游白水
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游白水范文第1篇
今天，我带着满怀的好心情，和妈妈一起去白水寨游玩。
我们还未进入景区内，就已见到一条“白纱”从天而降，不愧是“飞流直下三千尺，疑是银河落九天”啊！进入景区后，我看到了有9999级台阶的登山步梯天南第一梯；长达两公里的海船木栈道；也有山道边急剧而下的双龙汇；还有能近距离观赏瀑布的亲瀑台……我和妈妈最喜欢的是双龙汇。从山顶流下的瀑布遇到山涧巨石，化作两条洁白的蛟龙盘旋而下，汇合成一池碧绿，美不胜收。
在看了一个多小时的风景后，我和妈妈便开始爬石阶了。我们走走停停，终于爬到了2999级，我大口大口地呼吸着空气中的负离子，恨不得全部吞到肚子里去。本来我们还想接着爬，但因为时间关系只好打道回府了。
白水寨里虽是风景优美，但也有美中不足的地方。像石阶边上，绝大部分都没有扶手和围栏，而旁边就是百丈悬崖；除了验票口，整个白水寨里面没见一个工作人员，只见无数沿路叫卖的小贩，这不但破坏了白水寨优美的环境和游人的心情，还十分危险。要是发生了什么意外，可怎么办呀！
游白水范文第2篇
鸳鸯溪为白岩溪中的一段溪流，长约14公里，溪流平缓，有直余个形状各异、水碧镜的深潭，供鸳鸯栖息戏水；溪岸各色野果累累，可供鸳鸯觅食，而山林中栖息着娄百只猕猴，当鸳鸯的天敌——老鹰出现时，群猴即嗷嗷嘶叫，提醒鸳鸯飞避密林岩洞或潜入水中，成为鸳鸯天然的“卫士”。因此，这种特殊的自然环境，成为鸳鸯栖息的乐园。第年秋季有娄百上千只鸳鸯从北方飞平这里越冬，是我国目前唯一的鸳鸯鸟自然保护区。
鸳鸯溪的主要游览景点有白水洋、鸳鸯溪、叉溪、水竹洋、考溪、鸳鸯湖等，其中景具特色的是白水洋和鸳鸯溪。白水洋一带林木葱郁，环境清幽，溪中三块巨石平铺水底，最在的块面积竟达4万平方米。水漫其石，仅深寸余，溪水清悠，波光潋滟，一片白炽，故称“白水洋”，亦称“水上广场”或“十里水街”。鸳鸯溪两岸峰峦叠嶂，古木参天，奇花异草，遍布山野。碧水潭中戏水的五彩鸳鸯，密林中嬉戏跳跃的猕猴，给这幽静的溪谷增添盎然微微生机，是一外奇绝的大自然旅游观赏点。鸳鸯溪一带还有一处为“漈水成烟”的百丈漈水帘洞，洞深穴秘，瀑帘挂壁，为全国五大水帘洞之首，其景色之奇丽，令人啧啧赞叹。
鸳鸯溪国家级风景名胜区位于屏南县东北部，距县城30公里，处屏南、周宁、政和三县交界。总面积78.8平方公里。是我国目前唯一的鸳鸯鸟保护区。
鸳鸯鸟属国家二类保护动物，是人们喜爱的观赏水鸟。鸳鸯溪长14公里，附近山深林密，幽静而清净，是鸳鸯栖息的好地方。每年秋季有数百上千只鸳鸯从北方飞来越冬，使这一带溪流早在一百多年前就发现鸳鸯，故屏南有“鸳鸯之乡”之美誉。
鸳鸯溪共分白水洋、鸳鸯溪、叉溪、水竹洋──考溪、鸳鸯湖等5个游览区。
白水洋游览区在鸳鸯溪上游，为鸳鸯溪四大景观之一，除溪流两岸的大小飞瀑和岩洞之外，最使人称绝的为“十里水街”，它是由三块平坦的巨石铺于水底而成，最大的一块达4万平方米。人行其上，水恰淹脚背，波光潋滟，一片白炽，故称“白水洋”。白水洋平坦宽敞，上面可骑自行车，可驾驶汽车。下游有一条50多米长的天然滑道，赤身下滑不伤肌肤，被称为“天然冲浪游泳池”。
鸳鸯溪游览区，该游览区为鸳鸯溪的中心景区，它以野生动物鸳鸯、猕猴和稀有植物为特色，融溪、瀑、峰、岩、洞、潭、雾等山水景观为一体，成为不可多得的综合性游览区。其中最有特色的是“百丈祭水濂洞”，它已列为全国五大水濂洞之首。清代宜洋武举张朝升称之为“祭水成烟”，它的特点是落差大、瀑面宽、水量足且不枯竭，并可进洞仰看水濂。
*厦门火烧屿导游词 ·日光岩导游词 ·武夷山龙川大峡谷导游词 ·永定土楼导游词-
叉溪游览区位于鸳鸯溪下游，它以数千亩原始次森林为主，辅以丰富多彩的河谷景观，主要景点是可与“百丈祭水濂洞”相媲美的“百丈祭”。
水竹洋──考溪游览区位于叉溪游览区西面，它以险峰、幽谷和黄山松为主要特色。
游白水范文第3篇
黄果树瀑布景点游览顺序依次是黄果树大瀑布、陡坡塘瀑布、天星桥景区。
黄果树瀑布，即黄果树大瀑布。古称白水河瀑布，亦名"黄葛墅"瀑布或"黄桷树"瀑布，因本地广泛分布着"黄葛榕"而得名。位于中国贵州省安顺市镇宁布依族苗族自治县，属珠江水系西江干流南盘江支流北盘江支流打帮河的支流可布河下游白水河段水系，为黄果树瀑布群中规模最大的一级瀑布，是世界著名大瀑布之一。以水势浩大著称。瀑布高度为77、8米，其中主瀑高67米；瀑布宽101米，其中主瀑顶宽83、3米。黄果树瀑布属喀斯特地貌中的侵蚀裂典型瀑布
（来源：文章屋网 ）
游白水范文第4篇
还未到，老远就已经感受到白水寨号称全国落差最大的瀑布的磅礴气势。来到山脚下，有天然大麻石彻成的拥有9999级号称天南第一梯的石阶梯，由山脚下蜒蜿而上，直通山顶。我们沿着阶梯拾级而上，这9999级石阶梯就像一条大蟒蛇，盘山延绵而上，时而经过巨大无比的山石旁，时而经过青绿的草地。我们沿着古朴厚实的海船木栈道登山游览，瀑布奔流而下，置身林荫蔽日的天然大峡谷内，可以感受潺潺流水带来的清凉气息。走累了，掬把山水洗把脸，清爽的感觉顿时扩散全身，疲惫一洗而空。在亲水平台上巨幅瀑布轰鸣而下，水花飞扬，瞬间湿润全身，周身清凉。在此省内景区负离子含量最高之地，恣意呼吸混和着清凉水汽和丰富负离子的空气，暑热在不知不觉中便消散了。定神再看：白水寨山植被茂密，让人犹如置身浓荫覆盖的天然氧吧，再加上山中气温比城市足足低5℃，非常舒适宜人，果然是个避暑的好去处。
在高处眺眼远观四周：青山环抱，烟霞缭绕、恬淡静美。再往山脚下俯望：在山水乐园玩漂漂船的游客激起水花朵朵，玩得不亦悦乎，在天然山水中尽情享受舒心清凉。累了就泛“舟”水面随水漂浮，感受碧波荡漾、微风轻拂。再高处仰望披挂在青山的纯美飞瀑，在亲近山水中，平日的学习压力尽消，此时此该尽情放松身心。
身边壮观的瀑布震耳欲聋的奔流而下，水花扑面而来非常清凉。终于上到山顶，山上有个大储水湖。充沛的雨量令白水仙瀑踏入“丰水期”，更显磅礴壮观。从山上远望：白水绿道林幽蝉鸣、竹林凝翠，骑游其中令人神清气爽。从白水寨出发骑行绿道，河岸风光景色醉人，美不胜收。远眺田野农庄间小牛哞哞，尽得郊野乡间的悠然。
游白水范文第5篇
林皋镇北依方山森林公园万亩绿海，南傍林皋湖景区一汪碧水，境内还有国家级保护文物前赵主刘曜父之墓永垣陵，属关中百镇之一，陕西省重点镇，今年8月又被确定为陕西旅游名镇，是白水倾力打造的县城副中心，小城镇建设的重中之重。
如今，这个小镇已从单一的苹果产业发展为旅游、苹果、设施大棚多业并举的明星镇，农民人均纯收入也已从2007年小城建建设之前的2062元增加到2012年底的7950元。
文化特色镇区建设是林皋实施最早的工程。他们起步的大手笔就是投资2600万元，完成了1公里富林大道和1.1公里秀水路建设。林皋还投资1.1亿元建设了白水首家乡镇农民居住区——润林苑小区，预计可安置500余户进镇落户农民。
在新区建设欣欣向荣的同时，林皋的老镇改造也进行的如火如荼。人在镇中，镇在景中。居住在镇上的人们最能感知建设带来的改变，并充分享受着这种改变带来的实惠。
相对于文化特色镇区的建设，白水对核心景区林皋湖的提升完善更花费心思。
林皋湖位于镇区西南1公里处，是一个由灌溉为主的水库衍生而成的旅游景点。围绕这一方湖水，白水计划总投资5.9亿元，规划建设80平方公里的林皋湖休闲观光产业园。并制定了“近三、远三”的中长期开发规划。“近三”即开发林皋湖景区、农业产业园区和休闲镇区；“远三”开发林皋休闲度假区、云台山、方山森林公园，把林皋和相邻的云台山风景区、方山森林公园连接起来，形成三位一体的旅游环线，拉大景区框架。
2013年初，林皋湖休闲度假区正式从规划转入建设阶段。此前林皋湖入口处只有六、七米的普通公路，东挨山峁西接深沟，狭窄而危险。进入景区，只能坐船才能到达对岸，游湖仅有乘船一种方式。湖岸深处的春花秋色只能自开自谢，无法上岸游览。
核心景区提升工程启动后，首先对景区入口进行改造，原来狭窄山道变成了开阔缓坡，双向六车道宽30米长1公里的入口大道直通湖岸。之后开建的环湖公路，结束了沿湖几个村庄隔水观望无路可通的局面。景区品位大提升的同时，给湖边焦段河村的村民焦天社也来了新的增收渠道。
焦段河的四十多户村民就住在林皋湖边，因为没有出村的公路，村民们的苹果、玉米运不出去，好果子只能卖个差价钱。今年开始修建环湖路，村民的摩托车直通镇上，还有几户新购卖了汽车。今年修路时自己给工队打工扫路，多挣了六七千元。
游白水范文第6篇
关键词：清热解毒扶正颗粒；内毒素血症；NF-κB p65蛋白
中图分类号：R2855文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）05-0016-05
[WT5HZ][JZ]Effects of Qingre Jiedu Fuzheng Granule on NF-κBp65 Protein in Lung-Kidney[JZ]Tissue of Endotoxin Rats
[WT5BZ][JZ]WAN Qi-nan， WEI Gen-heng， LI Qian-yun， QI Yan， TONG Xiao-yun， CHEN Wei
[WT5"BX][JZ]（Yunnan Hospital， Kunming of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650021， Yinnan）
[WT5HZ]【Abstract】[WTBZ]Objective： To study the effect of Qingre Jiedu Fuzheng Granule on NF-κBp65 protein in lung-kidney tissue of endotoxin rats. Methods： 72 rats were randomly divided into a normal control group， a model control group， a methylprednisolone group and low， medium and high dose groups of traditional Chinese medicine. Rat endotoxemia models were established by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide method. The normal group and the model control group were given intragastric administration of 1 mL/100g of normal saline once daily. The methylprednisolone group was administrated 1.17 mg/100g of methylprednisolone once daily. The low， medium and high dose groups were administrated 1 mL/100 g of Qingre Jiedu Fuzheng Granule once daily. After the experiments were finished， the expression of NF-κBp65 protein in lung and kidney tissue of the rats was detected by Western blotting. Results： The level of NF-κBp65 protein in the model control group was significantly higher than that in the normal control group. The NF-κBp65 protein level in the lung and kidney of endotoxin rats of the high dose group and the methylprednisolone group decreased and there was no statistic difference between the two groups. The level of NF-κBp65 protein in the low dose group and the middle dose group decreased poorly， but compared with that of the high dose group and the methylprednisolone group， there was statistical difference. Conclusion： Qingre Jiedu Fuzheng Granule can inhibit the expression of NF-κBp65 protein in the lung and kidney of endotoxin rats， reduce the inflammatory reaction of endotoxemia and has certain curative effect on endotoxin.
[WTHZ]【Key words】[WTBZ]Qingrejiedu Fuzheng Granule， endotoxemia， NF-κB p65 protein
内毒素血症（ETM）是指循环血中出现可检出的内毒素的病症。内毒素血症发生原因主要是在严重创伤、感染等应激状态下全身的网状内皮系统功能障碍，免疫机能下降，诱导内毒素血症及全身免疫反应的发生，导致机体组织、细胞的损伤[1][2]。内毒素血症诱导的大量炎性介质失控性释放所致的全身炎性反应综合征（SIRS），以及进一步恶化发展成为的多脏器功能失常综合征（MODS）是严重感染患者走向死亡的主要途径，而该恶性进展的关键启动因子为内毒素及其诱导的失控性释放的大量炎性介质。脂多糖（LPS）是常用的诱导内毒素血症的毒素。在脂多糖诱导的炎症反应信号传导通路中，Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）信号通路的激活与多种致炎介质释放密切相关[3]。NF-κB位于TLR下游信号通路的枢纽位置，它是一种普遍存在的转录因子，主要由P65和P50两个亚基组成，在常态下，NF-κB存在于细胞的胞质内，与其抑制因子IκB结合。作为多种信号转导途径的汇聚点，不仅参与介导了免疫应答、病毒复制、细胞凋亡和增殖的多种基因的表达调控，而且在调节炎症反应的基因中起关键作用[4-5]。当细胞受到内毒素、肿瘤坏死因子，白细胞介素等炎性分子刺激后，将信号转导入细胞内，最终引起NF-κB的活化，并诱导TNF-α、IL-1β、诱导型一氧化氮合酶（induced NO synthase，iNO）、趋化因子如IL-8、巨噬细胞趋化因子（MDF）及趋化因子受体等多种炎性分子的转录、表达，反馈激活NF-κB，加剧了组织的损伤[6-7]。
内毒素血症与中医学“热毒”、“温病”、“瘟疫”等病症相类似，中医药对此类病症有一定的疗效，名老中医临床经验方清热解毒扶正颗粒具有清热解毒、凉血化瘀、益气养阴的功效，对此类病症有一定的效果。研究表明，清热解毒扶正颗粒有明显抑制炎性肿胀作用；明显降低内毒素所致家兔的高热；降低内毒素致高热家兔的C-反应蛋白水平。临床研究表明，清热解毒扶正颗粒能明显降低老年肺炎患者升高的体液免疫指标；降低升高的血白细胞、血清降钙素原、C反应蛋白水平，有显著的抗感染作用。能降低慢性阻塞性肺疾病患者的二氧化碳分压，提高其氧分压，ν飧懈呷取⒎窝住⒙性阻塞性肺疾病等具有较好的疗效[8-12]。现从TLR信号通路研究清热解毒扶正颗粒对NF-κB p65的影响，探讨如下。
1材料和方法
11材料
111实验动物选择合格清洁型Wistar大鼠（合格证号：SCXK{川}2013-24，001643）72只，体重（200±20）g。
112主要实验仪器及试剂脂多糖（LPS，Sigma公司，批号：L2630），兔抗大鼠NF-κBp65抗体（sigma公司，批号L2630），数码凝胶图象处理系统（GIS-2009型号）；超低温冰箱（海尔立式BD370LT-86L-1型号）；离心机（10R，美国Thermo公司）；紫外分光光度计（UV-2450PC型号）；恒温箱（3111，美国Thermo公司）。
113实验药品清热解毒扶正颗粒：由翼首草，荷叶顶，鱼腥草，柴胡，葛根，太子参，麦冬，丹皮，薏苡仁等十四味药组成。由云南中医学院第一附属医院中药房鉴定中药制剂室制备。1 g相当于原生药126 g。低剂量组含生药为05 g/ml，中剂量组含生药为1 g/ml，高剂量组含生药为2 g/ml，甲基强的松龙（国药集团容生制药有限公司，40 mg，国药准字H20030727）。
12方法
[KG（0.15mm]121模型制备72只大鼠进行编号，依随机数字表法分为中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、正常组、模型对照组、西药组。除正常组外，其余大鼠根据文献[1]采用腹腔注射脂多糖致大鼠内毒素血症模型。具体操作方法是先每日测量大鼠体温（肛温）2次，连续2日，取2次体温的平均值记为基础体温。单次体温超过38℃或2次体温差超过05℃的大鼠剔除。实验前6 h禁食不禁水。然后腹腔注射LPS，诱导动物发热，注射LPS后每隔05 h测1次体温，连续测8 h。体温低于38℃的大鼠剔除。[KG）]
122药物治疗①正常组予生理盐水1 mL/100 g体重灌胃，每天1次；②模型对照组予生理盐水1 mL/100 g体重灌胃，每天1次；③西药组给甲基强的松龙117 mg/100 g体重灌胃，每天1次；④中药低、中、高剂量组分别给予清热解毒扶正颗粒低、中、高剂量1 mL/100 g体重灌胃，每天1次；各组连续灌胃28 d。
123实验标本处理4周后（28 d）麻醉大鼠，解剖打开大鼠腹腔，腹主动脉穿刺放血至大鼠死亡，剥离左肾脏外膜，切取左肾，解剖打开胸腔，分离肺组织器官，切取左上肺叶。肾、肺标本置无菌试管中-20℃保存在。
13Western blotting检测分别取各组肺、肾组织，用冷PBS液冲洗，在添加有蛋白酶抑制剂裂解液中匀浆，将匀浆液转至无菌聚丙烯离心管中，经超声震荡，离心提取总蛋白，分光光度计测定其浓度。分别取各样本总蛋白50 ug用聚丙烯酞胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，然后电转移法至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。室温下将PVDF膜在含有5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中封闭1h，然后加人兔抗大鼠NF-κBp65及内参对照GAPDH的抗体，4℃过夜。室温下TBST漂洗PVDF膜，加人用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗在室温下孵育1h。TBST再次漂洗PVDF膜，ECL试剂盒化学荧光法覆盖条带，全自动曝光机曝光，数码凝胶图象处理系统测定目的条带的光密度值，进行定量分析，严格按照试剂说明书操作。
14统计学方法计量资料均以均值±标准差（x[TX-*3/8]±s）表示，采用One-K-S检验进行方差齐性检验；样本方差齐性时，采用单因素方差分析进行组间比较；方差不齐者采用两个独立样本检验，数据使用SPSS190统计软件进行处理，以P
2结果
通过动物实验，结果显示，在肺、肾组织中，低剂量组与中剂量组比较，2组NF-κBp65蛋白水平无显著性差异（P>005）；低剂量组与高剂量组比较，高剂量组NF-κBp65蛋白水平显著低于低剂量组（P
3讨论
在内毒素炎症反应中，LPS激活TLR4通路目前主要有两条公认的信号途径[13]：一条是髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖的信号通路；另一条是MyD88非依赖的信号通路。IL-1R受到IL-1刺激后，启动信号途径招募的第一个衔接分子就是MyD88[14]。MyD88激酶作为IL-1R的衔接蛋白，募集下游的蛋白激酶IRAK，导致IRAK自身磷酸化；磷酸化IRAK与TRAF6结合，TRAF6活化引起两条不同的信号转导通路，一条包括P38MAPK和JNK通路在内的MAPK信号通路，另一条是NF-κB通路，NF-κB作为一种普遍存在的转录因子，经激活后，转入细胞核中诱导特定基因的表达，并激活细胞因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等促炎细胞因子的表达，从而产生大量的致炎因子如TNF-α、NO、COX-2等，引起组织炎症反应性损伤。TLR4/NF-κB通路是启动细胞内炎症信号传导的经典通路，NF-κB是细胞内生物信号传导中关键性炎症因子。阻断内毒素炎性反应信号通路的关键环节，抑制炎性因子的释放，促进炎性因子的阻嘟对内毒素炎性反应有重要的治疗作用。
[KG（0.15mm]中医药治疗内毒素血症既有直接的拮抗内毒素作用，更有其显著的增强机体免疫对内毒素的解毒功效[15]。本研究从TLR4信号通路中针对NF-κBp65炎症反应信号环节进行探讨，结果显示，脂多糖腹腔注射后，大鼠的肺肾组织NF-κBp65蛋白水平比正常组显著增高，清热解毒扶正颗粒低剂量组、中剂量组降低NF-κBp65蛋白水平较较弱，而高剂量组有效降低内毒素大鼠NF-κBp65蛋白水平，其效果与甲强龙相当，比低剂量组、中剂量组显著增强，存在量效关系。清热解毒扶正颗粒能够抑制炎症反应引起的NF-κBp65激活、转录，从而降低由于NF-κBp65激活导致的下游多种炎性因子如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-а、NO、COX-2、MDF等炎性介质激活、释放，进而降低炎症反应，减轻组织炎性损伤。复方中药疗效是多成分的效应，可多途径、多环节、多靶点地发挥作用。清热解毒扶正颗粒对内毒素血症的疗效途径包含了NF-κBp65信号通路，其效果与甲强龙相似，提示清热解毒扶正颗粒与甲强龙有类似的信号通路作用机制，至于其如何对NF-κBp65产生抑制作用，有待进一步研究。[KG）]
参考文献：
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[9]李黔云，万启南，段艳蕊自拟清热解毒扶正汤治疗慢性肺心病急性期临床观察[J].云南中医中药杂志，2014，35（12）：35-36[ZK）]
[10]万启南，陈晓华清热解毒扶正颗粒治疗老年人肺炎59例疗效观察[J].光明中医，2007，22（7）：59[ZK）]
[11]万启南，陈晓华，叶勇，等清热解毒扶正颗粒治疗外感高热症36例[J].中医研究，2007，20（7）：20[ZK）]
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游白水范文第7篇
1、梵净山于2018年10月17日被评为国家AAAAA级旅游景区，国家级自然保护区，于2008年6月30日被评为中国十大避暑名山，中国著名的弥勒菩萨道场，国际“人与生物圈保护网”（MAB）成员同时也是第42届世界遗产大会认定的世界自然遗产。2018年7月2日，中国贵州省梵净山在巴林麦纳麦举行的世界遗产大会上获准列入世界自然遗产名录。
2、百里杜鹃风景名胜区位于贵州省西北部，总面积约125.8平方公里。因天然原始林带宽1～3千米，绵延50余千米而得名，是国家级森林公园，2013年成功晋升为5A级景区。初步查明公园内有马缨杜鹃、露珠杜鹃、团花杜鹃等41个品种，囊括了世界杜鹃花5个亚属的全部。这里被誉为“世界上最大的天然花园”，享有“地球彩带、世界花园”之美誉。暮春3月下旬至5月各种杜鹃花竞相怒放，漫山遍野，千姿百态，铺山盖岭，五彩缤纷。
3、黄果树瀑布，即黄果树大瀑布。古称白水河瀑布，亦名“黄葛墅”瀑布或“黄桷树”瀑布，因本地广泛分布着“黄葛榕”而得名。位于中国贵州省安顺市镇宁布依族苗族自治县，属珠江水系西江干流南盘江支流北盘江支流打帮河的支流可布河下游白水河段水系，为黄果树瀑布群中规模最大的一级瀑布，是世界著名大瀑布之一。以水势浩大著称。
（来源：文章屋网 ）
游白水范文第8篇
[关键词] 儿童哮喘；Stomatin样蛋白2；磷脂酰肌醇3激酶；气道平滑肌细胞
[中图分类号] R562.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）06（b）-0020-05
支气管哮喘（简称“哮喘”）是儿童最常见的慢性呼吸道疾病之一。据国际儿童哮喘与变态反应研究（the International Study of Asthma and Allergies in Childhood，ISAAC）统计，全球大约已有3亿例哮喘患者，其中以发展中国家居多[1]。最近的流行学调查结果显示，我国儿童哮喘两年现患率为2.32%，累计患病率为3.02%[2]，消耗着巨大的医疗卫生资源。目前，哮喘的发病机制尚未完全清楚，经典免疫学说认为哮喘的发病机制主要与Th1/Th2功能失衡有关，但其并不能完全解释哮喘的发病。Stomatin样蛋白2（Stomatin-like Protein 2，STOML2）是Stomatin家族的一员，为线粒体内膜蛋白。研究表明，Stomatin在多种癌症中均高表达，进而调控细胞的增殖和迁移[3-4]。陈继承[5]研究发现，人工合成的糖皮质激素――地塞米松，一种治疗儿童哮喘的常用药，可上调人肺腺癌A549细胞和大鼠肺脏中Stomatin的表达，从而增强肺泡上皮细胞膜的稳定性。另一方面，T细胞STOML2的缺失会引起线粒体呼吸的改变及CD4+T细胞应答的缺失[6]，而上调STOML2可促进T细胞分化，发挥免疫调节作用并抑制凋亡[7-8]。这些研究均提示STOML2表达异常可能与哮喘的发病有关。本实验以哮喘患儿为研究对象，构建STOML2过表达载体并将其导入人气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cell，ASMC）中，研究STOML2基因表达在儿童哮喘发病中的作用及其可能的机制。
1 对象与方法
1.1 对象
选取2013年9月～2014年3月在西安市儿童医院（以下简称“我院”）呼吸科就诊的住院患儿作为哮喘组，其中男9例，女5例，年龄5～12，平均（8.2±3.5）岁，哮喘诊断符合中华医学会哮喘诊断标准[9]。选择同期在我院儿童保健科门诊进行健康体检的儿童作为对照组，其中男5例，女4例，年龄6～13，平均（8.2±3.1）岁，均无哮喘疾病家族史，1个月内无呼吸道感染及无过敏性疾病史或其他疾病史。本研究经我院医学伦理委员会批准。
1.2 实验材料
Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。ASMC购自美国Cambrex Bioscience公司。pCDNA3.1质粒、限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和T4连接酶购自美国NEB公司。大肠杆菌DH5α为我院实验室保存。兔抗人STOML2抗体和PI3Kp85抗体购自Santa Cruz公司。SYBR Premix Ex Taq Ⅱ和反转录试剂盒购自大连宝生物工程公司，MTT试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
1.3 实验方法
1.3.1 标本采集及细胞培养 清晨取研究对象的静脉血5 mL，肝素抗凝。常规分离外周血单个核细胞（PBMC），培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，待用。ASMC也培养于含10%小牛血清的RPMI 1640中。
1.3.2 STOML2真核表达载体的构建及分组 根据人STOML2基因全长mRNA序列（序列号为：NM_012999.1）设计STOML2的引物。STOML2上游引物为：5'-GTGACTCTCGACAATGTAAC-3'，下游引物为：5'-TGA-TCTCATAACGGAGGCAG-3'。并在上、下游引物的5′端分别引入EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ两个限制性酶切位点。提取ASMCs的mRNA，逆转录合成cDNA，而后PCR扩增STOML2基因。扩增条件为：95℃预变性5 min；95℃ 45 s，62℃ 45 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃延伸5 min。EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切PCR扩增产物及pCDNA3.1质粒并用T4连接酶连接片段。产物转化至DH5α细胞后，抽提重组质粒并测序鉴定。将Lipofectamine 2000和pCDNA3.1-STOML2重组质粒以2.0∶0.8（v/v）的比例混合并转染ASMCs。实验分为3组：Blank组（未做任何处理）、pCDNA3.1组（转染pCDNA3.1空质粒）及STOML2组（转染pCDNA3.1-STOML2重组质粒）。转染24 h后，提取细胞蛋白，检测STOML2的表达水平并评测转染效率。
1.3.3 RT-qPCR检测STOML2及PI3K的mRNA水平表达 Trizol试剂抽提各组细胞总RNA并用分光光度计测定RNA吸光度值（OD值），然后用反转录试剂盒反转录合成cDNA。PCR反应体系共20 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ混合液10 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，去离子水6 μL。反应条件为：94℃预变性5 min；然后94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，40 s，共35个循环；72℃，延伸5 min。根据2-ΔΔCt计算方法计算基因相对表达水平。STOML2引物参见实验方法1.3.2。PI3K上游引物为：5'-CAAAGCCGAGAACCTATTGCGAG-3'，下游引物为：5'-GTTTGAC-TTCGCCATCTACCAC-3'。
1.3.4 Western blot检测STOML2及PI3K的蛋白表达量 RIPA裂解细胞后测定蛋白浓度，随后将25 μg 蛋白经12% SDS-PAGE分离后，电转到硝酸纤维素膜上。而后，用PBS封闭液（含3%脱脂奶粉，0.1% Tween-20）对膜进行封闭（室温封闭1 h）。封闭后，加入STOML2（1∶800）、PI3Kp85（1∶500）及β-actin（1∶1000）一抗，4℃孵育过夜，随后用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2000）室温孵育2 h。用ECL发光系统检测目的条带，Image Pro Plus 6.0软件对条带进行灰度分析。
1.3.5 MTT法检测细胞生长 将对数生长期细胞以5×103个/孔接种于96孔培养板。当细胞达到80%融合时，按步骤转染pCDNA3.1-STOML2重组质粒，并于转染后72 h进行MTT实验检测。每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）后加入150 μL二甲基亚砜。然后用酶标仪测定490 nm处吸光值。
1.4 统计学方法
采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间数据比较采用ANOVA单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 哮喘患儿与正常儿童STOML2表达水平
为了检测STOML2在哮喘患儿PBMC中的表达情况，本实验分离了两组儿童的PBMC并通过RT-qPCR和Western blot方法进行了测定。RT-qPCR结果显示，哮喘患儿PBMC中STOML2-mRNA水平（0.41±0.05）显著低于对照组（0.77±0.04），Western blot结果也验证了这一现象（P < 0.05）。见图1。
2.2 STOML2过表达载体的构建
在ASMC中，与Blank组比较，转染STOML2过表达载体可显著提高STOML2的mRNA及蛋白表达水平，差异均有统计学意义（P < 0.05）。与pCDNA3.1组比较，STOML2组STOML2的mRNA及蛋白水平也显著升高，差异均有统计学意义（P < 0.05）。说明STOML2过表达载体构建成功。见表1、图2。
2.3 过表达STOML2抑制ASMC细胞增殖
为了探讨STOML2影响哮喘的机制，在体外测定了过表达STOML2对ASMC细胞增殖的影响。MTT实验结果显示，与Blank组[（95.00±1.45）%]和pCDNA3.1组[（95.17±2.69）%]比较，STOML2组[（50.13±3.11）%]细胞增殖能力显著降低，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图3。
2.4 PI3K表达水平
为了进一步探讨STOML2调控哮喘的机制，本实验从体内外水平检测了PI3K的表达。体内实验显示，与对照组[mRNA水平：（0.33±0.02）；蛋白水平：（0.43±0.03）]比较，哮喘患儿PBMC中PI3K水平[mRNA水平：（0.72±0.04）；蛋白水平：（1.03±0.12）]显著升高（P < 0.05），见图4A。细胞实验显示，与Blank组[mRNA水平：（1.00±0.05）；蛋白水平：（1.00±0.07）]比较，STOML2组PI3K水平[mRNA水平：（0.54±0.06）；蛋白水平：（0.48±0.09）]显著降低，差异均有统计学意义（P < 0.05），提示过表达STOML2可显著降低PI3K的水平与PI3K水平呈负相关，见图4B。
3 讨论
STOML2属于Stomatin样蛋白家族，是细胞呼吸链复合物正确发展的必须基因[10]，调控细胞增殖、黏着等多种功能[11]。STOML2位于染色体9p13.1上，其在多种癌症中发挥着生物学功能。Zhang等[11]发现STOML2在人食管鳞状细胞癌、肺癌、喉癌及子宫内膜癌组织中均高表达，在人食管鳞状细胞癌细胞系KYSE450中，沉默STOML2伴随着细胞生长、增殖和细胞黏着的抑制。STOML2在上皮性卵巢癌及胃腺癌细胞中高表达，且与患者的不良预后有显著相关性[12-13]。之前研究表明，地塞米松作为一种可治疗哮喘的糖皮质激素，可引起大鼠肺脏Stomatin的上调[5]，STOML2缺失也会引起T细胞应答的缺失[6-7]，提示STOML2可能与哮喘有关。本研究发现STOML2在哮喘患儿外周血PBMC中低表达，提示STOML2在哮喘发病中扮演一定的角色。
气道炎症和气道重构（如气道平滑肌层的增生和肥大及基底的增厚）是支气管哮喘的重要病理表现[14]。然而现在关于气道重构的机制尚不明确，哮喘时ASMC增生是气道重构的主要原因[3]。Johnson等[4]通过体外培养哮喘患者ASMC发现，与非哮喘患者比较，哮喘患者ASMC的增殖能力明显升高。本实验进一步构建了STOML2过表达载体并检测了其对ASMC增殖的影响。实验结果表明过表达STOML2可以抑制ASMC细胞增殖。这与Revez等[15]人的发现一致，即STOML2是一个潜在的哮喘风险基因。
越来越多的研究表明，PI3K信号通路在哮喘的病理生理过程中起着重要作用[16]，且对ASMC增殖起着正向调节的作用。Scott等[17]报道指出，在牛ASMC中，活化PI3K会增强DNA的有丝分裂，而PI3K抑制剂wortmannin可显著减少DNA合成。另一方面，研究也发现抑制调节性体细胞（regulatory T cells，Treg）中PI3K信号通路的活化有助于维持Treg细胞种群的体内平衡和免疫功能[18]。而PI3K信号可以通过参与Th1/Th2、Treg/Th17的失衡参与哮喘的发病过程[19-20]。本研究发现，STOML2负调节PI3K信号通路，即在哮喘患儿PBMC中，STOML2的低表达伴随着PI3K的升高，而在ASMC中，过表达STOML2可以显著降低PI3K的水平，这为哮喘的治疗提供了一个潜在的基因靶点。
综上所述，本研究表明STOML2在哮喘患儿外周血PBMC中低表达，并且过表达STOML2可以抑制ASMC细胞凋亡，而此过程可能与PI3K信号通路有关。因此，STOML2有望成为治疗哮喘的靶标分子。
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