反向遗传学研究方法

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反向遗传学研究方法范文第1篇

精神发育迟滞(mental retardation’MR)又称为智力低下，按临床体征可分为非特异性精神发育迟滞(non-specific mental retardation’NSMR)和智力低下伴发畸形两类。NSMR是指患者只是单纯性智力低下，不伴有临床上其它畸形。目前国外主要采用反向遗传学的方法来探讨NSMR的发病机理，但仅对非特异性X连锁智力低下进行过分析［1-3］，国内许多学者从NSMR的患病程度进行分析［4，5］，认为NSMR具有广泛的遗传异质性，但患病程度(重度、中度和轻度)是根据测定智商(IQ)的得分而进行分类的。由于测定IQ的标准不同，环境条件的不同，很难进行准确地分型。因此，我们从父母婚配型的角度探讨NSMR的遗传方式，不仅为探讨NSMR的发病机理提供理论依据，而且为临床诊断和临床遗传咨询提供理论参考。

1　对象和方法

1.1　对象　根据1985年WHO对MR的定义说明及临床诊断标准，研究对象是出生以后无其他诱因的MR病例，排除各种体征畸形，而仅是单纯性的智力低下。

1.2　方法

1.2.1　调查方法　分初筛和复查两步进行。(1)初筛：经过统一培训的乡村医生或妇幼保健人员对其所在村或街道按户口逐户查访，填写初筛表。(2)复查：经过专门培训的各科医生组成综合调查组，检查每个初筛患者，绘出系谱。必要时做辅助检查，明确诊断。

1.2.2　遗传分析　根据患者父母婚配型将调查的家系分为3种类型：U×U型(父母双方表型均正常)，U×A型(父母中有一方是患者)，A×A型(父母双方均是患者)；其中U×U多发家庭是指同胞中有两个或更多的患者。

1.2.3　分析方法　(1)分离分析：采用Morton［6］介绍的不完全确认条件下的分离分析模型进行假设检验及最大似然值估计。采用山东医科大学遗传教研室编制的计算机程序，在微机上操作运算。(2)Finney法［7］：对完全确认各种婚配型(U×A，A×A)子代进行分离比估计，同时将不完全确认条件下的U×A与完全确认条件下的U×A型进行比较，u检验。(3)遗传率计算：采用Falconer法估计多基因遗传的遗传率。

2　结果

2.1　分离分析　对157个NSMR的家系通过不完全确认获得232个核心家系，共计患者271例，其中男性142例，女性129例，男女之比为1.10∶1，χ2检验，P＞0.05，男女之间差异无显著性。

2.1.1　确认概率(π)值估计　根据NSMR的患者(r)和先证者(a)的分布(表1)，计算确认概率π=0.895。

2.1.2　不同婚配型分离比(p)估计　根据NSMR各婚配型的同胞数(s)及患者数(r)的分布(表2)，在IBM计算机中用分离分析程序进行分析，结果见表3。其中A×A婚配型家系较少，不作分析。

2.2　完全确认资料的分离比估计　用完全确认法获得75个NSMR核心家系，共有患者79例，其中男性42例，女性37例，男女之比为1.14∶1，χ2检验，P＞0.05，男女间差异无显著性。根据完全确认条件下NSMR的同胞数(s)及患者数(r)的分布(表4)，当π=1时，用Finney法计算出U×A婚配型的分离比p=0.3348。

2.3　遗传率　按Falconer法计算NSMR的一级亲属和二级亲属的遗传率分别为89.4%±4.4%，73.6±10.95%，加权法得平均遗传率 87.2%±4.1%。

3　讨论

3.1　U×U婚配型

3.1.1　分离分析结果(表3)表明，U×U多发家庭，当p=0.25时，χ2P=2.2628’接受常染色体隐性遗传；U×U总体婚配型，设p=0.25’x=0.54时，χ2P=0.2645’χ2X=0’接受常染色体隐性遗传，并有散发病例存在，但p、x的最大似然估计值是p=0.19，x=0.46，此时分离比偏低，可能是由于有较多的散发病例存在，同时可能存在有多基因的主基因效应。

3.1.2　多基因遗传分析　一般认为人的智能属多基因控制的数量性状，智商70以下的即为精神发育迟滞(MR)，人群中大约有1.5%智力低下是由变异的极端型造成的，即由基因组合不良所致，又称为极端变异型，也就是说智能属于多基因遗传。由于NSMR的一级、二级亲属的遗传率分别为89.4%±4.4%、73.4%±10.95%，平均遗传率为87.2%±4.1%。表明NSMR的U×U婚配型可能又符合多基因遗传。

综上所述，U×U婚配型的NSMR既有常染色体隐性遗传，又有多基因的主基因效应，其遗传率的分析与许多研究结果基本一致［8，9］。

3.2　U×A婚配型

3.2.1　分4离分析　在不完全确认条件下(表3)，U×A婚配型，设p=0.50’x=0时’χ2p=8.0627，χ2p=21.2785，不接受分离比p=0.50的假设，但最大似然估计值p=0.32，x=0’χ2P=0.0683’χ2X=0.6006，接受常染色体显性遗传，不完全外显，外显率为64%，无散发病例。

3.2.2　完全确认条件下，利用Finney法计算NSMR的U×A婚配型的最佳分离比为p=0.3348’支持常染色体显性遗传、不完全外显，外显率为0.6696。

反向遗传学研究方法范文第2篇

关键词：仙台病毒 ；细胞融合；选修三

中图分类号：G672 文献标识码：B 文章编号：1672-1578（2016）01-0232-01

动物细胞融合是高中生物选修三细胞工程中的重要内容，是学生学习单克隆抗体技术及其他动物细胞工程的的基础，即细胞杂交，是二十世纪五十年代细胞学中出现的一种新技术。细胞融合由广义而言， 就是两个或两个以上细胞合并形成一个细胞的过程，从狭义来讲是在离体的条件下， 用人工的方法把两个或两个以上的细胞合并。使体细胞杂交而形成一个新的杂种细胞。这就是我们通常所指的细胞融合。细胞融合的方法有两种：一、自发融合，即两个细胞紧靠在一起，不经任何诱导剂处理， 能相互融合。二、诱导融合，即两个细胞虽靠在一起， 但必须要经过诱导剂的处理才能融合。60年代初， 病毒融合技术逐渐兴起。作为重要的病毒诱导剂，课本对仙台病毒的介绍比较少，本文从仙台病毒的结构，作用机理，研究方向等方面做以具体阐释，以期帮助老师和同学更好的认识仙台病毒，更好的理解细胞融合的过程。

1.仙台病毒作为细胞融合诱导剂的发现历程

1958 年， 日本的冈田善雄（Okada） 用副粘病毒中的日本血球凝集病毒（HVJ）诱导动物细胞融合， 取得良好效果。这以后， 许多学者用紫外线灭活的诱导人的KB细胞和小鼠的Ehrlich腹水癌细胞、人的Hela细胞和摇蚊的体细胞、人的体细胞与小白鼠的体细胞进行融合， 都获得成功。实验证明，HVJ病毒可以将任何两个远缘物种的体细胞诱导融合在一起。HVJ病毒也称为副流感病毒一号。它是日本仙台东北大学医学院N.I.石田和他的同事首次从小鼠体内分离出来的， 所以称为仙台病毒[1]。其后，Harris和Klein等在Okada 工作的基础上， 进一步用灭活仙台病毒诱导杂种细胞融合， 并获得成功[2][3]。此外， 疙疹、麻疹、流感等十余种病毒也相继用于细胞融合。由于仙台病毒诱导细胞融合法较简便， 特别是许多种类的细胞对其敏感， 所以， 常选用仙台病毒作为细胞融合的诱导剂。

2.仙台病毒的结构

仙台病毒为什么能有效地诱导动物细胞融合呢？这还得从它的结构谈起。仙台病毒是副粘病毒科家族的一员，是一个具有细胞融合活性的有包膜病毒。仙台病毒的核衣壳由15kb的负链基因组RNA和病毒的核衣壳（NP）蛋白、磷（P）蛋白和大（L）蛋白组成.包围着核衣壳的是病毒的包膜，基质（M）蛋白排列在膜的内表面，2个跨膜糖蛋白一血凝素神经氨酸酶（HN）蛋白和融合（F）蛋白则在包膜外表面形成突起.仙台病毒包膜表面的这两个糖蛋白和宿主细胞膜相互作用从而启动病毒感染过程[4]。仙台病毒诱导细胞融合的能力与其质膜表面两种糖蛋白有关，一种是F蛋白，它具有膜融合作用。F蛋白可以介导病毒一细胞融合或细胞一细胞融合，具有溶血活性。另一种是HN蛋白，能使病毒吸附在细胞膜表面，具有凝集素的作用。HN蛋白具有血凝素和神经氨酸酶活性，血凝活性可使病毒和细胞表面含唾液酸的受体结合，使病毒吸附到细胞表面。HN蛋白还具有神经氨酸酶活性，使细胞表面的受体失活，使病毒从细胞表面脱落[5]。

3.仙台病毒诱导细胞融合的机制

通过电镜照片证明，病毒颗粒嵌入在相邻细胞的细胞膜之间或埋入许多细胞表面的微绒毛内。故有的认为， 病毒颗粒本身可能起着一种粘合剂的作用， 它把两个相接触的细胞膜有力地粘着在一起Okada还认为， 病毒使细胞膜产生一些断裂，当两个细胞表面上的这些断裂接合时它们就触合在一起。Okada和Yamada认为细胞融合的过程是一种需要能的反应，细胞膜的穿通， 周边连接部的修复， 都需ATP[6]。在37℃ 时， 病毒与细胞膜发生反应， 细胞膜被破坏， 此时需要Ca2+和Mg2+。最适pH为8.0 -8.2。

目前多数认为：当两个细胞的表面紧密接触时， 病毒能使细胞膜断破。使两个细胞的细胞质经过破口， 互相接触，通道扩大，逐步造成细胞的融合[7]。

4.仙台病毒诱导细胞融合的步骤

使用仙台病毒诱导细胞融合的方法，大致可分为四步， 即将亲本细胞分别制成悬液， 混合离心而后将沉积细胞悬于1mL灭活的仙台病毒悬液，置冰浴间歇摇动20分钟， 使细胞凝集，再将温度上升到37℃， 间歇摇动30分钟， 使其进行融合最后洗去病毒， 即可将融合物悬浮于选择性培养基进行培养若亲本细胞是单层生长的贴壁细胞， 则可将病毒直接加入两亲本细胞的混合培养物中且其融合也比悬浮细胞容易培养。使用仙台病毒的优点是各种动物细胞都适宜， 但它不稳定， 制备繁琐， 且在保存过程中活让会下降[8]。

5.仙台病毒研究进展

20世纪90年代以后，随着分子生物学技术的完善，特别是反向遗传学技术的应用在仙台病毒基因结构与功能，膜融合的分子机制及重组疫苗等方面的研究得到不断的深入。目前对仙台病毒HN蛋白的研究主要集中在HN蛋白与F蛋白的相互作用以及HN蛋白在膜融合中的作用[9]。

参考文献：

[1] 李鸿昌.细胞杂交与病毒.生物学通报，1983，2：22-23.

[2] Harris.H， Klein.G Nature 1969 224-1315

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[5] 吉村哲郎.生化学，1985，57：127

[6] Okada，y；Exptl Cell Res.1962，26：98

[7] 方之平，孙 深.细胞融合技术。华中农学院学报，1983，2（2）： 94-95

反向遗传学研究方法范文第3篇

关键词　禽流感；疫苗；研究进展

最近，亚洲一些国家不断暴发的禽流感（Avian influenza，AI）事件引起了人们对全球一系列动物和公众健康问题的极大关注，最近的联合国粮农组织（FAO）罗马提交会议指出[1]，当面临AI大流行威胁时，采取大规模扑杀感染动物的措施会丧失很大一部分食物来源，使地方养禽业遭受严重打击，显得不太合理。对禽流感的预防，必须努力集中在采取严格的生物安全措施的同时，加强必要的免疫措施。免疫能减轻临床症状，降低死亡率，减少病毒的扩散和提高群体对感染的抵抗力，从而控制禽流感病毒（Avian influenza vinus，AIV）的广泛传播[2]。然而，如果疫苗的使用和管理不当，不仅达不到预期的效果，还会污染环境，威胁公众健康。因此，研制安全、高效的AIV疫苗是专家们为之不懈努力的目标。

理想的疫苗应具有高的生物保护容量，同时消除环境污染和易感动物感染的可能性。总的来说，对于AIV疫苗的发展，以下几种设计思路均已被采用或尝试。

1全病毒灭活疫苗

由于AIV基因组的抗原漂移，AIV疫苗仅能提供70%的保护力。针对这种特点，AIV灭活疫苗通常制备成针对几种不同亚型AIV的多价疫苗，己证明1种灭活疫苗可以至少包括4种不同的AIV亚型。同只含单一亚型的疫苗比，多价疫苗并没有减弱对同一种HA亚型AIV攻击的有效保护[3]，而且各亚型抗原之间不产生免疫干扰。AIV灭活疫苗能使免疫鸡群在感染AIV野毒时有效地减轻损失，并显著减少可能存在于鸡群和环境中的病毒数量，缩短其存活时间，是AI防治的主动措施、关键环节和最后防线。而且灭活疫苗具有制备工艺简单、免疫效果确实、免疫持续期长等特点，许多国家已将其作为商品化的AIV疫苗应用于家禽中。我国己研制成功不同亚型的AIV疫苗，且证明具有良好的免疫保护作用。但灭活苗本身存在一些缺陷[4]，主要是：影响疫情监测；存在散播病毒的风险；免疫剂量较大，制备成本高。其最突出的缺点是不能诱导产生有效的粘膜免疫抗体和细胞免疫应答，因而无法有效地抑制呼吸道中AIV的复制。近年来，人们试图从技术上突破此缺点，筛选并利用同亚型弱毒疫苗株代替高致病性毒株制备灭活苗，是灭活苗研制中的努力方向之一。例如用2种不同的病毒同时感染鸡胚可导致片段间的重排而有可能产生所期望的疫苗株，这些疫苗种子株获得了抗原相关毒株相应的HA和NA基因，和A/Puerto Rico/8/34（H1N1）中的6个基因片段[5]。这些PR/8/34的片段赋予病毒弱毒所以能在鸡胚中迅速生长，适合作为灭活疫苗的生产。

2基因工程亚单位疫苗

亚单位疫苗是提取AIV具有免疫原性的抗原蛋白，加入佐剂而制成。这种疫苗安全性好，能刺激机体产生足够的免疫力，只是抗体持续时间短，且成本高。谢快乐等曾用台湾AIV分离株（H8N4）的HA和NP制备了复合亚单位疫苗，同时制备了灭活的油佐剂疫苗。当以疫苗诱生的HI抗体作为评价标准时，发现2种疫苗的差别不明显，只是在加强免疫后，亚单位疫苗的HI抗体水平的升高比油佐剂疫苗明显[6]。随着基因工程技术的不断发展，将免疫原性基因导入表达载体，经诱导可获得大量表达的免疫原性蛋白，提取所表达的特定多肽，加入佐剂即制成基因工程亚单位疫苗，这样可大大降低疫苗的成本。Kodihalli等研制了火鸡H5N2病毒NP/HA和ISCOM的复合亚单位疫苗，用其免疫火鸡，21d可产生较高的抗体滴度，并且T、B淋巴细胞被激活，可以对同源和异源（H6N1）亚型病毒的攻击产生保护作用，在攻毒后3d，可清除火鸡肺部和泄殖腔的病毒[7]。另外，将AIV的基因插入杆状病毒表达载体，利用重组病毒在昆虫细胞中表达的AIV蛋白来制备AIV的亚单位疫苗也已研究成功。Crawford等利用杆状病毒表达系统生产H5、H7亚型AIV的重组HA佐剂疫苗，免疫3周龄白色Rock鸡，用同亚型HPAIV攻击，结果重组HA佐剂疫苗组所有的鸡只均不发病，而未免疫组鸡只全部死亡，且经H5亚型病毒的重组亚单位疫苗免疫过的鸡攻毒后都不排毒[8]。

基因工程亚单位疫苗产生的抗体不针对病毒的内部蛋白，因此不会干扰AIV的血清学调查，而且其不存在毒力返强、散毒和环境污染的问题，是安全性很好的疫苗。重组杆状病毒表达的HA亚单位疫苗在禽类表现出良好的免疫原性，免疫后只诱导HA特异性抗体应答，不影响疫情监测，显示出了一定的应用前景。

3重组活载体疫苗

鸡痘病毒作为禽用疫苗病毒载体，具有外源基因容量大、可对表达的外源蛋白进行正确加工修饰、严格的宿主特异性和生物安全性等优点[9-11]，利用对禽类致病性很弱的痘苗病毒或禽痘病毒作载体，构建含有免疫原性基因的重组病毒，用此重组病毒作疫苗，可在动物体内复制，并不断地表达出免疫原性蛋白，从而诱导禽类产生针对目标病原的免疫保护力。Webster（1995）和Swaynes（1997）先后构建了含A/Ty/Ire/1378/83（H5N8）HA基因的禽痘病毒重组疫苗，用其免疫仔鸡，用在墨西哥分离的致死性强毒H5N2攻击，试验结果证明该苗可对H5N2提供0%～100%的保护[12]；冀德君、刘红旗等应用表达H9亚型 AIV HA的重组鸡痘病毒疫苗及其传代后第20、30代疫苗免疫5日龄无特定病原（SPF）鸡群，攻毒后第5天各免疫组排毒的鸡数与对照组相比显著减少[13]；程坚等用表达H9亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒在7日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡上进行的免疫效力试验亦表明，重组鸡痘疫苗能显著抑制静脉攻毒后免疫鸡从泄殖腔的排毒，效果与AIV全病毒灭活苗相当[14]。贾立军用构建的表达H5N1 HA的重组鸡痘疫苗免疫SPF鸡和无母源抗体的商品鸡，免疫鸡可抵抗H5N1亚型HPAIV的致死性攻击，诱导95%～100%的免疫保护[15]。陈平用构建的高效表达H9亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒颈部皮下免疫1日龄SPF鸡，攻毒后试验结果表明，rFPV-Ps-HA明显抑制了病毒的排出[16]。以上试验均表明，携带AIV HA基因的重组鸡痘疫苗具有良好的效果。

同灭活苗相比，携带HA基因的重组活载体疫苗不仅可提供相当的保护效果，而且具有一些独特的优点：安全性高；可通过刺种和皮下注射接种途径进行免疫，使用方便；免疫应激小；用量少，不需添加佐剂，成本大大降低；而且抗体持续时间长，效果好，用其免疫家禽，既可刺激宿主产生体液免疫，又能刺激宿主产生细胞免疫[17]。基因重组的鸡痘疫苗的最大优点是不干扰血清学调查，因此该重组疫苗适用于监测野毒感染[4]。

4DNA疫苗

Ulmer等[18]报道了小鼠肌肉注射含有编码甲型流感病毒白（NP）的重组质粒后，不仅产生抗NP的特异性IgG抗体，而且诱导CTL反应，可有效地保护小鼠抗不同亚型分离时间相隔34a的流感病毒的攻击。Pertmer发现，流感病毒NP基因的核酸疫苗激活机体的免疫反应不受母源抗体的干扰[19]。同样，在有母源抗体存在的情况下，HA和NP基因均能有效激活细胞免疫应答反应。我国研制的H7亚型HA基因DNA疫苗，在极小的使用剂量下即可成功诱导免疫保护反应，并有效阻断同源MPAIV在机体内的感染和排毒 [20]。大量的动物试验都说明在合适的条件下，DNA接种后既能产生细胞免疫又能产生体液免疫[21-24]，于是，DNA疫苗技术应运而生，并逐渐显示出它作为第3代疫苗的优越性。与传统疫苗相比DNA疫苗有许多优点：能长时间表达抗原；具有与天然抗原相同的构象和免疫原性，可同时激发机体产生细胞免疫、体液免疫和粘膜免疫应答，而且不受母源抗体的干扰；结构简单，制备方便；稳定性好，易于保存和运输；能够克服由于免疫系统发育不完善而导致的免疫力低下的缺陷；可用于制备多价疫苗或联苗。

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目前，对于DNA疫苗存在着安全方面的考虑：质粒DNA低水平整合到宿主基因组的潜在危险性；DNA疫苗载体携带的抗生素基因可能导致的生物学后果；产生针对双链DNA的抗体；引起免疫耐受。针对上述四种潜在的危害性，美国FDA、WHO及EU都对DNA疫苗的研制制定了一些指导性规定，为DNA疫苗的研究、生产及应用指明了方向。由于DNA疫苗代价相对较高，且不适于集约化养殖的群体免疫，因此可考虑改进DNA疫苗生产工艺和优化疫苗接种方式来开发出价格低廉、实用化的DNA疫苗。其中应用减毒胞内菌运送DNA疫苗的途径取得了一些令人振奋的结果。已经有了一些比较好的减毒沙门氏菌菌株作为禽类DNA疫苗的运送载体的研究报道，张小荣等以减毒沙门氏菌运送H5亚型AIV DNA疫苗的生物学特性研究表明，该疫苗具有良好的安全性和免疫原性，能同时激发细胞免疫、体液免疫和粘膜免疫应答[25]，这类疫苗仍在探讨中，需对这类疫苗进行进一步优化，才能最终筛选出真正适合临床应用的疫苗。

5RNA复制子疫苗

随着DNA疫苗的深入研究，人们担心DNA会整合到宿主细胞基因组上，造成致癌隐患。此外，DNA通过核膜较为困难，限制了其作用的发挥，在一定程度上阻碍了DNA疫苗的推广应用。于是，人们又设想用RNA替代DNA作基因疫苗，近年来开发的RNA复制子载体应运而生。该RNA复制子可以不依赖于宿主细胞而自主复制，包含病毒基因组5’和3’末端的顺式作用元件、全部非结构蛋白基因编码区（包括复制酶编码基因），而结构蛋白基因被缺失，由外源基因取代，这种重组病毒粒子可以很容易地携带达3kb的外源RNA，并且感染的细胞谱较广，包括非分裂细胞[26]。Vignuzzi等[27]将A型流感病毒A/PR/8/34（ma）株的NP基因插入塞姆利基森林病毒（SFV）载体上构建RNA疫苗，7～8周龄的C57BL/6老鼠肌肉注射10μg SFV RNA，3～4周后再加强1次，共免疫3次。第3次免疫后1～3周，由鼻腔攻入100pfu的A/PR/8/34（ma）病毒。试验结果不仅有较高的中和抗体出现，而且诱导了有效的CTL反应，试验小鼠能有效清除肺部的病毒。大量的研究证实DNA/RNA复制子比常规DNA疫苗的免疫原性好[28]，可以产生更强的抗体应答和更多的CTL前体，而且使用比常规DNA疫苗免疫剂量低100倍的复制子疫苗就可以产生与常规DNA疫苗相当的免疫效力。可见，RNA复制子载体的特点包括：复制效率高，用量远远低于常规DNA疫苗；可同时诱导抗体应答和CTL应答；安全性好，RNA复制子在胞浆内复制，避免了核的参与，不存在整合进宿主基因组的可能性；RNA复制子导致转染细胞的溶解，避免了有自主复制能力的病毒的产生；复制子系统能自主复制，可针对多种病原进行连续免疫，而不受己有载体病毒抗体的干扰。

6冷适应流感弱毒疫苗

用野毒株感染鸡胚在较低温度下（25～30℃）培养，连续传代后可较快的使病毒的致病力减弱，从而获得冷适应流感弱毒病毒供体。通过在表达靶HA和NA的野生型病毒和病毒供体如A/Ann Arbor/6/60（H2N2）之间的基因重排可以获得减毒的冷适应性病毒株，病毒的这些特征与多基因的突变有关。滴鼻免疫减毒的冷适应性的流感活疫苗，能引起全身和局部粘膜的免疫反应，显示出保护效力[29]。这些活的减毒病毒显示出高水平的表型和基因稳定性，不会转变成接近的相关血清学阴性毒株。已经获得H5N1 和H9N2/Ann供体的重组冷适应性病毒。这些病毒不会对哺乳动物和鸡致病[30]。虽然现在流行的肌注禽流感疫苗能够有效地诱导相关病毒特异的血清血凝抑制IgG抗体，他们却不能刺激鼻腔产生分泌型IgA抗体[31]。因为分泌型IgA能与异源型的流感毒株交叉反应，活的减毒的禽流感疫苗能够广泛地提供针对抗原变异株的交叉保护，一旦新的流感毒株流行时它将非常有用[32，33]。美国对冷适应流感弱毒疫苗的研制己有30多年的历史，但由于担心其安全性，至今仍未被批准使用。俄罗斯是目前全球唯一人流感冷适应流感弱毒疫苗获准使用的国家，该疫苗己在数亿儿童中使用，证实能提供良好的保护，并无不良反应。到目前为止，无论俄罗斯还是全球，没有流感病毒扩散的迹象[34，35]，但活的AIV疫苗病毒仍有与人类共感染毒株发生基因重组，或毒力返强，造成新的流感毒株出现的可能，对其大面积的推广使用，还需在生物安全性方面加以时间上的验证。

7复制缺陷型流感病毒疫苗

用反向遗传系统可获得减毒的AIV，在流感流行时对疫苗的供给可能会起很关键的作用。病毒的HA和NA基因被克隆并插入到质粒中，通过去除HA的多个碱性氨基酸裂解位点序列使其减毒，插入了HA和NA的质粒与携带A/PR8/34病毒内部基因的质粒共转染细胞系产生相应的非致病性疫苗株。采用该方法产生的疫苗不仅能产生保护性抗体，而且能诱导很强的细胞免疫，是另一个很有发展前途的活疫苗。此疫苗能够在几个星期内获得，从而能应付紧急流感大流行事件来临时疫苗的需求。Watanable等[36]利用反向遗传学从cDNA获得NS2蛋白缺失的病毒粒子，用其感染细胞时，能在细胞内表达病毒蛋白但不能形成有感染力的病毒粒子，用此方法制成的疫苗能保护离最后1次免疫3个月后的老鼠接受10或100 LD50的攻击（9只老鼠存活8只）。其它获得复制缺陷型流感病毒疫苗的途径是使M2基因缺失[37]。此缺失疫苗在组织培养物中生长良好，但在老鼠体内有限生长，因此是一潜在的活疫苗候选。虽然重组减毒的H5病毒在小鼠中只具有限的神经毒力，但其符合理想模式的疫苗设计特点――不会致死鸡胚、减弱的毒力、对模型动物具有易感性，已经开始运用于生产，不过在疫苗生产技术被采用之前仍有一些规章，安全性以及合法性问题需要考虑和克服。在生产人用疫苗时用于转染的哺乳动物细胞系（如vero细胞）的质量必须符合标准。用反向遗传系统产生的病毒可能被认为是“基因改良的有机体”，因此各个国家强加了一些地方和民众的安全性法则限制其研究和发展，而且高科技的反向遗传技术的使用权被保留，需要经过许可才能采用此方法生产商业化疫苗。

8表位疫苗

根据病毒的抗原表位来研制表位疫苗，尤其是为易变异的病毒疫苗的研制提供了方向。Levi等[38]将流感病毒的3个表位：B细胞表位HA91-108、CTL表位NP147-158、Th细胞表位NP55-69分别插入沙门氏菌的鞭毛蛋白基因中构建了3个真核表达质粒，鼻腔免疫小鼠。3种质粒混合免疫组可以诱导长期的免疫应答，并且可以完全抵抗病毒的致死性攻击。Thomson等[39]以1个真核表达质粒投递了10个CTL抗原表位，其中包括NP基因的3个表位：NP50-58、NP147-155、NP366-374和NS1基因的1个表位NS1152-160，免疫鼠后通过Cr51释放试验，检测这些表位显示该质粒诱导了强的CTL应答，并且可以清除感染的病毒。

表位疫苗不仅提供了一种更有效地利用病原体中各个抗原成分的方法，而且对于流感病毒这种高度变异的病毒来说，一方面可以通过选择具有交叉保护性的表位来达到预防多个毒株的目的，另一方面可以通过对流行毒株的监测来及时合成表位，实现对变异毒株的控制。

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9转基因植物疫苗

宋等利用转基因马铃薯表达AIV HA蛋白[40]。利用电击穿孔转化法，将含有AIV HA基因的表达质粒pHAO（其中含35S启动子和来源于大豆植物存储蛋白基因的vspB终止末端，另有抗性标记）导入农杆菌EHA105，转化细菌再感染马铃薯的幼茎外植体，转化植株再生和温室栽培。Westernblot分析表明，83%的转化植株在其马铃薯块茎组织中表达了重组HA，表达量占总蛋白量的0.03%～0.04%。结果显示，用转基因马铃薯生产口服AIV疫苗是有前景的。

10参考文献

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