水产养殖弧菌的处理
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水产养殖弧菌的处理范文第1篇
恩诺沙星恩诺沙星（enrofloxacin，ENR）又名恩氟奎林羧酸、乙基环丙沙星，属于喹诺酮类（Fluoroquinolo－nes）的化学合成抑菌剂，是一种喹诺酮类羧酸衍生物，为微黄色或淡黄色结晶性粉末，不溶于水，易溶于氢氧化钠溶液、甲醇及氰甲烷等有机溶剂［12］。恩诺沙星因在水产动物体内的半衰期长、分布广、吸收好、广谱抗菌等特性而被广泛应用于水产养殖动物感染性疾病的预防和治疗中。恩诺沙星在鱼类及水产动物体内的代谢主要是脱去乙基而成为环丙沙星［12］。其对革兰氏阳性菌、阴性菌及霉浆体均具有抑菌作用，对养殖鱼类的弧菌症及大肠杆菌症疾病也有很好的控制效果［13－16］。恩诺沙星在鲑鱼、虾、鲤鱼、中华绒螯蟹和鲶鱼等水产养殖动物中的组织残留和毒性研究证明，恩诺沙星在水产养殖中的使用是安全的。如对鲤鱼投喂不同剂量的恩诺沙星后，对鱼体的组织酯酶同工酶和血液指标的影响都比较小，对机体损伤程度较小［17］。余开等［20］用人工感染溶藻弧菌的三疣梭子蟹口灌恩诺沙星（给药剂量为10mg／kg）后发现，感染三疣梭子蟹口灌恩诺沙星合理的休药期应不少于18d。离体测定表明，盐酸恩诺沙星对鳗弧菌抑菌效果最好，最小抑菌浓度为0．122μg／mL，在24h内杀灭全部鳗弧菌［22］。周帅等［18］研究证明，与其他水产动物相比，恩诺沙星在拟穴青蟹体内的消除速度为中等水平，在拟穴青蟹体内代谢生成环丙沙星的量较少，给拟穴青蟹以10mg／kg剂量每隔24h口服投喂恩诺沙星，能够较好地防治弧菌引起的青蟹细菌性疾病。郭娇娇［26］用改进寇氏法计算得出，鲟鱼口灌恩诺沙星的半数致死量为1590．36mg／kg体重，95％可信区间范围为1172．20～1803．02mg／kg体重。樊海平等［23］发现，盐酸恩诺沙星对嗜水气单胞菌和温和气单胞菌的最小抑菌浓度与最小杀菌浓度值均为0．0488mg／L，且作用效果优于盐酸环丙沙星。
恩诺沙星对史氏鲟及小体鲟体内的细胞色素P450酶活性均有一定的抑制作用，随着给药浓度从0mg／kg到100mg／kg的增加，两种鲟体内的P450酶活性均逐渐降低，且史氏鲟体内P450酶活性降低幅度明显大于小体鲟［19］。在不同恩诺沙星给药浓度下，小体鲟和史氏鲟血浆和肝脏组织中的SOD活力均先受诱导升高，而后被抑制降低，且在40mg／kg浓度组达到最大值。血浆中SOD活力受给药浓度影响较小，起伏较平稳，而小体鲟SOD活力始终高于史氏鲟。肝脏中SOD活力变化较剧烈，在低浓度组（＜40mg／kg），史氏鲟肝脏中SOD活力明显高于小体鲟，而在高给药浓度组（＞40mg／kg）则小体鲟略高于史氏鲟［24］。恩诺沙星对嗜水气单胞菌作用的最适pH值为7～8，二价阳离子（Mg2＋）对恩诺沙星药效影响较大，随着Mg2＋浓度的增大，药效逐渐降低。血清可降低恩诺沙星的药效，细菌数量对其抗菌活性影响不显著［25］。恩诺沙星与蒲甘散联合使用对嗜水气单胞菌的抑制作用明显高于单方药物的抑制作用。同时，口服药饵试验结果表明，恩诺沙星单方给药、恩诺沙星与蒲甘散联合给药与未给药饵的对照组相比，差异均达极显著水平（P＜0．01），且以恩诺沙星与蒲甘散按1∶6比例给药的疗效最佳，对异育银鲫细菌性败血症有效率达91．8％［21］。恩诺沙星在水产上的使用历史不长，特别是在我国水产养殖业中，该药的广泛使用在20世纪90年代以后，由于缺乏恩诺沙星在水产动物体内的药代动力学、中长期残留参数，因此，在水产养殖生产中使用时，更多的是参照兽药上的使用规范，在使用方法和使用剂量上存在诸多不合理的地方，更不能制定安全、有效的休药期，因此，我国试行的水产用兽药恩诺沙星粉中对休药期的规定只能按500度日计。
诺氟沙星诺氟沙星是喹诺酮类药物代表之一，具广谱抗菌作用，尤其对需氧革兰阴性杆菌的抗菌活性较高。诺氟沙星体外对多重耐药菌亦具抗菌活性，对青霉素耐药的淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌亦有良好的抗菌作用。诺氟沙星为杀菌剂，通过作用于细菌DNA螺旋酶的A亚单位，抑制DNA的合成和复制而导致细菌死亡。由于该药抗菌谱广、抗菌力强、体内分布广、安全性高、价格低廉，在防治水产养殖动物细菌性感染症中也已有应用。诺氟沙星在大菱鲆体内的吸收较迅速，有利于疾病的预防和治疗用药。在组织中以肾脏中的残留最显著。使用诺氟沙星进行大菱鲆疾病的预防和治疗时，至少应停药30d后方可上市销售［28］。房文红［29］发现，诺氟沙星在不同动物间的药动学差异显著，这种药动学种属间的差异表明，诺氟沙星在一个动物的试验结果应用于其他动物时应予谨慎。诺氟沙星即使在同一种属体内以不同给药方式产生的代谢动力学参数差异也较大，如鲤鱼表现在房室模型和参数上，肌注、水剂口灌鲤鱼房室模型为开放性二室模型，而混饲口灌为开放性一室模型，药代动力学参数T1／2β、T1／2ka、AUC、Cmax和Tmax相差数倍，甚至数十倍［30］。王荻等［31］研究结果表明，诺氟沙星对小体鲟和史氏鲟给药浓度为30～50mg／kg时，即能使药效最好而又不会对肝脏产生明显的损伤。刘玉林等［32］用高效液相色谱法测定血浆和组织中的药物浓度，研究了诺氟沙星在大黄鱼体内的代谢及消除，在治疗大黄鱼细菌性疾病时，以诺氟沙星10mg／kg剂量给药，一般1d给药1次，连用2～3d，休药期不少于23d。朱秋华等［33］以3种水平的诺氟沙星混入饲料中投喂甲鱼，诺氟沙星在肌肉组织中可达到相对较高的水平，在停药后肌肉中药物残留量也较高，72h后排泄量仅为24h的24．8％，120h仅排出46％，240h排出75．8％，残留量为0．35～0．44μg／kg。对于诺氟沙星在水产动物残留检测的前处理方法上，以提取前用无水硫酸钠作脱水剂、酸化乙腈作提取剂振荡提取、正已烷去脂、旋转蒸发并离心的方法最灵敏、快速、准确、经济、实用性强。诺氟沙星的最低检测限为5．0μg／kg，在加入标准品水平为5．0～15．0μg／kg时，回收率为68．67％～82．89％，相对标准偏差为1．22％～7．32％［34］。诺氟沙星对溶藻弧菌具有明显的抗生素效应，在制定诺氟沙星给药方案时可以适当延长给药间隔时间，减少给药次数，仍能维持抗菌效果［35］。#p#分页标题#e#
环丙沙星环丙沙星是合成的第三代喹诺酮类抗菌药物，具广谱抗菌活性，杀菌效果好，几乎对所有细菌的抗菌活性均较诺氟沙星及依诺沙星强2～4倍，对淋球菌、绿脓杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、军团菌、肠杆菌都具有抗菌作用。由于环丙沙星具有抗菌能力强和广谱抗菌的优点，在过去的水产养殖上常用其治疗水产动物烂鳃病、赤皮病等细菌性感染病。但长时间摄入低剂量的环丙沙星会导致人体对喹诺酮类抗生素的产品产生耐药性。而且环丙沙星对人体会产生比较严重的肝肾毒性，所以在北美和欧盟等国家已禁止使用环丙沙星作为渔药，我国农业部也在2002年将环丙沙星列为水产养殖禁用药物。但由于该药疗效显著，目前，仍有很多渔民违规使用。为监测该药的不法使用，学者对环丙沙星的研究主要集中在水产养殖动物的残留和药代动力学上，对于其检测方法的研究也越来越受到关注。如聂湘平等［36］采用模拟水生态系统研究了环丙沙星在异育银鲫体内的积累和分布动态，结果表明，饲料暴露、水体暴露和混合暴露3种不同给药方式对环丙沙星在异育银鲫的体内积累趋势有明显的影响，在饲料给药暴露方式中，环丙沙星在鱼体内脏、肌肉中的残留量远高于水体给药暴露。3种不同给药方式暴露下，环丙沙星在异育银鲫内脏和肌肉中的积累趋势大致相同，暴露初期吸收较快，并且很快达到峰值。随着暴露时间的延长，环丙沙星在鱼体内含量逐渐下降。吴皓等［37］研究了环丙沙星在鳗鲡组织中的残留消除规律，陈辉华研究了环丙沙星在鲫鱼体内的残留消除规律［38］，但由于水生动物种类繁多，不同动物体内的残留规律存在差异，因此，在具体的动物体内的残留需要进行针对性的研究。
水产养殖弧菌的处理范文第2篇
【摘要】 目的 研究5种中草药对致病弧菌的抑菌活性，为水产品的安全用药提供参考。方法 采用纸片法和试管法，以溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)、塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鲨鱼弧菌 (Vibrio carchariae)为供试菌株，测定中草药不同极性萃取部分的抑菌圈和最小抑菌浓度。 结果 夹竹桃叶、芒果叶、苦楝叶和羊蹄甲叶4种中草药乙酸乙酯萃取部分对供试弧菌有很好的抑菌作用；苦楝叶和羊蹄甲叶石油醚萃取部分对副溶血弧菌有抑菌作用；芒果叶的水溶性部分对塔氏弧菌有很强的抑菌作用；枇杷叶提取物对4株弧菌均无抑制作用。结论 除枇杷叶外，其他4种中草药可不同程度的抑制致病弧菌的生长，其抑制致病弧菌的活性成分有待于进一步研究。
【关键词】 中草药；弧菌；抑菌活性；最小抑菌浓度
Abstract:Objective To study the antibacteria activities of five herbs， to provide references for the safe drugs of aquaculture. Methods Using Vibrio coralliilyticus， Vibrio tubiashii， Vibrio parahaemolyticus and Vibrio carchariae as the tested bacteria， the inhibition zone and the minimal inhibitory concentration（MIC）were measured. Results The extracts， extracted with ethyl acetate from the leaves of Nerium indicum Mill.， Mangifera indica Linn.， Melia azedarach L. and Bauhinia purpurea could inhibit vibrio. And the extracts， extrated with petroleum ether from leaves of Melia azedarach L. and Bauhinia purpurea can inhibit Vibrio parahaemolyticus， too. The remainder extracts of Mangifera indica Linn.showed strong inhibition effect on Vibrio tubiashii. While the extracts of Eriobotrya japonica showed no inhibition effect. Conclusion Four of the five herbs show antibacteria activities and the study on active compounds should be done in future.
Key words:herb；Vibrio；antibacteria activity；minimal inhibitory concentration
随着现代集约化和规模化水产养殖的发展，养殖中水产动物感染细菌的几率大大增加。为了预防水产动物疾病，大量抗生素类药物被用作水产药物。滥用抗生素使致病菌的耐药性增加，药物的有效性降低，同时也加剧了环境污染，残留药物降低了水产成品的品质，引发了市场对水产品安全性的质疑，降低了水产商品在国际贸易中的竞争力。因此，开发替代抗生素的高性能、无毒副作用、安全高效的抑菌药物引起了广大科研人员的关注。
本研究以夹竹桃（Nerium indicum Mill）、芒果（Mangifera indica Linn.）、苦楝（Melia azedarach L.）、羊蹄甲（Bauhinia purpurea）和枇杷（Eriobotrya japonica）等5种中草药为研究对象，选取对水产品危害较大的4株致病弧菌为实验菌株，旨在通过抑菌活性的筛选研究，获得安全有效的天然抑菌药物。
1 材料与方法
1. 1 仪器及试剂
主要仪器有DFT200型摇摆式高速中药粉碎机（温岭市大德中药机械有限公司）、RE52CS型旋转蒸发器（上海亚星生化仪器厂）、LDZX40CI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、150A生化培养箱（金坛市迅生仪器厂）、SWCJ1D型洁净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司）。所用试剂均为分析纯。使用的培养基为2216E培养基。环丙沙星纸片为杭州天和微生物试剂有限公司产品。
供试菌种：溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)、塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鲨鱼弧菌 (Vibrio carchariae)由南海水产研究所提供。
1. 2 供试药材及预处理
供试药材为广东常见的5种植物的叶，供试的5种植物分别是夹竹桃（Nerium indicum Mill）、芒果（Mangifera indica Linn.）、苦楝（Melia azedarach L.）、羊蹄甲（Bauhinia purpurea）、枇杷（Eriobotrya japonica）。5种供试植物均采自广东药学院药用植物园，原植物均经药用植物教研室严寒静副教授鉴定。供试植物叶片阴干后粉碎成粗粉备用。取供试药材粗粉各20 g，用60%（φ）乙醇回流提取90 min后滤过，滤液减压浓缩至50 mL后，依次用等体积石油醚、乙酸乙酯萃取。将3种萃取液分别减压浓缩至1 g/mL（以生药计），即得石油醚萃取部分（Ⅰ）、乙酸乙酯萃取部分（Ⅱ）和水溶部分（Ⅲ）。
1. 3 病原菌的分离和菌悬液制备［1］
将4株供试菌分别划线接种于平皿培养基中，于28 ℃培养24 h后，挑选单个菌落转接于斜面培养基中，28 ℃培养24 h后，用2 mL 0.9% NaCl溶液进行洗脱即制得所需菌悬液。
1.4 纸片法抑菌试验
按无菌操作规程［2］，吸取4株供试菌悬液各0.1 mL，分别加到平板培养基上并涂布均匀。将预先灭菌烘干并浸蘸定量药液的滤纸片（直径为5 mm）平贴在含菌培养基上。同时用浸有相应溶剂的滤纸片做对照。每份样品做3份，结果取平均值。28 ℃倒置培养，并于12 h和24 h观察抑菌效果，测定抑菌圈的直径。以环丙沙星为阳性对照。
1.5 试管稀释法测最低抑菌浓度
采用试管稀释法，以相应溶剂作对照，测定有抑菌活性的药液的最低抑菌浓度(MIC)。每种提取物为一组，每组取无菌试管12支，于第1管中加入1.0 mL浓度为2×105 CFU(colony forming units)/mL的菌液，在2～10管中每管加入1.0 mL 浓度为1×105 CFU/mL菌液，在第1管内加入中药浓缩液1.0 mL，充分混匀后取1.0 mL放入第2管，混匀后再取1.0 mL放入第3管，第1管内的药物浓度为原液的1/2，第2管为第1管的1/2，其余类推，直至第10管，每种药物的第11管作菌液对照（仅加菌液不加中药），第12管作药物对照（仅加中药不加菌液），以能抑制细菌生长（培养后培养基仍清亮）的最小药物浓度为其MIC。
2 结果与分析
2.1 纸片法抑菌试验结果
见表1。由表1数据可知，阳性对照环丙沙星对4株菌均有抑制作用，而中草药提取物只对溶珊瑚弧菌、副溶血弧菌和塔氏弧菌3株菌产生抑制作用。其中，夹竹桃叶、苦楝叶和羊蹄甲叶对副溶血弧菌和溶珊瑚弧菌有抑制作用；芒果叶对溶珊瑚弧菌和塔氏弧菌有抑制作用；枇杷叶对4株供试致病菌均无抑制作用。比较不同提取部位抑菌作用可知，乙酸乙酯提取部分的抑菌活性较明显，苦楝叶、芒果叶、夹竹桃叶和羊蹄甲叶乙酸乙酯萃取部分均产生抑菌圈；石油醚萃取部分的抑菌结果显示，苦楝叶、羊蹄甲叶石油醚提取部分能产生抑菌圈；水溶性部分只有芒果叶产生抑菌圈。分析不同供试菌敏感性发现，副溶血弧菌和溶珊瑚弧菌两株供试菌对夹竹桃叶、苦楝叶和羊蹄甲叶提取物均敏感，能产生不同大小的抑菌圈；塔氏弧菌只对芒果叶的水溶性部分敏感；鲨鱼弧菌对中草药提取物则完全不敏感。表1 5种植物不同萃取部分的抑菌圈（略）注：石油醚萃取部分简称为I，乙酸乙酯萃取部分简称II，水溶部分简称III。
2.2 试管稀释法测定最低抑菌浓度结果
见表2。由MIC数据可知，芒果叶提取物对溶珊瑚弧菌和塔氏弧菌的MIC最低，表明芒果叶提取物在质量浓度为12.5 mg/mL（以生药计）时即可完全抑制两菌的生长。苦楝叶和羊蹄甲提取物对溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌的MIC均为50.0 mg/mL（以生药计），夹竹桃对溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌的MIC为25.0 mg/mL（以生药计）。其他组分的MIC均大于200 mg/mL。表2 5种植物不同萃取部分的最小抑菌浓度（略）注：“+”表示MIC＞200 mg/mL
3 讨 论
弧菌（Vibrio）因菌体有一个弧状弯曲而得名，广泛分布于自然界中，水环境中较多，对人、鱼、蛙及其他动物均有致病性，其中霍乱弧菌和副溶血弧菌是引起人类细菌性食物中毒的首要食源性致病菌。目前，从海水、淡水和养殖水体中分离鉴定出弧菌（Vibrio）共有100多种，其中多数是致病菌，严重危害人类的食品安全。本研究所用供试菌鲨鱼弧菌和副溶血弧菌也是《美国临床微生物手册》记载的人类致病菌。通过研究发现，鲨鱼弧菌对5种中草药均不敏感，而其他3种致病弧菌均有敏感中草药，说明该菌具有对抗普通抑菌药物的生长机制，应对其机理展开进一步的研究。
本研究所选5种中草药是我国岭南地区资源丰富、广泛易得的药材。本研究结果表明，除枇杷叶外，其他4种均有抑制致病弧菌的作用。比较文献结果发现，夹竹桃粗提物对大肠杆菌、粪肠球菌等的MIC为0.5 g/mL［3］，本研究结果表明夹竹桃乙酸乙酯萃取物对溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌的MIC仅为25mg/mL。MIC结果差异的产生可能与以下2个因素有关：①菌种不同，敏感性不同。本研究采用的是水产养殖中的致病弧菌，而文献所用供试菌为杆菌和球菌；②药材的提取方法不同，本研究采用粗提后再萃取的方法处理药材，一定程度上精制了样品，去除了干扰，而文献中药物的处理方法仅为水提处理。本研究中，芒果叶的乙酸乙酯萃取物和水溶性部分分别对溶珊瑚弧菌和塔氏弧菌有较好的抑菌作用，说明萃取法可以有效地将不同活性的成分分开，比较文献所用的水煎煮法［4］，萃取法的优势在于将不同极性的成分进行了粗分，为进一步研究活性成分提供了依据。实验结果表明，苦楝叶和羊蹄甲叶分别对溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌具有较好抑菌作用，苦楝叶的抑菌功效与其清热燥湿的作用相符合，而羊蹄甲根的抗菌活性成分已被分离获得［5］。
此外，本研究采用环丙沙星为阳性对照药，实验发现环丙沙星对4株弧菌有广泛且明显的抑菌作用，说明该4株菌对环丙沙星较敏感且没有产生耐药性。虽然环丙沙星对4株弧菌的抑菌作用优于中草药提取物，但由于其成分和作用机理单一，临床上已有耐药菌出现。因此，不宜在水产养殖过程中长期用药。相比之下，中草药提取物由于成分复杂，作用机理不统一，较难产生耐药菌，有较高的实际应用价值，有必要进一步开发。
【参考文献】
［1］刘广锋，周世宁，徐力文，等. 杂色鲍幼苗“急性死亡脱落症”病原菌分析［J］. 中国水产科学，2006:13(4)：655-661.
［2］俞树荣. 微生物学和微生物学检验［M］. 2版. 北京：人民卫生出版社，1997：452-457.
［3］谭宏亮，黎鹄志. 夹竹桃叶水提取物抑菌作用研究［J］. 宜春学院学报，2007，29(4)：70-71.
水产养殖弧菌的处理范文第3篇
关键词 臭氧；水产养殖；水处理；问题；发展趋势
中图分类号 X714 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）07-0238-03
Research Progress on Application of Ozone in Aquaculture Water Treatment
ZHANG Guo-zhu LIU Lu GENG Cong LENG Jin-hui WANG Hua *
（College of Fishers and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian Liaoning 116023）
Abstract Ozone can be used in aquaculture water treatment.It can not only remove ammonia nitrogen， nitrite nitrogen and other inorganic pollutants from water，but also remove organic matter and pathogenic microorganisms.In this paper，the physicochemical properties of ozone and its action mechanism and application in aquaculture water treatment were reviewed，and the development ternd of its application in aquaculture water treatment was prospected.
Key words ozone；aquaculture；water treatment；problem；development trend
水a养殖业是典型的水依赖型行业，随着我国水产养殖业的快速发展和水环境污染问题的凸显，水产养殖用水安全备受关注。目前，国内外主要的水产养殖用水处理技术可分为物理处理技术、化学处理技术和生物处理技术[1-3]。臭氧作为一种强的化学氧化剂，现已应用于水产养殖用水处理中，不仅可以有效去除水中无机污染物，还能够去除水中有机污染物和致病微生物[4-6]。
1 臭氧的理化性质
臭氧分子为“V”形的偶极分子，氧原子是以sp2杂化轨道形成离域π键。臭氧具有刺激性气味，标准状况下密度为2.144 mg/L，沸点为-111.9 ℃。臭氧的氧化性极强，其氧化还原电位为2.07 V，氧化能力高于二氧化氯（1.50 V）和双氧水（1.98 V）。臭氧极不稳定，在水中易分解[7]。
2 臭氧在水处理中的作用机理
2.1 去除水中无机和有机污染物的作用机理
臭氧可以氧化水中无机物（氰化物、锰离子、铁离子、硫化物、亚硝酸盐氮、氨氮等）和有机物（有机胺、链型不饱和化合物、芳香族化合物、木质素、腐殖质等）[8]。臭氧氧化水中污染物有2种途径：第1种途径为臭氧分子对水中污染物的直接氧化；第2种途径是臭氧分子在水中生成活性更强的羟基自由基（・OH）和活性氧自由基等中间产物，间接氧化水中污染物[9]。臭氧在水中的反应方式可分为4类，即氧化还原反应、环加成反应、亲电取代反应以及亲核反应[10]。
2.2 消毒作用机理
臭氧消毒作用主要表现在对病毒和致病菌的杀灭作用。臭氧对病毒的杀灭作用是直接破坏其细胞器、脱氧核糖核酸和核糖核酸，从而使其失去活性[11]。臭氧对致病菌的杀灭作用主要表现在以下3个方面：①臭氧作用在致病菌的细胞膜上，增加了细胞膜的通透性，使细胞内容物流失，从而使细胞失去活性；②臭氧作用于致病菌的酶系统，致使细胞失活；③臭氧破坏致病菌细胞膜内结构，使细菌活力减退，直至死亡[12-13]。
3 臭氧在水产养殖用水处理中的应用
臭氧具有很强的氧化能力，已应用于水产养殖水处理中。研究表明，用臭氧处理养殖用水，能有效抑制鱼类、虾蟹类、贝类等水生动物养殖中的病原微生物，去除有害细菌、有机废物、氧化亚硝酸盐氮以及氨态氮[14-16]。
臧维玲等[17]利用ZXY-30型臭氧发生器（产量为30 g/h）处理凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）苗种用水，处理水量20 t/h。结果表明：经臭氧处理1 h后，亚硝酸盐氮由初始0.031 mg/L下降到0.010 mg/L，去除率为68%；细菌总数从8 450个/mL下降到3 700个/mL，灭菌率为56%。鲁春雨等[18]将臭氧应用于凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）虾苗养殖中，试验用虾苗体长0.8～1.0 cm，采用的臭氧发生器额定功率为50 W，臭氧产生量为3 g/h。结果表明：经臭氧处理后的养殖用水，虾苗的成活率最大可提高19.2%，单产可提高 39.3%。潘 淦等[19]在罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）工厂化育苗中使用JY-100型水产专用臭氧系统，结果表明，每天6：00―6：20和18：00―18：20投加浓度为0.1 mg/L的臭氧处理育苗水体，罗氏沼虾仔虾的出苗率可达69%，比常规养殖每隔3 d投放1 mg/L抗菌素类药物组的出苗率提高34%，且苗体健壮，抗病、抗逆、抗应激能力强。Schroeder等[20]用臭氧处理南美白对虾（Litopenaeus vannamei）幼苗用水，臭氧剂量为250 mg/h，结果表明：对初始浓度为1.45 mg/L亚硝酸盐氮的去除率近100%，灭菌率约为99%。Park等[21]用臭氧剂量为20 g/（kg饲料・d）和40 g/（kg饲料・d）处理黑鲷（Acant-hopagrus schlegeli）养殖用水，研究表明：使细菌失活的有效臭氧浓度为0.1～0.2 mg/L。Summerfelt等[22]用臭氧处理虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）循环养殖系统中的循环水，投加臭氧的剂量为25 g/（kg饲料・d），使水中总悬浮固体从初始的6.3 mg/L降到4.0 mg/L，降低了36.5%；化学需氧量从初始的43.6 mg/L降到26.1 mg/L，降低了40.1%；溶解性有机碳从初始的7.1 mg/L降到6.3 mg/L，降低了11.3%；亚硝酸盐氮从初始的0.265 mg/L降到0.05 mg/L，降低了81.1%。宋奔奔等[23]用臭氧处理大菱鲆（Scophthalmus maximus）养殖用水，臭氧发生器日运行3 h，每日添加臭氧量约500 g，约为10 g/（kg饲料・d），大菱鲆放养规格为每尾334 g，每个池平均放养3 000尾，放养密度约为16 kg/m2。研究结果表明：养殖池中总悬浮物及氨氮去除率分别为59%和18%。陈 萍等[24]使用臭氧处理大菱鲆（Scophthalmus maximus）养殖用水，采用的臭氧发生器产量为80 g/h，投加量为10～15 g/kg饲料，接触时间为2.0～2.5 min，处理水量150 m3/h。研究结果表明：臭氧对整个养殖系统中细菌的灭除率可达51.8%，对亚硝酸盐氮的去除率为56.3%。杨 凤等[25]利用0.417 mg/（h・L）的臭氧发生器对皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai Ino）的养殖用水进行处理。结果表明：臭氧对化学需氧量的去除率为31.3%，但对亚硝酸盐氮的去除率仅为34.3%。
4 臭氧在水a养殖水处理应用中存在的问题和发展趋势
4.1 存在的问题
虽然臭氧对养殖用水处理的效果较好，但水中残余臭氧会对水生生物产生一定的毒性作用[26]。已有研究结果表明，臭氧对大马哈鱼（Oncorhynchus keta）的安全浓度为0.002 mg/L[27]。Wedemeyer等[28]报道虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）接触0.009 3 mg/L臭氧时，会造成鱼鳃上皮细胞损害。刘 淇等[29-30]研究表明，0.18 mg/L臭氧会对中国对虾（Penaees chinensis）无节幼体产生毒性。吴小军等[31]对臭氧在淡水鱼类养殖中的毒性研究表明：鱼类在臭氧浓度≥1.0 mg/L，且接触时间为3 h后，开始出现鳃部充血、肿胀、呼吸频率加快等反常现象，48 h半数致死浓度为0.13 mg/L。Bullock等[32]研究表明，对于一般鱼类，水中臭氧浓度应低于0.060 mg/L才是安全的。Ballagh等[33]进行臭氧对南极石首鱼（Argyrosomus japonicus）胚胎发育及卵孵化率的影响试验，研究表明：水中臭氧浓度与水的接触时间乘积应低于1，当该值超过5时对南极石首鱼卵的毒性影响显著。Schroeder等[34]对臭氧消毒副产物（OPO）对太平洋白虾（Litopenaeus vannamei）幼苗的生长状况进行研究，结果表明：太平洋白虾幼虾长期暴露于0.10、0.15 mg/L OPO浓度下会诱导软壳综合征的发生率提高，幼虾存活的安全OPO浓度为0.06 mg/L。张延青等[35]用臭氧化海水培育小球藻，研究表明：OPO质量浓度小于0.735 mg/L时，对小球藻不产生毒害作用，但当OPO质量浓度大于1.036 mg/L时，小球藻大量死亡。
除了水中残留臭氧会对水生动物产生毒害作用外，影响臭氧在水产养殖水处理中使用的因素还包括：①臭氧对水产养殖用水中常见的毒性较强的氨氮的去除速率较慢，去除效果不理想[36]；②当臭氧处理海水时，可将海水中的溴离子氧化成亚溴酸盐、溴酸盐、三溴甲烷和一些溴化有机消毒副产物[37-39]，这些臭氧消毒副产物可能会威胁到水产品食用安全。
4.2 发展趋势
由于在水产养殖用水处理中单独使用臭氧存在一定缺点，因而可将臭氧与其他水处理技术耦合（如O3/H2O2、O3/活性炭、O3/紫外等），形成新的基于臭氧的水产养殖水处理技术。石枫华等[40]研究表明，O3/H2O2对硝基苯的降解速率明显高于臭氧单独处理。潘志忠等[41]利用臭氧-紫外线组合系统净化靓巴非蛤（Paphia schnellian）用水中的微生物，处理效果优于臭氧或紫外单独处理。郭恩彦等[42]对水产养殖循环水深度处理的研究表明，臭氧/生物活性炭对总有机碳和高锰酸盐指数的最终去除率比生物活性炭单独去除率分别高11.9%和13.4%。王 艳等[43]用O3、UV及O3/UV 3种方法净化毛蚶（Area subcrenata lischke）养殖水质，研究表明：O3/UV灭菌效率是O3和UV单独灭菌效率的4倍，8 h后使粪大肠杆菌数由4×105个/100 g贝肉降低到7×103个/100 g贝肉，30 h后降低至2.5×102个/100 g贝肉，杀菌率达到99.93%。管崇武等[44]研究表明：O3/UV对养殖水中总有机碳和色度的去除率相比单独使用臭氧分别提高89.77%和51.44%，杀菌率可达97%以上。
臭氧耦合技术的协同效应可以促使水中臭氧快速分解产生氧化性更强的・OH，・OH对水中无机污染物和有机污染物的氧化能力均高于臭氧，且・OH在水中寿命极短，不会产生二次污染。因此，臭氧技术与其他已有的或新开发的水处理技术联用是未来臭氧技术发展的方向，臭氧耦合技术的工艺流程、设备构建和具体应用将是目前水产养殖用水处理技术的研究热点。
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水产养殖弧菌的处理范文第4篇
微生物制剂是从天然环境中筛选出来的微生物菌体，经培养繁殖后可制成含有大量有益菌的活菌制剂。微生物制剂能有效控制和改善养殖水体微生态环境的水质，维持生态平衡，提高水产动物的免疫能力，抑制病原菌的繁殖，从而减少疾病的发生，提高养殖产品的成活率。目前在水产品养殖中应用广泛的有益微生物群种类很多，主要包括光合细菌、芽胞杆菌、乳酸菌和酵母菌等。温世喜等通过在水产养殖池塘中加入微生物制剂，降低了养殖鱼类发生病害的几率，鱼的成活率高，进而由于水质好，吃食旺盛，产量也高，增产增效效果明显。微生物制剂应用于泥鳅的高密度养殖中也取得非常显著的效果，能促进泥鳅快速生长，提高泥鳅的养殖密度。
2生物技术在水产品加工中的应用
2．1水产品的组织降解在水产品加工中，常规的机械法去皮、脱鳞和脱卵膜等加工过程非常费时，有时还会对水产品的肌肉组织和营养成分造成损害。生物技术，特别是酶技术用于去皮、脱鳞、脱卵膜中，其反应温和，不需使用强机械力和强酸强碱，可以更好地保存水产组织的原有性状。海洋水产品如贝类、鱼类等都可以用酶法替代传统的机械法和化学法脱除皮等不需要的组织，从而减少对肌肉组织的伤害，提高产品收率。用于水产品去皮的酶主要包括蛋白质水解酶、糖苷酶和脂肪水解酶等。Gildberg等研究发现，利用鱼消化道酶在pH4．0条件下能够很好地去除毛鳞鱼皮。利用来源于鱿鱼内脏的鱿鱼肝酶可用来脱除鱿鱼皮，方法简单，成本低，且保持了鱿鱼肌肉原有的性状。鱼制品加工中，去鳞是一个非常费时的过程，且存在去鳞不完全、肌肉组织受损等问题。挪威学者通过酶液浸泡鱼体，使鱼鳞与外表皮连接松弛，然后用水即可冲去鳞片。利用该工艺每小时可加工1300kg黑线鳕，而处理1t黑线鳕只需要60g鳞酶。此项工艺不仅可以降低劳动强度，而且也降低了成本，具备良好的应用前景。
2．2水产品脱腥、脱苦、去异味水产品腥味的成分较复杂，有胺类、挥发性酸、烯醛等十多类物质，这些腥气特征化合物的前体物质主要是碱性氨基酸。脱除腥味的方法有很多，包括物理法、化学法和生物法，其中生物法是指利用微生物或酶催化腥味物质代谢转变成无腥味无害的物质，从而达到去除腥味的效果。相比于物理法，生物法去腥更彻底，且不会对肌肉组织造成损害;相比于化学法则无需添加额外的化学物质，产品更安全。陈奇等比较了液体烟薰料腌制脱腥法、紫苏混合液腌制脱腥法、粉末活性碳脱腥法、有机红茶脱腥法和酵母发酵脱腥法对淡水鲢鱼和干海鱼仔的脱腥效果，结果发现酵母发酵对海鱼仔脱腥效果最理想。金晶等采用发酵法对淡水鱼鱼糜进行脱腥，发现脱腥效果显著，由此加工制成的鱼糜制品经鉴定品质良好。很多蛋白质在水解之后会形成由疏水性氨基酸组成的苦味肽，从而呈现出苦味。苦味的强弱与水解率、蛋白酶种类有关。使用脲酶可以降解鲨鱼等鱼肉中大量存在的尿素，从而祛除异味。利用风味蛋白酶对鳕鱼蛋白水解产物进行脱苦，在水解温度55℃、酶的添加量3%、pH5．5条件下，能获得苦味低和鲜味高的脱苦产物。
2．3生产水产品蛋白和功能性食品成分随着科技和社会的进步，人们生活水平不断提高，低值水产品直接食用的价值越来越低，人们更趋向于食用水溶性好、低脂、高蛋白的水产品水解蛋白。故应用生物技术，特别是酶技术生产各种浓缩水解蛋白是水产品综合利用的一条新途径，具有广阔的市场前景。王长云等采用蛋白酶水解法从鳕鱼加工废弃物鳕鱼碎肉中提取制备的水解蛋白粉无苦味，有海鲜味，是优良的蛋白质制品。袁晓晴等则用碱性蛋白酶水解鳙鱼鱼肉蛋白，获得了高回收率的水解蛋白，其酶解物的氨基酸组成与鳙鱼鱼肉蛋白的氨基酸组成差别不大，很好地保持了鱼肉蛋白的特定氨基酸成分。用蛋白酶水解鱿鱼头、皮、鳍后制得的鱿鱼蛋白粉含有丰富的牛磺酸、维生素和锌等成分，可直接食用，也可作为强化食品的原料。利用酶技术生产生物活性物质或功能性食品成分是水产品加工中又一重要部分。Je等用鲭鱼肠道酶水解青鳕鱼片加工废弃物，经过分离纯化后可获得抗氧化肽。抗氧化肽对羟基自由基有很好的清除能力，具有延长食品保质期和延缓衰老的功效。林丽云等采用木瓜蛋白酶水解制备波纹巴非蛤活性肽复合物，同样具有较强的抗氧化活性。ω-3不饱和脂肪酸，尤其是EPA和DHA，不仅是人体必需的营养成分，而且在防治心血管疾病、抗癌、抗炎症和健脑等方面也有功效。利用各种专一性强的脂肪水解酶处理水产品，可以起到富集EPA和DHA的作用。例如，利用专一性解脂假丝酵母脂肪酶对鱼油进行处理，可以使EPA和DHA的含量由原来的30%左右富集到47．9%左右。用1，3位专一性脂酶，水解沙丁鱼油，可使得其EPA和DHA含量由原来的29%提高到44．5%。
2．4制备海鲜风味调味品随着时代的发展，人们对生活品质的要求越来越高，传统的调味品已满足不了人们的要求。海鲜风味调味品，不仅含有氨基酸、有机酸等呈味成分，还含有牛磺酸、活性肽和不饱和脂肪酸等营养保健成分，既鲜美又营养，越来越受到人们的喜爱。与传统强酸强碱分解法相比，应用蛋白酶酶解各种水产品获得海鲜风味调味品的方法既高效又温和，对营养成分破坏性小。选择碱性蛋白酶和中性蛋白酶对青鳞鱼下脚料进行酶解，经适当调配可制得风味浓郁的鱼露。以虾皮为主要原料，经米曲霉发酵可生产调味虾酱，其氨基酸含量高，酱色鲜艳，口感好，酱香味和虾鲜味浓郁。Imm等应用复合风味蛋白酶对红海鳕鱼肉进行酶解，酶解产物中包括谷氨酸、精氨酸等风味氨基酸的含量是未经酶解鱼肉中的6～9倍。
3生物技术在水产品保鲜中的应用
水产品因肉质鲜美，风味独特，且富含不饱和氨基酸、活性肽和牛磺酸等营养保健成分而备受消费者青睐。水产品的鲜度是其主要的品质指标，是决定其价格的主要因素，再加上水产品本身容易腐烂变质，故水产品的保鲜是水产品开发过程中非常重要的一个环节，直接影响着其经济效益。目前，应用于水产品的保鲜技术主要有低温保鲜、化学保鲜、气体保鲜、辐射保鲜和生物保鲜等。生物保鲜是近几十年来食品保鲜领域的新技术，引起了人们极大的关注，具有广阔的应用前景。生物保鲜主要包括微生物保鲜和酶法保鲜，主要涉及乳酸菌和假单胞菌等微生物种类，及溶菌酶、葡萄糖氧化酶、谷氨酰胺转氨酶和脂肪酶等酶类。
乳酸菌产生的乳酸菌素是一种高效、无毒的生物保鲜剂，能抑制许多引起食品腐败变质的细菌的生长和繁殖。另外，乳酸菌的代谢产物如乳酸、脂肪酸等可降低食物的pH，也可以抑制许多微生物的生长。用乳酸菌素处理虾肉糜后，细菌的生长繁殖得到有效抑制，保质期由2d延长至5～6d，且对虾肉糜的感官品质无明显影响。然而，乳酸菌素一般只能抑制革兰氏阳性菌的生长，对革兰氏阴性菌的抑制效果不理想。因此，为了起到全面的抑菌效果，乳酸菌一般配合EDTA或柠檬酸盐等螯合剂使用，对水产品进行协同保鲜。溶菌酶是一类多糖水解酶，能水解细菌细胞壁肽聚糖的β-1，4糖苷键，导致细菌自溶死亡，对没有细胞壁的人体细胞无不利影响。溶菌酶广泛存于鸟类、家禽的蛋清和哺乳动物的眼泪、唾液、血液、鼻涕、尿液、乳汁及组织细胞中。溶菌酶对多种微生物有很好的抑菌甚至致死作用，且对人体无害，故在食品保藏中得到广泛的应用。利用溶菌酶对食品，包括水产品进行保鲜，只需在食品上面直接喷洒一定浓度的溶菌酶溶液即可起到防腐保鲜作用。Hikima等研究发现，来源于日本囊对虾的溶菌酶对多种弧菌及鱼类病原菌具有有效的杀菌作用。蓝蔚青等用溶菌酶保鲜液浸泡带鱼，然后置于4℃下贮藏，结果发现其贮藏时间、感官品质、微生物指标等均明显优于未经溶菌酶液处理的对照组。为了得到更好的保鲜效果，往往将溶菌酶与其他酶类或者保鲜技术联合使用。如利用溶菌酶联合EDTA对新鲜鳕鱼片进行浸渍保鲜，可有效抑制李斯特菌和其他腐败菌的生长繁殖，延长保鲜期。联合溶菌酶与乳酸菌素对蛏肉进行处理，保鲜效果更好，冷藏保鲜期明显延长。
葡萄糖氧化酶能在有氧条件下将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，不仅能除氧，防止水产品的氧化变质，还能降低水产品表面的pH，抑制细菌的生长，故其被广泛应用于水产品保鲜中。利用葡萄糖氧化酶对虾类进行防褐变保鲜处理，相比于常用抗氧化剂和防腐剂，虾在长时间的冷藏(4℃、120h)和冷冻(－18℃、12个月)后具有更高的鲜度。其他应用于水产品保鲜中的酶主要有谷氨酰胺转胺酶和脂肪酶等。利用谷氨酰胺转胺酶处理鱼肉蛋白后，会生成可食性的薄膜，可直接用于水产品的保藏。赵前程等以果胶为原料，通过酶解法制备出果胶酶解物，并用于鲜活大菱鲆鱼肉的保鲜的研究，结果发现果胶降解物具有明显的保鲜效果。
4展望
水产养殖弧菌的处理范文第5篇
关键词：PMA-LAMP法；沙门氏菌（Salmonella）；克氏螯虾（Cambarus Clarkii）
中图分类号：TS207.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5854-04
湖北省是小龙虾（克氏螯虾，Cambarus clarkii）养殖大省，小龙虾养殖业快速发展的同时也引发了食源性病原微生物污染的食品安全问题。2010年7月份以来，南京陆续收治因食用克氏螯虾而入院的病人，经检查诊断为横纹肌溶解综合征（哈夫病）。螯虾体内的药物残留、重金属及携带的病原微生物都可能成为哈夫病的致病因素。克氏螯虾养殖主要分布于低湖田、水稻田、池塘、沟渠等地区，受生长环境的影响，克氏螯虾体内可能寄生多种病原微生物，在养殖、运输、销售等诸多环节均有可能产生安全隐患，但是这些过程食品安全隐患很难被发现，只有进入餐饮环节后，安全问题才得以突显。因此在小龙虾养殖业中建立快速监测病原微生物的方法及制定标准化的养殖体系迫在眉睫。
沙门氏菌（salmonella）是最常见的食源性病原微生物，可引起人畜胃肠炎、伤寒和副伤寒等症[1，2]。人畜感染后可呈无症带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾，它可加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。传统的沙门氏菌检测方法，由于其检测周期长、程序复杂等缺点已不能满足现代检测要求，因此研究沙门氏菌快速、有效的检测方法显得尤其重要[3-5]。常规检测采用传统培养方法，致病菌需要独立的检测方法单独进行检测，工作量大，检测周期长，且受到检测人员的专业、经验等多种因素限制，容易出现误判[6，7]。随着分子生物学方法在食品微生物检测中的逐步应用，致病菌的检测效率也逐步提升。聚合酶链式反应（PCR）技术不断应用于病原微生物的快速检测。但PCR技术在现场快速检测适用性上具有一定的局限性。环介导等温扩增技术（PMA-LAMP）由Nagamine等[8]于2000年建立，该技术通过针对靶基因的6个区域而设计4种特异引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下（60～65 ℃）高效扩增目标DNA。该方法具有检测快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、适用于现场检测。与PCR反应相比，PMA-LAMP反应最明显的优势是不需要高精密的仪器设备，同时检测灵敏度和特异性又能满足快速鉴定病原微生物的需要[6]。
1 材料与方法
1.1 标准菌株
鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、大肠埃希氏菌ATCC25922、福氏志贺菌CMCC6120513、金黄色葡萄球菌CMCC26003、单核细胞增生李斯特菌CMCC（B）54002-5、创伤弧菌ATCC27562均购自广东省微生物研究所。
1.2 试剂及培养基
食品中沙门氏菌PMA-LAMP快速检测试剂盒（湖北泰扬生物工程有限公司）；叠氮溴化丙锭（Biotium公司）；DNA Marker、Taq酶购于北京天根生物有限公司；二甲亚砜（Sigma公司）；缓冲蛋白胨水、亚硒酸盐胱氨酸增菌液、四硫磺酸盐煌绿增菌液、亚硫酸铋琼脂、HE琼脂、三糖铁琼脂、营养肉汤和营养琼脂均购自北京陆桥技术有限公司。
1.3 仪器
电热恒温水浴锅（金坛新航仪器有限公司）；S1000型PCR扩增仪、Gel Doc EQ凝胶成像系统（Bio-Rad公司）；高速离心机（Sigma公司）；电泳仪（北京六一厂）；全自动高压灭菌锅（日本三洋公司）。
1.4 样品的制备和选择性增菌
依据 GB/T4789.4-2008《食品微生物学检验沙门氏菌检验》方法进行样品制备和选择性增菌。
1.4.1 国家标准方法 依据GB/T 4789.4-2008《食品微生物学检验沙门氏菌检验》进行菌株的分离和生化鉴定试验。
1.4.2 PCR检测方法 根据GenBank公布的沙门氏菌invA基因序列，应用Primer 5设计特异性引物。上游引物为GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG
CAA；下游引物为TCATCGCACCGTCAAAGGAACC。
20 μL的扩增体系包括：2 μL反应液，1 μL DNA模板，上下游引物各1 μL （0.2 μmol/L），2 μL dNTP mixture，1 μL Taq酶，1 μL 25 mmol/L MgSO4，11 μL去离子水。PCR 反应体系：94 ℃预变性5 min，30个循环，每个循环94 ℃（30 s）、56 ℃（30 s）、72 ℃（30 s）， 72 ℃（10 min）。扩增产物在2 %琼脂糖凝胶上100 V电泳分离60 min，加样量为5 μL/上样孔。
1.4.3 叠氮溴化丙锭处理 用20%二甲基亚砜配制40 mmol/L的PMA溶液，-20 ℃避光保存。将PMA（40 mmol/L）依次加入装有0.5 mL沙门氏菌活菌菌悬液离心管中，充分混匀后，将离心管于暗室中放置15 min。然后将离心管开盖放置冰上，距卤钨灯（500 W）约15 cm，曝光时间为5 min。
1.4.4 沙门氏菌DNA模板制备 将过夜培养的沙门氏菌菌悬液（2×109 CFU/mL）置于离心管中，依次稀释为2×109、2×108、2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×10 CFU/mL的菌悬液，经过叠氮溴化丙锭处理后，在100 ℃沸水中煮沸5 min，8 000 r/min离心2 min，取上清液作为DNA模板备用。
1.4.5 PMA-LAMP检测方法 根据GenBank公布的沙门氏菌invA基因序列，应用Primer Explorer 4设计特异引物。引物序列如表1所示，引物由上海生工合成。PMA-LAMP反应体系（25 μL）如下：依次加入10×Thermopol反应缓冲液2.5 μL，Bst聚合酶1 μL，引物，dNTP，模板和去离子水。引物FIP和BIP终浓度为1.8 μmol/L；引物F3和B3终浓度为0.2 μmol/L；引物LF和LB终浓度为1.0 μmol/L。在62 ℃水浴中反应60 min，在85℃水浴中温浴5 min使酶失活。扩增产物在2%琼脂糖凝胶上120 V电泳分离60 min，加样量为5 μL/上样孔。
1.5 PMA-LAMP检测方法的特异性
分别将4株沙门氏菌和其他5株非沙门氏菌（依次为大肠埃希氏菌ATCC25922、福氏志贺菌CMCC6120513、金黄色葡萄球菌CMCC26003、单核细胞增生李斯特菌CMCC（B）54002-5、创伤弧菌ATCC27562）接种到增菌培养基上，于（36±1） ℃，300 r/min 摇床培养16 h，离心后将菌体依次用无菌生理盐水稀释至2×104 CFU/mL菌悬液，按照“1.4.5”的方法进行检测。
1.6 人工污染食品中沙门氏菌检测
1.6.1 不同浓度菌液的制备 挑取沙门氏菌标准菌株ATCC14028至营养肉汤中增菌，于（36±1） ℃，300 r/min 摇床培养16～18 h，用生理盐水制成菌悬液，依次再用无菌生理盐水10倍梯度稀释至2×107、2×106、2×105、2×104 CFU/mL。
1.6.2 人工污染样的制备 将检测无沙门氏菌污染的克氏螯虾样品按GB/T 4789.4-2008方法制成1∶10 稀释液。吸取制备好的 2×106、2×105、2×104、2×103 CFU/mL菌悬液依次加入每组1∶10 稀释液中，混匀，菌悬液浓度依次为2×105、2×104、2×103、2×102 CFU/mL，于（36±1）℃培养12～16 h后分别按照国家标准方法、PCR检测方法及PMA-LAMP检测方法进行检测。
2 结果与分析
2.1 沙门氏菌PCR和PMA-LAMP检测方法检测结果
将鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028按照2×109、2×108、2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×10 CFU/mL依次稀释，通过煮沸法提取鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 DNA，将其用于PMA-LAMP反应和PCR反应，当反应体系中存在鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 DNA时，PMA-LAMP检测方法扩增反应会产生大量的、大小不等的DNA重复序列，凝胶上呈现典型的梯型电泳条带。检测结果如图1所示。由图1可知，PCR检测鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的检出限为2×103 CFU/mL，而PMA-LAMP检测鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的检出限为2×10 CFU/mL。
2.2 PMA-LAMP检测方法的特异性
4株沙门氏菌均呈阳性反应，其他5株非沙门氏菌（为大肠埃希氏菌ATCC25922、福氏志贺菌CMCC6120513、金黄色葡萄球菌CMCC26003、单核细胞增生李斯特菌CMCC（B）54002-5、创伤弧菌ATCC27562均为阴性（图2）。由图2可知，按照方法“1.4.3”的扩增体系，62 ℃温育45 min，4株沙门氏菌在凝胶上呈现典型的梯型电泳条带，5株非沙门氏菌均为阴性，去离子水作为阴性对照，通过琼脂糖凝胶电泳无扩增条带。
2.3 人工污染克氏螯虾样品中沙门氏菌检测结果
将检测无沙门氏菌污染的克氏螯虾样品按GB/T 4789.4-2008方法制备样品，菌悬液浓度依次为2×105、2×104、2×103、2×102 CFU/mL，于（36±1）℃培养18～24 h后分别按照国家标准方法、PCR检测方法及PMA-LAMP检测方法进行检测（表2）。由表2可知，国家标准方法与PMA-LAMP检测方法的检测结果一致。PCR检测方法的最低检出限高于国家标准方法和PMA-LAMP检测方法。
2.4 克氏螯虾样品的检测结果
采集60份市售的克氏螯虾样品，PMA-LAMP 检测方法检出6例沙门氏菌，阳性率为10%；PCR检测方法检出4例沙门氏菌，阳性率为6.7%；国家标准方法检出4例沙门氏菌，阳性率为6.7%。PMA-LAMP检测方法与国家标准方法的阳性率差异不显著性，并且比国家标准方法的检出限低。
3 结论
湖北省是水产养殖大省，近年来湖北省大力发展克氏螯虾养殖，其年平均产值达20亿元以上。克氏螯虾养殖主要集中在水稻田、池塘、沟渠等地，受养殖环境的影响，克氏螯虾体内可能会寄生多种病原微生物，由此容易引发食源性病原微生物问题。因此在养殖环节建立食源性病原微生物监测体系，对食源性病原微生物做到早检测早预防。目前LAMP技术已被应用于食源性病原微生物的快速检测，与传统的快速检测方法相比较，PMA-LAMP检测方法具有检测快速、操作简便、灵敏度高、特异性强、成本较低、不需要精密仪器的优点，特别适合现场快速检测的需求。本研究建立了快速检测克氏螯虾沙门氏菌PMA-LAMP检测技术，应用PMA-LAMP检测方法检测克氏螯虾样品中沙门氏菌，与国家标准检测方法比对，两种方法检测结果相同，可为食品安全快速检测提供一种新的思路，PMA-LAMP检测方法具有快速、灵敏度高、操作简便等优点，并能检测鉴定沙门氏菌病原活细胞[6，9]。
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