在肿瘤的生长、转移及复发等方面均发挥十分重要的作用。恶性肿瘤患者体内TAM极化的详细机制未完全阐明，不同类型肿瘤可能通过不同方式极化巨噬细胞。肿瘤缺氧微环境可诱导缺氧诱导因子(Hypoxiainduciblefactor，HIF)表达，进而诱导巨噬细胞向M2型转变［9］。此外肿瘤细胞分泌的IL-10及TGF-β均可诱导TAM的极化［10］。关于TAM极化的详细机制仍有待进一步研究。
2TAM对白血病细胞的保护作用
2.1TAM对慢性淋巴细胞白血病的保护作用
慢性淋巴细胞白血病(Chroniclymphocyticleukemia，CLL)是主要发生于中老年人群的一种成熟B淋巴细胞克隆增殖性肿瘤，以淋巴细胞在外周血、骨髓、脾脏和淋巴结聚集为特征。CLL患者的中位生存时间约10年，但不同患者的预后呈高度异质性［11］。尽管CLL细胞在体内可大量增殖，但体外培养却很快凋亡，提示肿瘤微环境在CLL细胞存活中起重要作用［12］。此后学者发现，滋养细胞(Nurse-likecells，NLCs)可促进CLL细胞体外增殖、增强其抗凋亡能力。NLCs表达高水平CD68，且基因表达谱检测结果提示其基因表达特点与M2型巨噬细胞相似［13］，即CLL中的TAM。CD14+细胞通过与CLL细胞或正常B淋巴细胞接触、相互作用，可分化成为NLCs。与CLL细胞相互作用产生的NLCs表达高水平CD163与CD68，能够通过分泌CCL4促进CLL细胞增殖、抵抗凋亡。与正常B细胞相互作用分化而来的NLCs表达低水平CD163与CD68，且对CLL细胞无保护作用［14］。提示只有CLL细胞可诱导单核/巨噬细胞分化成TAM，进而促进CLL细胞增殖。虽然大多数研究均证实TAM在白血病细胞存活及耐药中发挥十分重要的作用，但其机制尚未完全阐明。TAM可能通过趋化因子CXCL12、CXCL13及血管细胞黏附分子-1(Vascularcelladhesionmole-cule-1，VCAM1)来促进CLL细胞增殖［15］。
近来Boissard等［16］首次研究发现，CLL细胞高表达淋巴细胞功能抗原-3(Lymphocytefunctionassociatedanti-gen-3，LFA-3)，而TAM表达CD2，TAM通过LFA-3/CD2相互作用增强CLL细胞的抗凋亡能力。该研究还分析了60例一线接受免疫化疗(化疗联合利妥昔单抗)的患者，结果发现LFA-3的升高与患者预后不良明显相关［16］。因此，深入研究TAM对CLL的保护作用及其机制可能寻找到新的针对CLL的治疗靶点。布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton'styrosinekinase，BTK)抑制剂依鲁替尼(Ibrutinib)2014年被批准用于CLL患者的治疗。近来有研究显示依鲁替尼可促进NLCs表达TAM相关标志。经依鲁替尼处理过的NLCs具有抵抗化疗药物诱导的CLL细胞凋亡，其机制可能与分泌IL-10有关［17］。因此，依鲁替尼在CLL治疗中的作用可能被重新评估，尤其对于某些治疗效果不理想的患者。
2.2TAM对急性髓系白血病的保护作用
急性髓系白血病(Acutemyeloidleukemia，AML)是一种由于造血干祖细胞基因突变所致的克隆性造血系统恶性肿瘤。AML是成人最常见急性白血病，约占成人白血病的80%。目前，AML仍是不可治愈性疾病。有关TAM对AML细胞保护作用的研究较少，但已有研究证实TAM在AML细胞的存活及耐药中均具有十分重要的作用［18］。本课题组尚未发表的前期研究结果发现AML患者白血病细胞体外培养呈现两种生长模式，一种为细胞色泽暗淡，与周围细胞分离生长;另一种为细胞色泽鲜亮，与周围细胞结合在一起。对周围细胞的进一步分析发现，其主要为巨噬细胞。体外实验也证实此种巨噬细胞对阿糖胞苷诱导的白血病细胞凋亡具有保护作用。但详细分子机制仍有待进一步研究探索。上述结果提示TAM与AML细胞耐药有关。因此，探究针对TAM的治疗策略可能有助于逆转AML细胞耐药。最近德国学者在TAM对AML细胞保护作用方面取得突破性进展［18］。
CD163是单核/巨噬细胞标志，CD206为TAM标志。AI-Matary等［18］发现AML患者骨髓中CD163+CD206+TAM比例较健康对照组明显升高。采用动物模型，他们发现AML细胞可诱导非白血病小鼠来源的单核/巨噬细胞转变为TAM，并在小鼠骨髓及脾脏中大量聚集;分离这类TAM，体外证实其对白血病细胞系C1498GFP的生长有明显促进作用，上述研究结果提示AML细胞可诱导巨噬细胞极化为TAM［18］。独立生长因子1(Growthfactorindependence1，Gfi1)在造血干细胞分化及成熟过程中具有十分重要的作用。白血病小鼠体内的TAM及体外与白血病细胞系共培养的巨噬细胞内Gfi1mRNA表达上调2倍;与野生型小鼠相比，Gfi1基因敲除小鼠生存期更长，骨髓及外周血白血病细胞比例更低，巨噬细胞多呈现M1型［18］。上述结果提示Gfi1在AML极化TAM过程具有重要作用。进一步研究发现Gfi1使巨噬细胞向M2型极化，阻止其向M1型极化可能与其抑制Toll样受体4信号通路有关［18］。此外，TAM上调Gfi1表达是其分泌精氨酸酶-1及IL-10等免疫抑制分子所必需的［19］。尽管目前有关Gfi1在AML极化TAM中的研究不够深入，认识有限，但Gfi1可能作为AML潜在的预后分层标志或治疗靶点。
2.3TAM对急性淋巴细胞白血病的保护作用
急性淋巴细胞白血病(Acutelymphoblasticleukemia，ALL)是一种起源于B系或T系淋巴细胞的恶性肿瘤性疾病。ALL占儿童白血病的70%以上，预后较好;ALL占成人白血病的20%左右，预后较差。采用Notch1诱导的小鼠T细胞ALL(T-ALL)模型，Chen等［19］研究了小鼠骨髓及脾脏中TAM的表型及功能。研究结果发现无论是脾脏来源的TAM，还是骨髓来源的TAM，均可促进T-ALL细胞的增殖，且均具有较强的迁移能力。进一步研究发现脾脏来源的TAM具有更强的促白血病细胞增殖能力。转录组测序研究发现骨髓与脾脏来源的TAM具有不同的基因表达特征。近来该课题组又研究了T-ALL小鼠腹膜来源的TAM的表型及功能［20］。与脾脏及骨髓来源的TAM相比，腹膜来源的TAM精氨酸酶-1及诱导型一氧化氮合酶表达水平相对较高。腹膜来源的TAM同样可促进白血病细胞增殖。上述研究结果提示在T-ALL白血病小鼠体内不同器官来源的TAM可能具有不同的功能与表型。
2.4TAM对成人T细胞白血病/淋巴瘤的保护作用
成人T细胞白血病/淋巴瘤(AdultT-cellleuke-mia/lymphoma，ATLL)是一种少见的T细胞来源的恶性肿瘤。ATLL常发生于日本西南部、加勒比盆地及中非等地区。目前认为ATLL与长期感染人类白血病病毒Ⅰ型有关［21］。Komohara等［22］研究了TAM在ATLL中的预后意义。结果发现高比例TAM提示预后不良。多因素分析显示TAM是ATLL独立的不良预后因素。体外共培养TAM与ATLL细胞，发现TAM可明显促进ATLL细胞增殖。进一步研究发现，TAM可通过分泌C5a、肿瘤坏死因子、IL-6等促进ATLL细胞增殖。2014年，Saito等［21］报道ATLL患者体内，TAM数量及比率与反应肿瘤细胞增殖能力的Ki-67呈正相关，但并未发现TAM与预后的相关性。鉴于目前研究较少，上述结论仍需继续研究。
3结语与展望
细胞研究范文第5篇
1结果与分析
1．1预处理和制片条件采用4种低浓度预处理液：0．02％秋水仙素、0．05％秋水仙素、0．002mol／L的8－羟基喹啉水溶液、0．02％秋水仙素与0．002mol／L8－羟基喹啉的混合液，预处理1、2、3、4h。结果表明，4种预处理液中以0．05％秋水仙素、0．02％秋水仙素与0．002mol／L8－羟基喹啉的混合液作用效果较好，预处理时间1、2h时分裂相多处于前期和前中期，3h时中期分裂相较多且缢缩程度恰到好处，4h时染色体缢缩为难以计数的小点状。此外，预处理时应保持稳定的低温环境，温度稳定在18～20℃时，中期分裂相较多，而在不稳定的条件下分裂相较少。因试验材料为木本植物，所需解离时间较长，解离20min以下时胞质和染色体均染色较深；解离30min以上时均着色很浅；解离25min时，解离较充分，染色效果最好，胞质不着色或呈淡红色，而染色体着色较深。本试验最终确定野牡丹属植物预处理和制片条件为环境温度稳定在18～20℃，使用0．02％秋水仙素与0．002mol／L8－羟基喹啉的混合液预处理3h，解离25min。
1．2染色体数目从每个种的7～8个样品的根尖中选取4～5张质量较好的压片，选择染色体染色清晰、分散较好的30个细胞进行观察、记数。发现5个种的细胞染色体数虽然均有一定的变化范围，但基本都集中在一个数量上，因此将出现频率最高的这个数量作为该种的染色体数目。如表1所示，野牡丹2n＝24占70．0％，细叶野牡丹2n＝24占60．0％，多花野牡丹2n＝24占66．7％，地菍2n＝24占63．3％，展毛野牡丹2n＝24占86．7％。由此可认为，野牡丹、细叶野牡丹、多花野牡丹、地菍、展毛野牡丹染色体数目均为2n＝24。每个种中还有其他较小比例的染色体数目，这可能与野牡丹属的无性繁殖存在染色体数目的变异或染色体过小有关。
1．3染色体大小野牡丹、细叶野牡丹、多花野牡丹、地菍、展毛野牡丹染色体组总长度分别为27．86、23．44、17．09、39．86、46．84μm；绝对长度范围依次为0．82～1．67μm、0．71～1．45μm、0．43～1．26μm、1．01～2．36μm、1．49～2．99μm；相对长度为2．93～5．67、3．09～5．87、2．64～7．14、2．62～5．92、3．18～6．12，最长染色体与最短染色体的比值为2．0、2．0、2．9、2．3、2．0。
2结论与讨论
本研究中，野牡丹属的5个种染色体数均为2n＝24，这与Almeda［7］所研究的野牡丹科其他属的染色体可能为n＝9到n＝12基本一致。根据染色体分类的标准［8］，野牡丹、细叶野牡丹、多花野牡丹、地菍、展毛野牡丹均为小染色体类型，不易分辨着丝点，无法作核型分析。目前，对小染色体尚无明确的分析标准，Almeda［7］在对野牡丹科其他属植物的研究中，只分析了小染色体减数分裂的行为，但未作具体分析。最长染色体与最短染色体的比值可作为核型对称与否的分类标准之一［9］，本研究中野牡丹属5个种的比值为2．0～2．9，说明野牡丹属的核型比较对称。根据李懋学［8］的染色体相对大小差别愈大，核型越不对称的观点，比较5个种的染色体相对长度的标准差，野牡丹为0．86、细叶野牡丹为0．92、多花野牡丹为1．21、地菍为0．84、展毛野牡丹为0．87，说明5个种中地菍的核型较对称，而多花野牡丹的核型对称性较差。由于整个植物界的核型进化趋势是由对称向不对称发展，所以可认为5个种从原始到进化的顺序可能为：地菍、野牡丹、展毛野牡丹、细叶野牡丹、多花野牡丹。
细胞研究范文第6篇
【关键词】 肿瘤干细胞；肿瘤
肿瘤特别是恶性肿瘤是危害人类健康的一类严重疾病。关于肿瘤的发生、发展、侵袭、转移一直是医学研究的热点。近年来，通过对造血系肿瘤的研究发现，肿瘤细胞的生长繁殖和干细胞之间有许多惊人的相似之处，提出了肿瘤干细胞学说［1］，认为肿瘤中存在肿瘤干细胞是肿瘤发生、发展、侵袭、转移及耐药的决定因素，代表了肿瘤的主要生物学特性［2］。这一现象也在实体瘤中得到了证实。目前，肿瘤干细胞的研究已成为全球肿瘤研究的新方向，将对肿瘤研究领域和肿瘤的治疗产生深远的影响，本文就肿瘤干细胞的相关概念及其与肿瘤发生、发展的关系作一综述。
1 肿瘤干细胞简介
1.1 肿瘤干细胞的概念 早在150年前就有病理学家（如Cohnheim，Durante）提出肿瘤可能起源于少数组织干细胞［3］。1958年，Hewitt［4］研究发现只有0.1%～1%的白血病细胞可以在体外形成克隆。在随后的实体瘤(乳腺癌、卵巢癌、肺癌、神经母细胞瘤)研究中，hamburger等［5］也发现仅有1/1000或1/5000的肿瘤细胞在琼脂中形成克隆。因此可以得出结论：肿瘤并不是由均一的肿瘤细胞构成，其中只有部分肿瘤细胞具有致瘤性。而以往的传统观点认为每个肿瘤细胞都有无限的增殖能力。2001年，肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSC）这一概念被正式提出。CSC是指存在于肿瘤组织中的极小一部分具有干细胞性质的细胞群体，具有自我更新的能力，是形成不同分化程度肿瘤细胞和肿瘤不断扩大的源泉。目前，已从急性髓性白血病［6］、多发性骨髓瘤［7］、乳腺癌［8］ 、脑肿瘤［9、10］、非小细胞肺癌［11］ 、黑色素瘤［12］和前列腺癌［13］等多种类型的肿瘤组织中成功分离鉴定了特异的肿瘤干细胞。我国黄强等［14］也从人脑胶质瘤组织中分离并培养了肿瘤干细胞。以上研究充分证实了肿瘤干细胞的存在。
1.2 肿瘤干细胞的特点及起源 肿瘤干细胞主要具有如下特点：（1）极强的自我复制更新能力，能够产生与上一代完全相同的子代细胞；（2）不断的分化能力，能够产生不同表型的肿瘤细胞，并在体内形成新的肿瘤；（3）具有与非致瘤细胞不同的表面标志；（4）在肿瘤中的所占的比例较少。从以上特点可以看出，肿瘤干细胞所具有的自我更新及广泛增殖、分化能力与正常干细胞非常相似。而且研究表明，两者都表达端粒酶活性，并具有相似的调节机制，如Wnt和Shh等信号通路均参与了肿瘤干细胞和正常干细胞的调节。因此目前有许多研究者认为肿瘤干细胞可能起源于正常干细胞的恶性转化［10－13，15］，当正常干细胞积累多次突变后就获得了不确定的增殖能力而转化成肿瘤干细胞，并最终形成肿瘤。但有部分研究者认为肿瘤干细胞的产生是由已分化了的子代细胞再次激活干细胞的程序，即去分化的结果。有研究［16］将大鼠成熟肝细胞标记，再给予致癌剂。数周后发现，这些标记细胞表达了癌前期细胞的表面标记物。说明病灶是由成熟细胞去分化造成的。在胃癌及甲状腺癌的类似研究中亦有细胞去分化的实验证据［17、18］。因此，肿瘤干细胞的起源并不完全肯定，有待进一步的研究，也许两种方式都存在，或者组织类型的差异、所处微环境的不同都可能对其肿瘤干细胞的起源方式造成影响。最近，还有研究者认为细胞融合可能在肿瘤干细胞的发生过程中也起着重要的作用［19］。
2 肿瘤干细胞与肿瘤
2.1 肿瘤干细胞与肿瘤的发生、发展 目前认为肿瘤组织一般由三种细胞成分构成：（1）具有无限增殖能力和形成新的肿瘤克隆的肿瘤细胞，即肿瘤干细胞; （2）具有有限增殖能力但不能形成新的肿瘤克隆的肿瘤细胞; （3）上述两种能力都丧失的肿瘤细胞。如前所述，普通肿瘤细胞没有致瘤性，只有肿瘤干细胞才是肿瘤生长的初始驱动细胞。肿瘤的转移也是肿瘤干细胞选择相宜的组织器官“定居”的过程。Deng等［20］发现由于干细胞缺乏HLA抗原，异体干细胞移植后可长期存活于受体组织中。由此可以推测，肿瘤干细胞可能也缺乏HLA抗原，从而在转移过程中可以逃脱机体免疫系统的监视，出现“免疫逃逸”现象。肿瘤治疗后的复发同样也是由于肿瘤干细胞没有被完全消灭而导致的结果。从理论上来说，只要剩余一个肿瘤干细胞就足可以导致肿瘤的复发。因此，可以说肿瘤干细胞是肿瘤发生、发展的源泉。
2.2 肿瘤干细胞与肿瘤的治疗 肿瘤的治疗一直是医学研究的热点。传统治疗的对象是肿瘤的整体，通过手术消减瘤体，药物杀灭肿瘤或抑制生长，但大多数肿瘤细胞并无肿瘤源性， 其生长依赖于少量干细胞样的细胞（肿瘤干细胞）。如果肿瘤干细胞能被彻底消灭，则其余肿瘤组织细胞将会逐步凋亡；反之肿瘤仍将复发。因此，肿瘤干细胞才是我们治疗的主要靶点。
目前许多化疗药物靶向正在分裂的细胞。而肿瘤干细胞能够凭借其表达高水平抗凋亡蛋白(如bcl一2)、膜转运蛋白(如ABC转运、多药抗性蛋白)及绝大部分处于细胞静止期的特性，逃脱药物的杀伤作用，因此肿瘤干细胞有比普通肿瘤细胞更强的耐药性。Guzman等［21］的研究就表明人白血病干细胞对阿糖胞苷的抵抗力强于其他白血病细胞。以上因素不仅降低了疗效，也是导致肿瘤复发的重要原因。因此，目前我们迫切需要设计针对肿瘤干细胞的治疗方案。在信号途径的研究中寻找新的诊治靶点是方向之一，另外，诱导分化亦是思路之一。
3 问题和展望
肿瘤干细胞学说的提出，为我们指出了新的肿瘤治疗的靶点。但目前在这一领域还有许多问题需要进一步研究和阐明，如：肿瘤干细胞是否在各种组织中均存在，其基因表达上的差异如何；肿瘤干细胞是否是肿瘤发生的普遍机制；有哪些信号途径参与了肿瘤干细胞的调节。相信随着研究的进一步深入和以上问题的逐步阐明，人们最终将攻克癌症这一世界难题。
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细胞研究范文第7篇
摘要:
成骨细胞作为骨组织中的应力感受及效应细胞，在骨的生长、修复和改建中发挥重要作用，因此，研究不同应力刺激对成骨细胞的影响及其机制具有重要意义。成骨细胞在机体内可受到牵张力、流体剪切力及压应力等多种应力作用，目前对各种应力环境下成骨效应的研究也逐渐增多。本文就近年来不同应力刺激对成骨细胞功能的影响、成骨细胞对外力刺激的应答及信号传导通路等方面作一综述。
关键词:
成骨细胞;应力刺激;信号传导通路
在生长发育过程中，机械应力作为体内复杂力学环境中的重要组成部分，调节着骨组织的形成及改建，尤其在成骨过程中的作用更为明显。成骨细胞是应力敏感细胞的一种，其生长分化、功能活动及凋亡对骨骼形成与矿化的程度都发挥着重要的调控作用。早在1892年JuliusWolff等［1］就提出了Wolff定律，指出骨骼的生长会受应力刺激而改变结构。Hou等［2］也在小鼠活体实验中证实，物理刺激可以影响成骨细胞新陈代谢，调节细胞表型，并改变成骨细胞在骨发生及发展中的基因表达。骨组织对机械应力刺激的应答过程可划分为4个连续的过程，即力学偶联过程、生化偶联过程、信号传递过程、效应细胞的反应过程。应力刺激作用于机体时，成骨细胞通过力学刺激应答过程将物理信号转化为细胞内的生物化学信号，经过一系列复杂的信号传导过程，改变成骨细胞的基因表达及蛋白分泌，进而调控骨骼的生长、修复及改建。本文从不同应力刺激对成骨细胞功能的影响、成骨细胞对外力刺激的应答及信号传导通路等方面作一综述。
1不同应力刺激对成骨细胞功能的影响
目前研究不同应力刺激对成骨细胞功能的影响，常见的应力加载方式有牵张力、压应力及流体剪切力等。不同的应力加载方式和装置会对成骨细胞产生不同的应力效果。
1.1牵张力对成骨细胞功能的影响在体内，成骨细胞可分泌基质包裹自身，外力通过对此基质的形变刺激传导给细胞骨架，这些外力导致基质的变形，在骨陷窝及骨小管周围对成骨细胞形成拉力。目前多数体外培养成骨细胞的牵张力加载装置是基于此原理［3］。通过模仿生理状态下基质的形变，采用不同方法牵拉培养基膜，使粘附于基膜上的成骨细胞被动拉伸。近年来许多学者对牵张力加载装置进行了改进，如改用钛合金作为支架、使用弹性合适的硅胶或生物高分子材料等，并可调控刺激的大小、方向、频率、周期等［4］，但此种装置仍有其缺点，细胞受力大小取决于基质与基底膜的接触，培养基膜各区域细胞容易产生受力不均匀等情况，而且体外培养基膜的应变明显大于骨基质，且单轴牵拉时，牵拉轴的垂直方向可对细胞产生收缩压力。周期性培养基膜屈曲形变时，若屈曲率过大则产生流体剪切力，增加干扰因素。成骨细胞对牵张应力的作用很敏感。牵张刺激会激发成骨细胞的分化和增殖潜力，还可以刺激成骨细胞通过调整缝隙连接或旁分泌因子来调节成骨细胞［5-6］。此外，由于多孔微管特殊结构的放大效应，成骨细胞可感应到牵拉应力并传递至临近细胞［7］。在日常生活及运动中，机体内牵张力范围大约为500～3000με。唐丽灵等［8］对成骨细胞施加周期性拉伸刺激，发现500με的拉伸刺激促进了成骨细胞的增殖、胶原蛋白合成、碱性磷酸酶活力和骨钙素分泌，而1000με和1500με水平的拉伸则抑制了成骨细胞的生长和分化能力。Jacobs等［9］利用不同大小静态拉力分别刺激人牙周膜成纤维细胞及成骨细胞，认为合适大小的牵张力可促进人牙周膜成纤维细胞向成骨细胞的分化，过高的牵张力则会导致成骨细胞活力降低，不利于骨的改建。Shen等［10］的实验也发现周期性牵张力可促进牙周膜干细胞向成骨细胞分化。这些研究表明，只有合适大小及频率的牵张力才能促进成骨细胞增殖、分化，促进骨的生长、修复和改建。
1.2流体剪切力对成骨细胞功能的影响骨组织内存在大量的微管结构，外界应力可引起微管内液体流动，形成流体剪切力。可以说，剪切力是一种特殊形式的压力。目前广泛使用的流体剪切应变模型为并行平板流动室(parallel-plateflowchamber，PPFC)，它是一种可以提供较精确液体层流的实验装置，利用进出口的压力梯度造成流体剪切力，常用于研究细胞流体力学［11］。但是传统的平行平板流动室系统仍存在操作复杂、加工价格较贵、处理细胞的数量不足等缺点，且如何提供细胞在加载中所需要的温度、湿度、CO2分压等问题尚未能解决。2010年Zhou等［12］提出了一种全新的模拟流体剪切力的加载方式—“摇晃法”加载系统。他们构建了一个有节律的摇晃矩阵培养板模型给细胞定量加载流体剪切力，并利用数学模型确定了临界翻转角度以及所产生流体剪切力的理论数值。其力值大小与液体的粘稠度和最大摇摆角成正比，与矩阵内液体的深-长比和摇摆周期成反比。Zhou等认为，在这种上下摇晃的系统中，只要控制得当，模型中细胞所受流体剪切力差异将少于20%。此种加载方式优点在于简便易行，可处理大量细胞，便于激光共聚焦显微镜或原子力显微镜的原位观测，且其产生的动态剪切力能更好地模拟活体组织中的力学环境。但Zhou等并未将此装置应用于实际，沈等［13］利用此装置对成骨细胞进行了加载。他们将生长活跃期的成骨细胞以5×105个/ml的密度接种在矩形培养皿中，待细胞贴壁后，于超净台上将培养皿放置于CHA-S恒温振荡器上，设定晃动频率和幅度，保持晃动时培养液与培养皿底面的角度不超过±5°，频率为120r/min。加载液(DMEM培养基)的量为18.6ml时，根据Zhou等提出的培养皿中心处的流体剪切应力公式计算，培养皿中84%区域的细胞将受到6.2～8.8dyne/cm2的流体剪切应力。通过与平行平板流动室结果的比较，沈等认为，“摇晃法”更适用于:(1)多组别、大通量的细胞加载研究;(2)加载后对细胞内极微量的细胞因子进行定量检测;(3)需要对加载后的细胞进行原位观测的情况。此外，Lim等［14］也利用“摇晃法”成功诱导了牙槽骨间充质干细胞向成骨细胞的分化。越来越多的证据表明，在机械外力加载后，由于胞外液体在微管结构中流动产生的流体剪切力，是调节骨细胞新陈代谢的主要外界刺激。Burger等［15］提出的腔隙-小管网络结构的假说，认为骨组织中腔隙-小管构成的三维网络执行骨中力学传感和力学信号转导功能，剪应力是外在力学刺激传感到骨组织细胞的主要作用形式。成骨细胞在体内及体外实验中均可受流体剪切力的作用，动态的流体剪切力可促进成骨细胞分化增殖，抑制成骨细胞凋亡［16］。Qin等［17］研究表明，骨髓内震荡压力产生的流体剪切力及流体静压力可促进骨生成，Zhang等［18］的动物实验也证实了这一点。Li等［19］实验显示流体剪切力能够提高骨密度。Young等［20］则进一步提出，流体剪切力是通过诱导COX-2的表达，调节PG的产生，从而影响骨新陈代谢的整个过程。而Jiang等［21］认为ERK5信号通路是诱导COX-2表达的重要途径。Aisha等［22］也发现流体剪切力可明显促进人体成骨细胞内线粒体的代谢和增殖，防止细胞凋亡，促进ALP活性及骨钙素蛋白增加，且细胞内RANKL/OPG的比值降低，提示流体剪切应力可抑制破骨细胞活性。
1.3压应力对成骨细胞功能的影响目前关于压应力对成骨细胞功能的影响相对研究较少。早期研究压应力对成骨细胞功能的影响主要为静态压应力。Koyama等［23］的研究显示，3.0g/cm2的持续静压力可促进成骨细胞释放炎性细胞因子，诱导破骨细胞的骨吸收。Quinn等［24］认为持续的静态压力使细胞与培养基内可溶物质交换减慢，导致细胞代谢功能的减退。在正常生理情况下，骨组织在受力过程中因运动、重力等多种因素影响，位于骨组织表面、骨内外膜下的成骨细胞同时也受到持续不规则的力学刺激，因此持续性动态压力对成骨细胞的代谢及成骨作用有重要影响。Liu等［25-26］认为动态压力可诱导间充质细胞的早期成骨分化，促进骨组织矿化及细胞的增殖。Damaraju等［27］认为动态压力可以加速成骨细胞分化，促进成骨细胞的聚集。Sanchez等［28］也认为动态压力可使细胞内IL-6水平升高从而调控骨的生成。目前对于压力的加载方式主要为气压调控，也有部分实验采用离心作用，对成骨细胞进行离心加载，来模拟运动过程中骨所受压力，此种加力方式优点是力值稳定，方向一致，可靠性好，不损伤细胞，可以多次重复进行，但在离心过程中细胞由于离心力加载时细胞并不处于统一的离心半径，因而其应用存在一定局限性。近年出现的Flexcell压力系统能为各种组织、三维细胞培养物提供压力加载，其具备多种优点，如可以提供周期性动态压力;实时观察细胞及组织在压力作用下的反应;基于柔性膜基底变形受力均匀;加载频频率、形变率可以精确调节;操作简便等，是以后研究压力对细胞功能影响的较理想装置。
2成骨细胞对外力刺激的应答及信号传导通路
早在20年前，Duncan和Turner［29］就已经将细胞内感受机械应力的过程总结为4个阶段:第一步为力耦合，即将骨组织受到的机械应力传递至细胞中，造成细胞外形的改变，或使骨基质中间隙液流动加快，造成流动电势，并使显露于液流中的细胞受到剪切力的影响;第二步为力传导，即将加载于细胞上的机械信号转换为细胞内的化学或电学应答的过程;第三步为信号传导，包括蛋白激酶级联系统、G蛋白系统、力学特异敏感性离子通道、细胞间隙连接、第二信使系统等;最后一步是细胞发生生理反应或功能变化，完成力学刺激对细胞的作用过程。成骨细胞作为骨组织中的应力敏感细胞，在感受到外界力学刺激时，会通过多种信号传导通路将机械信号转化为生物化学信号，通过细胞内信号的传导到达效应位点，从而刺激成骨细胞的功能活动。由于应力刺激导致的细胞因子改变是此过程中的关键，因此对信号传导通路的研究是目前的热点，其中BMPs及Wnt/β-catenin信号通路作为重要的通路而被广泛研究。
2.1BMP2-smad5-Runx2传导通路在成骨细胞感受外力刺激中的作用骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMP)是多功能生长因子，其在骨组织中表达，为维持骨代谢平衡所必需，在骨骼发育和骨折愈合中发挥重要的作用，是一个极其重要的调节蛋白家族。骨形态发生蛋白除BMP1外均属于TGF-β超家族。在迄今发现的约20多种BMPs成员中，以BMP-2、BMP-4和BMP-7的活性最强。BMP2是BMPs家族中非常重要的一个亚型，可以刺激间充质干细胞向成骨细胞分化，并促进成骨细胞分化为骨细胞。BMPs与其受体BMPR结合，通过蛋白传递信号促进成骨细胞分化，其中Smad-RunX2是BMPs向细胞内传递信号的主要通路之一［30］。Bjoern等［31］认为适当的活动或压力刺激可通过增强骨生成效应促进骨折的愈合，10%的压力［(11.81±0.42)kPa］可促进BMP-2、smad-5、RunX2的表达，从而进一步促进ALP、COL1、OC、OPN等基因及蛋白的表达。Mitsui等［32］实验也证明了应力可促进BMP蛋白的表达，并确定了一个最佳的通过BMP通路成骨的作用力，来指导正畸临床工作。Wang等［33］也认为，拉应力通过BMPs-Smad信号通路促进成骨细胞分化，并可能是通过降低Smurf1来促进Smad蛋白聚集，从而激活BMPs-Smad信号传导通路。
2.2Wnt/β-catenin信号通路在成骨细胞感受外力刺激中的作用Wnt基因于1982年由Nusse等发现［34］，其编码的Wnt蛋白具备分泌型生长因子的特点，研究发现其能够在应力作用下通过自分泌的方式对成骨细胞发挥作用［35-36］。在成骨细胞中，Wnt蛋白参与了4条信号通路，即Wnt/β-catenin信号通路、平板细胞极性信号通路、Wnt/Ca2+信号通路、含环磷酸腺苷(CAMP)效应元件结合蛋白的蛋白激酶A(PKA)信号通路［37］，其中Wnt/β-catenin信号通路即经典信号通路研究最为成熟。细胞内分泌的Wnt配体通过细胞表面受体Fzd家族与LRP5/LRP6受体结合形成复合物，受体复合物引起β-catenin在细胞内的积累，从而传导信号至细胞内。Norvell等［38］发现流体剪切力刺激可以激活Wnt/β-catenin信号通路从而影响成骨细胞的分化。Robinson等［39］发现体内及体外加载应力刺激都能够促进β-catenin蛋白的表达，且Wnt/β-catenin信号通路可增加成骨细胞对机械力刺激的敏感性。Liu等［40］认为，流体静压力可促进Wnt蛋白表达，且应力可能是通过ERK通路促进Wnt10b表达。Jansen等［41］的研究显示，15min的周期性拉伸应力在实验初期可以促进前成骨细胞内β-catenin蛋白的表达，但在结束周期性加载12h和40h后β-catenin蛋白的表达明显减少。另有研究发现［42］，在成骨作用中PTH与Wnt信号通路相关，主要表现在:即使细胞内有Dkk1过表达，PTH仍可激活Wnt信号通路，而如用Dkk1抑制Wnt信号通路则会减弱PTH在基质细胞中的作用且会抑制新骨的形成，PTH要发挥全部功能需要完整的Wnt信号通路。目前，虽然人们对Wnt/β-catenin信号通路在应力作用下影响成骨细胞分化的机制有了初步认识，但由于Wnt信号通路并不是单一的通路，而是与其他相关通路形成复杂的网络，因此在今后研究中应着重探究Wnt/β-catenin信号通路和其他通路的交联作用。
3展望
细胞研究范文第8篇
摘要 本文主要综述了90年以来有关肝血窦内皮细胞（HSEC）研究的新进展，包括HSEC的分离培养，细胞窗孔及其有关调节因素，第Ⅷ因子相关抗原的表达变化与肝纤维化的关系，分泌一氧化氮（NO）和内皮素（ET）及其对肝微循环调节和病理生理意义，细胞表面多种受体和粘附分子的表达与功能作用及其与肿瘤转移的相关性等。
肝血窦内皮细胞（Hepatic Sinusoidal Endothelial cell，HSCE）是肝非实质细胞中数量最大的一种细胞，约占肝非实质细胞总数的50%。它的形成结构和功能特性与一般血管内皮细胞均有很大差异。一般血管内皮细胞的研究较早也较广泛而深入，HSEC的研究则起步较晚，近年随着HSEC分离培养方法的不断完善，对HSEC的研究也逐渐增多和深入，发现HSEC在肝功能活动中发挥重要作用[1]，本文就HSEC的近年研究进展作一综述。
1 HSEC的分离培养
内皮细胞尤其是实质性器官内血管内皮细胞的研究多需依赖体外实验方法。Knook首次用链霉蛋白酶（pronase）灌注肝组织，以离心淘洗术（centrifugal elutriation）分离纯化HSEC，但链霉蛋白酶可破坏HSEC的表面受体，影响细胞质量。以后用肠毒素取代链霉蛋白酶，肠毒素只破坏肝细胞，不破坏HSEC表面受体。但市场上缺乏商品化肠毒素，淘洗术设备昂贵、操作程序复杂，难推广应用。应用胶原酶灌注肝，继而用二氧化硅（percoll）密度离心法分离HSEC，既能使肝细胞很快完全分解，又能完好的保存HSEC活性和内吞能力。Percoll在相对高密度情况下，粘度较低，也不影响细胞表面结构。分离获得的HSEC中可能混有少量Kupffer细胞，可通过短期培养使其中的Kupffer细胞快速贴壁，即可获得高纯度（90%以上）的HSEC。本实验室研究体会[2，3]，Ⅳ型胶原酶溶液中含5mMCa2+并在390pH7.5条件下，酶活力最佳。胶原酶消化不足，可影响细胞得率；消化时间过长，则细胞膜破损，尤其是大量肝细胞被破坏，DNA外释，使残存的细胞相互粘连，影响细胞得率和细胞活力。在胶原酶溶液中加入少量DNase，可防止细胞间的粘连。在灌注胶原酶时，压力应控制在每分钟10ml以内，否则HSEC窗孔结构易受损害。另外，在缓冲液内入鞣酸，可防止HSEC众多窗口出现腔隙而相互融合。HSEC培养在胶原或纤维整合素支持膜上，细胞窗减少，也不形成三维空间结构：但在层粘连蛋白凝胶膜上可形成与血窦类似的三维管样结构，但内皮窗孔数减少[4]。如在Matrigel凝胶膜（其中含高浓度层粘链蛋白、Ⅳ型胶原、成纤维细胞生长因子、移动因子等）上培养HSEC，不但能促进细胞形成三维管状结构，还能保持窗孔数目。故Matrigel是体外研究HSEC的结构和功能的较理想的培养基。
2 HESC的窗孔及其变化调节
HESC有发达的窗孔，大多聚集形成筛板状，内皮外常无基膜。HESC窗孔是狄斯间隙内外进行物质交换的重要通道，是维持肝细胞微环境稳定的重要结构。电镜下观察大鼠HSEC，肝小叶中央带HSEC的窗孔直径为150nm，不叶周边带为175nm。窗孔大小可随肝生理病理状况的变化而改变，许多药物或制剂如细胞松弛素B、二甲基亚硝胺、硫代乙酰胺、双泛酰胺乙胺、细胞外基质、5-羟色胺等，均能改变窗孔直径，从而影响其物质转运动能[5、8]。肌丝抑制剂细胞松弛素B能使内皮窗孔直径增大，表明窗孔的变化与细胞骨架有关。微丝环绕在窗孔周围，相信窗孔间由16nm的中间丝连接；筛板周围又环着微管，筛板之间也有微管形成的网架结构。细胞骨架变化可动态调节窗孔的大小变化。[9，10]用免疫荧光和荧光染色双标法显示的HSEC，我们也发现胞质内有发达的微丝微管并构成窗孔的支架[1]。HSEC如同肌纤维一样也有质膜钙通道，也有钙一钙调蛋白-肌动肌球蛋白系统，胞质内钙浓度的变化可激活该系统，肌丝发生滑动，进而改变窗孔的大小[12]。用5-羟色胺处理培养的HSEC，它是钙通道激活剂，可和钙通道阻滞剂结合，使钙及非特异离子通道打开，Ca2+内流并与在胞质内的钙调蛋白结合，激活肌球蛋白轻链使之磷酸化，进一步激活肌动蛋白ATP酶，肌动蛋白收缩，窗口收缩20%。我们的研究也发现5-羟色胺可使HSEC内钙含量增高，细胞骨架发生变化，窗孔相应缩小；若先用钙通道阻滞剂异搏定处理HSEC，5-羟色胺则不能影响窗孔变化[1]。新近发现，若HSEC表达细小白蛋白（parvalbumin），即可阻止窗孔缩小，进而使窗孔扩大[13]。细小白蛋白属于钙结合蛋白家族，仅出现在哺乳动物某些肌纤维内，它与Ca2+有高度亲合力，与钙调蛋白竞争自由Ca2+，故可阻止肌浆内的Ca2+高峰，影响肌丝活动。我们用细胞松弛素B作用于培养的HSEC，发现细胞内的Ca2+含量变化不明显或呈下降趋势而窗孔则明显扩大[11]。细胞松驰素B可覆盖于肌动蛋白的末端，阻止其快速延长，使细胞内肌动蛋白聚合受阻，导致窗孔扩大。Latrunculin a的生物学效应与细胞松驰素B相同，但前者的最低用量是后者的1/100，且比后者早半小时达到最大效果[14]。这主要因为二者的作用机理不同，Latrunculin a是一种能和肌动蛋白单体结合形成1：1的混合物，从而降低肌动蛋白的分布密度。由此可见，HSEC窗孔结构调节受细胞内Ca2+浓度的影响，同时肌动蛋白的分布和状态对窗孔的变化也起重要作用，甚至起关键作用。
HSEC窗孔也是一种动态的生物滤过器，可阻挡直径大小200-500nμ的乳糜微粒，直径较小的乳糜微粒降解物则可通过。若用药物等因素使HSEC窗孔变小或消失，富含胆固醇的乳糜微粒降解物不能进入狄氏隙被肝细胞摄取，以至肝细胞合成胆固醇的负调节的作用减弱，内源性胆固醇合成增多，血液中的LDL和甘油三脂增多，易致动脉粥样硬化。另外，窗孔变化也影响肝细胞摄取外源性脂质和维生素A，贮脂细胞内的维生素A减少易转化为成纤维细胞，基膜和胶原生成增多，有可能导致肝纤维增生[15]。
3 HSEC的第Ⅷ因子相关抗原的表达
第Ⅷ因子相关抗原也称Von Willebrand factor(vWF)，是由血管内皮细胞和巨核细胞合成的一种大分子糖蛋白，在损伤后的止血过程中起重要作用。体内存在三种不同形式的vWF，即血浆内可溶性vWF，内皮细胞和血小板胞质颗粒内的vWF及基膜上的vWF。基膜上的vWF，即血浆内可溶性vWF，内皮细胞和血小板胞质颗粒内的vWF及基膜上的vWF。基膜上的vWF是血小板粘附于内皮下层的量主要活性物质，在血小板聚集附着于破损血管壁上起重要作用。一般血管内皮细胞表达vWF，它贮存在胞质内的一种杆状细胞器（W-P小体）内。是内皮细胞的特异性标志。HSEC是否表达vWF，曾有不同的研究报道，近年研究新分离的HSEC中不足5%的细胞呈vWF免疫荧光阳性，培养2-4天后的细胞vWF免疫荧光反应显著增强；HSEC和其培养液内蛋白质提取及SDS-DAGE分析，均证明其中含有vWF阳性产物，mRNA的提取和印迹杂交分析结果也证明HSEC内含有vWF的基因转录产物，而Kupffer细胞、贮脂细胞、肝细胞等均呈vWF阴性。已证明HSEC内含的vWF有三种蛋白质结构：vWF前体，成熟的vWF和降解的小分子vWF多肽。故可认为，正常肝可能仅少量HSEC表达vWF，故还不能将vWF的表达与否作为断断HSEC的标志。我们实验室和其他的学者的研究均发现[2，6]，肝纤维化病变中的HSEC不仅在结构上出现血管化现象（窗孔减少甚至消失），而且大量细胞由vWF阴性转为阳性，其病理意义有待探讨。
4 HSEC分泌一氧化氮和内皮素及其对肝微循环的调节作用
肝血窦的血流量很大，其血流变化对门脉压力的形成有一定的影响。肝血窦内的血流变化与狄氏隙内的贮脂细胞（又称星状细胞或Ito细胞）相关[17]。肝贮脂细胞也是一种肌成纤维细胞，它主要受HSEC分泌的一氧化氮（NO）和内皮素（ET）的作用而发生变化。ET是一种强有力的血管活性物质（21个氨基酸多肽），有ET-1、ET-2和ET-3三种同工型。ET主要由内皮细胞产生，通过旁泌作用于邻近的细胞和平滑肌细胞、周细胞和肝贮脂细胞，也可能自泌作用于自身，ET的主要功能是调控局部血管张力，但有人认为ET对生长和发育也有广泛的影响[19]。ET有两种类型的受体即ETRA和ETRB，它们均通过细胞内G-蛋白传递细胞外信号[20]。ETRA主要位于血管平滑肌细胞表面，它与ET-1的亲合力最强，约是与ET-3亲合力的100倍。ET与其受体结合介导血管平滑肌的收缩。ETRB与ET结合后产生的效应主要决定于细胞类型，如ET与内皮细胞自身的ETRB结合，可引起NO的释放及血管平滑肌松弛；若ET与血管平滑肌细胞上的ETRB结合，则可诱导平滑肌的收缩[21]。大鼠肝贮脂细胞表面的ET受体量远高于内皮细胞、Kupffer细胞和肝细胞等，若用ET-1灌注肝，可引起肝血窦收缩，光镜和电镜放射自显影术研究发现，ET-1主要与贮脂细胞结合。另外，用核酸杂交和竞争结合分析研究也证明[22]，贮脂细胞既表达ETRA又表达ETRB，ETRB还与细胞的生长分化调节有关。应用高能活体显影观察证实[17]，贮脂细胞表面丰富的ETRA与ET结合可致细胞发生很强的收缩作用。P物质、去甲肾上腺素与和血栓素等也能引起贮脂细胞的收缩，但作用较ET弱。
内皮细胞源性NO是一种血管舒张因子，它是在一氧化氮合酶（NOS）的作用下由L-精氨酸和氧分子结合而生成的。NOS有二种同工异构型：组织型NOS（原生OS，cNOS）和诱那里型NOS（iNOS）。cNOS依赖钙-钙调蛋白系统，产生的NO较少，参与细胞正常生理状况下的机能调节；iNOS在正常状况下不表达，也不依赖钙-钙调蛋白系统，在内毒素和某些因子刺激下才表达，产生大量的NO。可能由于内毒素和细胞因子影响核因子Kb/rd活性，后者激活iNOs基因的转录，从而使细胞产生大量NO[23]。
近来研究发现[24]，内皮细胞分泌NO又对自身的NOS的合成产生负调节效应。NO半衰期极短，仅30秒。NO可弥散入血管平滑肌细胞内，通过与细胞内Ca2+的结合，激活可溶性cAMP，使平滑肌松弛，血管舒张。肝贮脂细胞体外培养研究表明，外源性NO能阻止ET-1诱导贮脂细胞收缩；无论在含有或不含有内毒素或细胞因子的条件，贮脂细胞也产生NO，并以自泌方式作用于自身。
我们实验室的研究表明[25]，正常大鼠HSEC强烈表达ET-1，在肝纤维增生性病变时，HSEC表达ET-1明显减弱；用原位杂交和免疫组化法从核酸水平和蛋白水平的研究均证实，正常大鼠HSEC表达cNOS，产生少量NO，而在肝纤维化时，iNOS表达增强，NO的产生明显增多，这可能与肝病理状况下产生的一些因子作用于HSEC有关。
由此推测，正常HSEC生成的NO和ET-1，两者通过旁泌作用于邻近的贮脂细胞，调节和稳定肝微循环血流，在肝纤维化时HSEC合成ET减少，而NO的产生相应增多，使血窦扩张，进而改善肝纤维增生时肝血循环障碍。也有实验看到，给肝纤维化大鼠门静脉灌注NOS底物L-精氨酸，可降低门静脉对去甲肾上腺素的敏感性。表明肝内产生的NO有一定的降门脉高压作用[26]。由此可见，HSEC产生的ET和NO既有稳定正常肝微循环的作用，又与肝纤维化等病变的发生发展相关，尤与门静脉高压的形成有关。若将ETRA拮抗剂Bosentan灌注给肝纤维化并伴有门脉高压的大鼠，可降低门静脉压力，目前这一复合物已用于临床治疗[27]。倘若能有效控制肝内ET和NO的合成及其作用，可能有利于改善门脉高压。
5 HSEC表面受体和粘附分子的表达
HSEC的表型及其相应的生物学特性与其他内皮细胞有一定的差异。HSEC表达其他内皮细胞不表达某些受体如IgG的Fc受体、CD13、CD14等以及一些粘附分子如ICAM-1、CD4、α5β1、α1β1。HSEC不表达其他血管内皮细胞表达的分子，如C62、CD31、CD34等。这可能与HSEC所处的微环境有关[28-34]。
5.1 HSEC清除作用的相关受体表达
IgG的Fc段受体：实验研究证明，除胎盘血管内皮及肝HSEC表达IgG的Fc受体（FcR）外，其他正常血管内皮细胞均不表达FcR。IgG的FcR可分为FcRⅠ、FcRⅡ（CDw32）FcRⅢ（CD16）三种。HSEC仅表达FcRⅡ和FcRⅢ两种受体。我们以EA花环实验研究发现[28]，HSEC表达的FcR活性，在相应抗体介导下可与羊红细胞形成花环。应用FcR单克隆抗体及胶体金标记羊抗鼠IgG的电镜免疫组化法，可见HSEC表面与枯否细胞一样有数量不等的胶体金颗粒，更明确证实HSEC表达FcR；在HSEC内吞泡内也可见胶体金颗粒，提示FcR与免疫复合物结合并内吞入胞质内[25]。有研究认为，HSEC主要摄取血循环中可溶性免疫复合物，在溶酶体内被降解消化，但至今尚无直接证据表明HSEC有抗原递呈作用。在多数情况下，肝血窦中枯否细胞呈MHC-Ⅱ阳性，而且均表达HLA-DR和HLA-DQ，但很少看到HSEC具有HLA-DR活性，而HLA-DR在抗原递呈中起重要作用。因此，正常情况下的HSEC可能不具有抗原递呈作用，但不排除病理情况下被诱导而具有抗原递呈作用。
CD14和CD13：CD14是脂多糖结合蛋白受体。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性杆菌膜上的复合物，可刺激内皮细胞分泌细胞因子，可诱导机体产生非特异性免疫功能。HSEC上的CD14主要在处理血循环中的LPS-LPS结合蛋白复合物中起着重要作用。CD13是氨基肽酶-N受体，该酶可降解一些小分子多肽，参与小分子肽的调节。除HSEC表达CD13外，肝细胞胆小管和小叶间胆管上皮细胞顶部质膜也可检测到CD13，但在肝的其他血管腔面均未检测到。
其他受体：肝内有两套清除异物的细胞系统，即Kupffer细胞和HSEC[33]。前者吞噬清除颗粒性异物，后者通过受体介导吞饮可溶性的和小微粒性异物。HSEC有透明质酸受体、胶原α链受体、甘露糖受体、LDL受体等净化受体，分别清除细胞外基质成分和代谢产物，维持机体内环境的稳定。将荧光素标记的Ⅰ型前胶原N-末端肽或碘化AcLDL注入肝内，仅见HSEC内含有这些标记物，体外研究也有类似结果。因此，这些受体可作为鉴别HSEC的特异标志。
5.2 HSEC的细胞粘附分子表达
细胞粘附分子（cell adhensive moleculer，CAM）是细胞表面的一类糖蛋白，在细胞与细胞间结合、细胞与细胞外基质间的结合中起粘附作用，在维持正常组织结构以及炎症反应、免疫应答和肿瘤扩散转移等许多生理病理过程中发挥重要作用。目前依据基因结构的同源性和功能特点将CAM分为几类，如选择素（selectin）家族、整合素（integrin）家族、IgG起家族等。目前已知，正常HSEC表达以下几种CAM[30、35]。
α1β1和α5βL：二者属整合素家族的VLA组（very appeal;antigen VLA），同时还较弱地表达αVβ3和α11β3。这些整合素均是纤维粘连蛋白（NF）的受体，α1β1也是一种胶原受体，αvβ3和α11β3和11β3。可能与血管基膜的vWF或玻璃粘连蛋白（vitronectin）结合。HSEC表达这些粘附分子与肝窦周隙内含有的相应配体相关。正常肝窦周隙内有Ⅳ型和Ⅵ型胶原蛋白与FN，但无层粘连蛋白（LN），而HSEC也无LN的受体（α2β1、α3β1、α6β1、α6β4等）。但在肝硬化时，血窦壁出现明显的基膜（含LN），毛细胞血管化的HSEC也强烈表达α6β1和α2β1，而LN是毛细胞血管形成的重要诱导物。若事先用LN抗体处理，则能阻止HSEC的毛细胞血管化[35]。
ICAM-1和CD4：二者属于IgG超家族。此类粘附分子和免疫球蛋白可变区或恒定区有类似之外，功能性氨基酸也有一定的同源性，故称为IgG 超家族。细胞间粘附分子（ICAM-1，CD54）能与白细胞上的LFA-1（CD11α/CD18）结合，其功能与CD4相似。淋巴细胞粘附分子（CD4）可与HLA-DR结合，可介导白细胞或表达有HLA-DR的细胞粘附到HSEC上，可能与抗原递呈有关。CD4又是人免疫缺陷病毒受体。Kupffer细胞表面有HLA-DR和LFA-1，故推测正常HSEC表达ICAM-1和CD4可能与枯否细胞和淋巴细胞粘附于血窦壁上有关。
CD44：CD44是一种高度异质性的单链跨膜糖蛋白，广泛表达于各种血细胞、上皮细胞及多种瘤细胞的表面。不同细胞表达CD44的水平和类型差异很大，根据细胞表达CD44的分子量差异可将其分为3类：（1）80-90KD类，广泛分布于各种血细胞和多种间质细胞，通常称为标准型。此类CD44与透明质酸有较高的亲和力，是透明质酸的主要受体。（2）110-160KD类，主要表达于上皮细胞，一般不与透明质酸结合。（3）180-215KD类，表达量较少。CD44的配体是细胞外基质。HSEC上的透明质酸受体与CD44明显不同的是前者是由分子量为175KD和166KD两个多肽共同组成的[36]。正常HSEC表达CD44较弱，肝硬化时，也无明显变化。
正常HSEC不表达CD62（PADGEM），CD31（PECAM）及CD34，这三种分子也是连续型毛细血管内皮细胞的特征性标志。但在肝炎症时，HSEC则超量表达这三种分子，可能与炎症时HSEC的毛细血管化的变化有关。研究证实。血管内皮细胞超量表达PECAM-1是与血管形成有关的[37]。
HSEC表达粘附分子与肿瘤转移相关。肿瘤细胞经血行转移是个复杂过程，受多种复合因素调节。首先是癌细胞突破细胞外基质及血管壁进入血液，循环中癌细胞与血管内皮细胞（主要是毛细血管）的接触反应是发生转移的关键一步[38]肝脏是肿瘤细胞经血液转移的好发部位，这一方面由于胆具有独特的血循环特点，同时也与HSEC表达粘附分子有关。体外研表明[39]，高转移性肝癌细胞转移珠H59与原代培养HSEC粘附性较低，若无用TNFa处理HSEC，H59与HSEC的粘附性明显增高，而此过程可被MAb9a6(中性E-选择素单克隆抗体)特异地阻止。另外两种高转移性的人结肠癌株也有类似现象，而低转移性细胞株则无此现象。由此推测，正常HSEC不表达E-选择素，但在癌症时产生的细胞因子的刺激下，HSEC表达E-选择素，而高转移癌细胞表面有相应的配体，两者结合可介导高转移癌至肝实质内。
肝腺泡各带内的HSEC如同肝的其他非实质细胞一样，不仅有形态结构的差异，而且还有表型的差异[40]。Ⅱ带和Ⅲ带HSEC不表达IF-10抗原（是连续型毛细血管内皮细胞的标志），但表达特异标志CD14和CD16；Ⅰ带内的HSEC则表达IF-10抗原，而缺乏CD14和CD16；而CD4、CDw32、CD13以及其他粘附分子的表达，各带HSEC无明显差异。肝腺泡各带HSEC的IF-10的表达不同，可能与腺泡各带微环境不同而影响HSEC的分化有关。肝腺泡Ⅰ带HSEC缺乏CD14和CD16，肝血流中的IgG与Ⅰ带HSEC的亲合力低于Ⅱ带和Ⅲ带，故Ⅰ带HSEC的清除功能也逊于Ⅱ带Ⅲ带。 参考文献
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