白藜芦醇
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白藜芦醇范文第1篇
酿酒葡萄渣由河北和新疆提供;白藜芦醇标准品(中国药品生物制品检定所生产);甲醇为上海化学试剂有限公司生产，色谱纯;其他试剂均为市售分析纯。料处理酿酒葡萄渣在60℃的电热恒温鼓风干燥箱中烘24h，粉碎后过40目筛，置干燥器中备用。白藜芦醇的提取［13－15］精密称取30g酿酒葡萄渣原料，以80%乙醇作为提取溶剂，液料比为10mL∶1g，提取温度为60℃，共提取3次，每次提取时间为2h，第2、3次提取前各超声10min，合并3次所得滤液，在40℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干，用三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(体积比4∶4∶0．5∶0．2)溶解，置于10mL容量瓶中，定容得酿酒葡萄渣提取样品。
样品预净化处理(1)白藜芦醇的定性鉴定。白藜芦醇在365nm处显蓝紫色荧光。用薄层层析法检测，展开剂为三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(体积比4∶4∶0．5∶0．2)时，根据标准品Rf值=0．638定性鉴定白藜芦醇的存在，从而能有效控制预处理过程。点样:取活化好的硅胶GF254板，薄层板尺寸为:10cm×20cm，距薄板一端约1．5cm处，用铅笔轻轻划1条与底边平行的直线，确定各样品点样位置。然后分别用毛细管吸取白藜芦醇标准溶液、酿酒葡萄渣溶液进行点样。样点之间的距离约1cm，薄层两边距离约1cm。展开:将点样好的薄层板置于展开剂中，上行展开15cm，取出，挥干溶剂。检测:在365nm紫外灯下观察荧光斑点。(2)样品预净化处理。准确吸取0．5mL提取样品，加样于硅胶柱上(硅胶10g，硅胶柱为10mm×250mm的玻璃柱，湿法装柱)。用约35mL三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(体积比4∶4∶0．5∶0．2)洗脱，依据上述方法跟踪鉴定，收集白藜芦醇组分，浓缩至干。用甲醇溶解，置于10mL容量瓶中定容，用0．45μm滤膜过滤得样品溶液。平行处理3个样品，待HPLC测定。1．3．4白藜芦醇含量测定(1)检测波长的选择。以甲醇作为溶剂空白，在220～400nm处对白藜芦醇标准品溶液进行扫描，确定白藜芦醇的最大吸收波长。(2)HPLC色谱分析条件。色谱条件:色谱柱HypersilODS(4．6mm×250mm，5μm);流动相－甲醇－水(体积比45∶55);流速0．8mL/min;柱温35℃;检测波长:306nm;色谱工作站:ShimadzuClass－VP。(3)外标曲线的测定。准确称取白藜芦醇标准品，用甲醇－水(体积比50∶50)溶解后，置于25mL容量瓶中定容。分别从中吸取1、2、3、4、5mL用50%甲醇分别定容至10mL，用0．45μm滤膜过滤，得浓度分别为1．65、3．3、4．95、6．6、8.25μg/mL的白藜芦醇标准溶液。在上述色谱条件下进样10μL，平行测定3次，求其峰面积的平均值，计算得外标曲线。(4)酿酒葡萄渣中白藜芦醇含量测定。将“1．3．3”预净化处理过的样品进样20μL，平行测定3次，计算白藜芦醇的峰面积，根据外标曲线求出白藜芦醇的含量。
检测波长的选择白藜芦醇的紫外吸收光谱图见图1。可见最大吸收波长为306nm，与前人研究结果一致，故本研究选择306nm为检测波长。
外标曲线的确定白藜芦醇标准品的HPLC图见图2。以对照品进样量(μg)x对峰面积积分值y进行线性回归，结果表明，白藜芦醇在0．0165～0．0825μg范围内线性关系良好，其线性方程为y=7×106x－82231(r=0．9999)。
重现性试验按“1．3．4”(4)方法处理样品，平行5份，测定白藜芦醇的峰面积，其5次测定的RSD为4．8%，重现性好。
稳定性试验按“1．3．4”(4)方法处理样品，精密吸取同一样品溶液，于0、1、2、3、4、5、6、12、24h分别进样测定峰面积，RSD为1.2%(n=9)，可见样品在24h内基本稳定。
加样回收率试验加20μg白藜芦醇标准品于酿酒葡萄渣样品中，平行5份，按“1．3．4”(4)方法处理样品并进行HPLC测定，每个样品平行测定3次，求平均峰面积，根据外标曲线计算加样回收率。5次测定的白藜芦醇的回收率为94．1%、95．3%、96.7%、102．9%和105．6%，平均回收率为98．9%，RSD为5.04%(n=5)。
酿酒葡萄渣中白藜芦醇的含量测定酿酒葡萄渣预处理样品的HPLC图谱见图3。经过一步硅胶柱预处理，不仅白藜芦醇得到了富集，且白藜芦醇峰与其他杂质峰得以完全分离，无杂质峰干扰，预处理净化效果好。试验测得河北酿酒葡萄渣中白藜芦醇的含量为6．482μg/g干葡萄渣，而新疆酿酒葡萄渣中未检测到白藜芦醇。
白藜芦醇范文第2篇
【关键词】 虎杖 白藜芦醇 微波辅助提取 正交实验 紫外分光光度法
虎杖别名花斑竹、酸筒杆、酸桶笋、酸汤梗、川筋龙、斑杖根，为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum，的干燥根茎和根。多生于山谷、溪旁或岸边，分布在我国中部及南部。产于江西、福建、云南、四川、贵州等地。药理作用：（1）对心血管系统的影响：强心扩血管作用；抑制血小板聚集、抗血栓；改善微循环、抗休克作用；降血脂；（2）对呼吸系统的影响：镇咳、平喘作用；（3）对消化系统的影响：胃肠道作用、保肝用；（4）止血抗炎作用；（5）镇静作用；（6）修复损伤的DNA及保护大脑皮层神经元功能、对酶活性抑制作用、对内分泌的影响、对基因表达的影响、利尿作用等[1]。研究结果表明虎杖含有如下多种化学成分：含有大黄素、大黄素-6-甲醚、大黄素-8-单甲醚、大黄酚、大黄酸及蒽苷大黄素-6-甲醚-8-β-D-葡萄糖苷和大黄素-8-β-D-葡萄糖苷等[2]；含有白藜芦醇和白藜芦醇苷（虎杖苷）.其中白藜芦醇和白藜芦醇苷为主要药用成分。白藜芦醇（3，4，5，-三羟基二苯乙烯；trans-resveratrol）是一种活性多酚物质，在虎杖、葡萄、花生、毛穗藜芦、毛脉酸模等植物中存在[3]。白藜芦醇的功能作用：首先，具有抗癌作用，可用于预防与治疗慢性炎症和癌症。对肿瘤的起始、促进、发展三个阶段均有抑制作用，可作为天然的化学防癌剂。其次，在心血管方面的作用。适量饮用葡萄酒有利于心血管健康的观点已得到普遍认同。另外，白藜芦醇还具有抗氧化、抗自由基，保护肝脏，抗菌，消炎，抗过敏等多种有益人体的功能作用[4]。目前，国内在白黎芦醇的提取方面研究较多。一般是采用有机溶剂提取，如乙醇、甲醇、丙酮等，以丙酮提取率最高。提取方式有浸渍提取、回流提取、超声提取等，硅胶柱层析或大孔吸附树脂吸附分离的方法来提纯白黎芦醇；检测多以高效液相色谱。本实验以微波辅助提取，具有省时、方便等作用，微波辅助提取中药有效成分具有选择性好、提取纯度高和高效快速的特点，已在中草药化学成分提取方面得到广泛应用。 有关虎杖中白藜芦醇、白藜芦醇苷和大黄素含量测定方法的研究报道较多，主要有分光光度法、胶束薄层色谱法、电化学发光法、高速逆流色谱法、高效液相色谱等[5-6]，其中以分光光度法最为简单方便。本研究探讨微波辅助提取虎杖中白藜芦醇的工艺研究，并建立测定白藜芦醇含量的紫外分光光度法，旨在为虎杖的药理作用研究以及科学合理利用提供试验依据。
1 实验部分
1.1 原料、试剂与仪器
（1）实验原料、试剂；虎杖，产地：福建三明； 95%乙醇；乙酸乙酯；石油醚；均为化学纯；白藜芦醇，产地：美国，分析纯。（2）实验仪器；TR-02型药材粉碎机：（武义县屹立工具有限公司）；LWMC-205型可调功率微波化学反应器 ：（南京陵江科技开发有限责任公司）；SHB-III循环水式多用真空泵：（郑州长城科工贸有限公司）；UV-2550型紫外分光光度计：（厦门精艺兴业科技有限公司）；FA1604N型电子天平：（上海精密科学仪器有限公司）；RE-52B旋转蒸发仪：（上海博经经贸公司）；SYP智能型玻璃恒温水浴锅：（巩义市予华仪器责任有限公司）；玻璃仪器气流烘干器：（巩义市予华仪器责任有限公司）722S-可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司。
1.2 分析方法
本方法采用紫外分光光度计在306.4nm出测量所提取液的吸光度。一定的波长下有吸收峰进行测定。白藜芦醇的英文名Resveratrol简写RES，分子式C14H12O3，分子量228.25，无味、白色晶体难溶于水，易溶于乙醇，甲醇，丙酮等有机溶剂，本实验以白藜芦醇为对照品，以乙醇为溶剂，采用分光光度法在306.4nm波长下直接进行白藜芦醇吸光度值的测定，从而分析计算其含量。
1.3 实验步骤
（1）备料；把虎杖根茎烘干、把干净的虎杖用粉碎机粉碎，过40目筛后放存储瓶中备用。（2）配制溶液；分别配制45%、55%、65%、70%、75%、80%的乙醇溶液：乙酸乙酯：水为1：1的溶液。（3）供试品溶液制备；按照实验方案准确称取1.0g若干份虎杖根茎粉末，分别置于三角锥形瓶中，加入相应浓度和体积的乙醇浸泡6小时，置于微波化学反应器中按方案提供的条件提取，冷却室温后抽滤；加石油醚洗涤至上层清液为无色，滤液再用乙酸乙酯：水为1：1的溶液萃取3次（每次所用溶液为20ml），将萃取液转入旋转回流蒸发仪中，40℃水浴浓缩，样品浓缩后，至于50ml容量瓶中加95%乙醇至刻度，摇匀，分别取2ml至25ml容量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试液备用。（4）微波辅助提取虎杖中白藜芦醇及测定的工艺流程；虎杖根茎干燥粉碎烘干过筛（40目）按料液比浸渍微波提取冷却石油醚洗涤1：1的乙酸乙酯：水溶液萃取旋转回流蒸发仪（40℃水浴）蒸发定容（50mL容量瓶）移取2.00mL定容（25mL容量瓶）测定吸光值分析计算提取率。
1.4 标准曲线的绘制
（1）对照品溶液的制备；准确称取白藜芦醇标准品10.00mg至50mL容量瓶中，用无水乙醇配成浓度为0.2mg/mL的对照品溶液。（2）最大吸收波长的选择；准确吸取对照品溶液0.3mL，置于10mL容量瓶中，加人95%乙醇定容，再取95%的乙醇溶液为空白对照液，及所制取的供试品溶液，将三种溶液用UV-2550型紫外分光光度计于波长为200——400nm范围进行扫描。结果表明：供试品溶液及对照品溶液均在波长306.4nm处有最大吸收峰，因此选择306.4nm为测定波长。（3）标准工作曲线：分别精确吸取0.2mg/mL的白藜芦醇对照品溶液0.0mL、0.15mL、0.3mL、0.45mL、0.6mL、0.75ml、0.9ml置于10ml容量瓶中定容，同时以95%乙醇试剂空白对照，在306.4nm处测定吸光度。以白藜芦醇标准溶液的浓度为横坐标，测定的吸光度为纵坐标，作图得到标准曲线，其回归方程为：Y=0.1614X+0.0682， R=0.9991。本品在3.0μg～18.0μg/ml范围内线性关系良好。结果见（图1）。
1.5 微波辅助波提取虎杖白藜芦醇的影响因素
微波时间：5—25min；微波功率：200W—600W；溶剂：不同浓度的乙醇（45%-80%）
料液比：1：15—1：35。
（1）微波辅助提取单因素实验；准确称取1.0g干燥的白藜芦醇根茎粉末，用不同微波时间、微波功率、乙醇浓度、料液比分别进行单因素实验。其中相同的提取条件分别是微波时间5min、微波功率400W、乙醇浓度70%、料液比1：25。（2）微波波提取正交优化实验设计；实际操作中各因素相互交叉影响，为了全面考察影响因素，在单因素的基础上，选取各单因素的较优条件，设计4因素3水平正交实验L9（34），确定白藜芦醇的最佳提取条件。
1.6 虎杖中白藜芦醇提取量的计算方法
白藜芦醇提取率：x（%）=（a×50×25/2m）/106
式中：x为样品中白藜芦醇的含量%；a为对应标准曲线上所对应的样品中白藜芦醇的质量（ug）；m为样品的质量（g）。
2 结果分析与讨论
2.1 虎杖中白藜芦醇提取的单因素实验
（1）料液比的选择；料液比即提取过程中原料与提取溶剂的比例（为便于换算，使用质量w/体积v）。料液比对提取过程的影响主要体现在相同的提取条件下，白藜芦醇等化合物的溶解度一定，此时若增大提取溶剂，则溶解的化合物的量也增大。理论上，在原料一定时，提取溶剂增大，三萜类化合物的浸出量增大；但提取溶剂并非能无限增大，若提取溶剂用量太大，一方面回收溶剂的成本增加，另一方面提取过程加热的能耗增加。为寻求最佳的料液比，本实验考察在70%乙醇﹣水体系，微波功率为400W、微波提取时间为5min，不同料液比条件下白藜芦醇的提取率，结果见图2所示。
（2）乙醇浓度的选择；白藜芦醇是多酚化合物，主要来源于蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的根茎提取物。白藜芦醇为无味的白色晶体；难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂。考虑到甲醇和丙酮的毒性和挥发性，所以本实验采用乙醇-水为溶剂，根据相似相容原理，调节乙醇水比例，使其极性与白藜芦醇相近，从而使得白藜芦醇在提取溶剂中达到最大溶解度。在乙醇﹣水体系下，微波功率为400W、微波提取时间为5min、料液比1∶25，三萜类化合物的提取率见图3。结果表明随乙醇体积分数的增大，提取率增大，浓度增大有利于增大白藜芦醇的溶解度，当达到一定程度时提取率不再增大，所以选择乙醇浓度70%为最佳浓度。
（3）微波提取时间的影响；白藜芦醇从虎杖的根茎中溶解到溶剂中是需要一定的时间，当破碎的细胞中的白藜芦醇溶于溶剂中后，采用微波直接作用于虎杖根茎分子，使细胞破裂是需要一定的时间，时间的长短可能决定着虎杖根茎细胞的破裂程度，从而影响虎杖中白藜芦醇的提取率。为寻找最佳微波提取时间，在微波功率为400W时，料液比1∶25，乙醇浓度70%的条件下，按不同微波提取时间进行提取实验，结果如（图4）。
（图4）表明提取率随时间的延长而增大，当提取时间到达15min后，随着微波时间的延长，提取率增大的不明显或已经停止增长，说明15min时提取率已经达到最大值，所以采取15min为最佳微波时间。
（4）微波功率的影响；粉碎至一定粒度后的药材，一部分虎杖根茎细胞可能会碎裂，其中所含的白藜芦醇可直接被溶剂萃取而转入溶剂中，溶剂与虎杖根茎粉末固体之间的浸泡过程，溶剂不断向固体内部扩散，在细胞内溶解白藜芦醇。当破碎的细胞中的白藜芦醇溶于溶剂中后，采用微波可直接作用于虎杖根茎分子，使分子的热运动加剧，从而引起温度升高，这种热效应可以快速破坏细胞壁，使虎杖中的白藜芦醇有效成分更快的分离提取出来，为寻找最佳微波功率，在微波时间为5min时，料液比1∶25，乙醇浓度70%的条件下，按不同微波功率进行提取实验，结果如（图5）。
（图5）表明提取率随微波功率而增大，但不是很明显，当达到500W时就已经达到了最大提取率，为节约能源的消耗，只需取500W就为最佳提取功率。
2.2 微波辅助波提取虎杖白藜芦醇的正交优化
（1）因素水平；试验选择以下4个因素：微波时间（A）、微波功率（B）、乙醇浓度 （C）、料液比（D）作为考察对象，每个因素取3个水平（表1），以提取物中白藜芦醇含量为评价指标，采用L9（34）正交表进行正交试验设计。
（2）正交实验方案与结果（见表2）.
（3）极差分析；由（表2）的极差计算结果得出，影响虎杖白藜芦醇提取率的因素主次顺序为A>C>D>B，即微波辅助时间对试验结果影响最大，乙醇浓度、料液比影响次之，微波功率影响最小。最佳提取工艺条件应为A2 B3 C2 D3因而，微波辅助波优选提取虎杖白藜芦醇的最佳工艺条件实际为：微波辅助作用时间15min，以70%的乙醇为提取剂，料液比1：30，微波辅助功率为500W。因最佳组合不在试验设计中，须做验证试验。
2.3 验证实验
为了验证优化计算结果的可靠性，选微波辅助作用时间15min以70%的乙醇为提取剂，料液比1：30，微波辅助功率为500W进行验证实验，平行做3组，计算得平均提取率为0.750%，虽然比试验中的最大提取率第4组只大一点，但由于微波功率的影响最小，所以在此条件下的确实确实优于其他条件，为最佳条件。
3 结语
（1）以70%乙醇水体系为白藜芦醇的提取溶剂，溶解度大，无毒而且溶剂回收容易，价格低廉对工业生产具有成本优势。（2）正交实验结果能验证单因素实验，各因素对白藜芦醇提取率影响程度大小依次为：微波辅助作用时间>乙醇浓度>料液比>微波辅助功率，同时能得到最佳的提取参数范围。在最佳提取参数范围取一组参数结果让人满意，最佳提取工艺参数为：微波辅助作用时间15min以70%的乙醇为提取剂，料液比1：30，微波辅助功率为500W，在该条件下，白藜芦醇的提取率为0.750%，关于虎杖中微波辅助提取白藜芦醇并测定其含量的报到相比，本实验方案采用的溶剂无毒、低成本、方法简单、检测采用分光光度法操作方便，且的到的提取率高，这是本文的独特之处。（3） 微波辅助波与传统的醇溶剂浸提法相比，操作时间明显缩短，能达到降低成本、省时、高效、节能、减少污染的目的。
参考文献：
[1]刘树兴，程丽英.虎杖有效成份的开发现状及展望.中国食品添加剂，2004，（6）：80-82.
[2]裴莲花，吴学，金光洙.虎杖化学成分及药理作用研究现状.延边大学医学学报.2006，29（02）：147-149.
[3]孟昭仁，奚洪民，刘进帮.白藜芦醇的提取和纯化及分析方法研究进展.化学世界.2002，（10）：511-513.
[4]张骅，综述，刘琨审校.虎杖临床应用研究进展.临床肺科杂志.2007，12（01）：62-63.
白藜芦醇范文第3篇
【关键词】 白藜芦醇；全细胞膜片钳；钙电流
Effects of resveratrol on Ltype calcium current in isolated ventricular myocytes of guinea pig
【Abstract】 AIM: To investigate the effects of resveratrol on the Ltype calcium current (ICaL) in isolated ventricular myocytes of guinea pig. METHODS: Single ventricular cell was obtained from healthy guinea pig heart using enzymatic dissociation methods. The wholecell patch clamp was used to record the ICaL following the administration of resveratrol at 1， 50， 100 μmol/L. RESULTS: ① Resveratrol reduced the ICaL in a concentrationdependent manner， but it had no effect on IV shape of ICaL. ② Resveratrol markedly shifted the steadystate activation curve of ICaL to the right， and V1/2 value increased from (-18.97±4.08) mV in control to (-15.97±4.13) mV in the presence of resveratrol （n=7， P=0.02）， the κ value from (3.64±0.56) to (3.82±0.60) (n=7，P=0.67). ③ Inactivation curve of ICaL was not affected significantly. ④ The time constant of reactivation of ICaL was reduced from (98.50±9.00) ms to (54.53±4.27) ms (n=6，P=0.000) by resveratrol. CONCLUSION: Resveratrol inhibited the Ltype calcium channel， mainly acting on the activity and recovery processes.
【Keywords】 resveratrol；wholecell patch clamp；calcium current
【摘要】 目的：研究白藜芦醇对正常豚鼠心室肌细胞L型钙电流（ICaL）的影响. 方法：采用全细胞膜片钳技术，记录不同浓度白藜芦醇作用前后对ICaL的影响. 结果：①白藜芦醇呈浓度依赖性阻断ICaL，但对激活电位、峰电位、反转电位均没有影响；②白藜芦醇使ICaL稳态激活曲线右移，V1/2由对照的（-18.97±4.08） mV变为（-15.97±4.13） mV （n=7，P=0.02），κ由（3.64±0.56）变为（3.82±0.60）（n=7，P=0.67）；③对失活曲线无影响，不改变ICaL失活特性；④白藜芦醇使ICaL失活后再恢复时间常数τ缩短，从（98.50±9.00） ms变为（54.53±4.27） ms（n=6，P=0.000）. 结论：白藜芦醇对ICaL有阻断作用，主要作用于钙通道激活和恢复过程.
【关键词】 白藜芦醇；全细胞膜片钳；钙电流
0引言
白藜芦醇化学名为3，5，4′三羟基反二苯代乙烯(3，5，4′ trihydroxyrans stilbene)，是一种主要存在于葡萄皮、花生中的多酚类植物抗毒素. 现认为它是适量饮用葡萄酒有利于心血管健康的主要作用因子［1］. 大量研究［2-3］发现白藜芦醇对心肌缺血－再灌注损伤有保护作用；对血管有广泛的舒张效应［4］;能抗动脉粥样硬化，防治冠心病［5］. 但其对心肌细胞离子通道的作用少见报道，我们采用膜片钳技术研究白藜芦醇对心室肌细胞ICaL的影响.
1材料和方法
1.1材料健康成年豚鼠31只（武汉大学医学院动物中心），体质量250~350 g，雌雄不拘； I型胶原酶，蛋白酶E，HEPES（Gibco公司）； CSOH， CSCl， Na2ATP（Sigma公司）；白藜芦醇（西安赛得高科生物股份有限公司）；其余均为国产分析纯. 无钙台氏液 (mmol/L)：NaCl 135，KCl 5.4，MgCl2 1，NaH2PO4 0.33，Glucose 20，HEPES 10，pH 7.38 (NaOH调节);KB液(mmol/L)： glumatic acid 50，KOH 85，KCl 30，MgSO4 3，Taurine 20，Glucose 10，HEPES 10，EGTA 0.5，pH 7.2(KOH调节)；电极外液组成(mmol/L)：NaCl 37，Choline Chloride 100，CaCl2 1.8，MgCl2 0.5， HEPES 10，Glucose 10，CSCl 4.6，pH 7.3(CSOH调节)；电极内液组成(mmol/L): CSCl 120， CaCl2 1.0， MgCl2 5， Na2ATP 5，EGTA 11， HEPES 10，Glucose 11，pH 7.4(CSOH调节). 白藜芦醇在DMSO中配成1.5 mmol/L母液，每次实验时，母液溶于电极外液中配成实验所需终浓度进行灌流，DMSO终浓度低于1 mL/L.
1.2方法
1.2.1心室肌细胞的分离将豚鼠腹腔注射肝素500 U/kg，头部击昏，迅速开胸取出心脏置于1000 mL/L O2饱和的4℃生理盐水中冲洗，剪开心包，连接于Langendorff心脏灌流装置上逆行灌流，灌流压维持在70 mm H2O，用无钙台氏液灌流3～5 min，冲出心脏内残留血液，心脏完全停跳后，改用含0.33 mg/L Ⅰ型胶原酶，0.1 mg/L蛋白酶E的低钙液（Ca2+ 80 mmol/L）灌流3~5 min，至心脏膨大松弛流出液成丝后取下，除去心房，在含BSA 1 g/L的KB液中剪碎心室肌，37℃温孵，稀释，倒出上清液， 此为第一份细胞贮存液. 剩余的沉淀部分继续用KB液温孵，稀释，倒出上清依次可以得到多份细胞存储液. 灌流液始终给予1000 mL/L O2饱和，循环水浴使灌流液保温在37℃左右.
1.2.2全细胞记录技术吸数滴细胞保存液加于1.5 mL灌流槽，置于倒置显微镜（Olympus IX70）载物台上，待细胞静置贴壁，细胞外液灌流清洗细胞，电极选用硬质玻璃(上海神经生理所提供)，经微电极拉制(Narishige PB7)二次拉制而成，电极充以内液后阻抗3.5～5 MΩ. 选取横纹清晰，表面无颗粒，无收缩的细胞，采用微电极操纵仪(Narishige MD320)移动电极，当电极尖端与细胞表面形成高阻抗封接后（＞2 GΩ），补偿电极与细胞膜之间的电容，进一步给负压吸破细胞膜，经电容电流和电极串联补偿即可行全细胞记录. 所有实验均在室温下进行.
1.2.3试验分组共分为4个浓度组，分别为对照组（n=8），1 μmol/L（n=9），50 μmol/L（n=7），100 μmol/L（n=7），记录药物灌流前后ICaL ，50 μmol/L组还需记录通道激活，失活和失活后恢复电流.
统计学处理：数据分析采用pulse 8.31软件对全细胞记录进行图形与数据转换，数据以x±s表示，origin 6.0软件对数据进行统计学处理，并进行曲线拟合. 不同浓度药物作用前后间比较采用Oneway ANOVA检验及LSDt，50 μmol/L白藜芦醇作用后通道动力学改变采用t检验，P
2结果
2.1对ICaL浓度依赖性阻断作用采用保持电位-40 mV，指令电压-40～＋60 mV，钳制时间200 ms，阶跃10 mV的刺激程序引出ICaL，并且记录30 min内“rundown”现象（n=7），得出在12 min内衰减明显，所有的电流记录均在电流稳定后进行. 灌流给药5 min后药效稳定. 结果显示白藜芦醇（1～100 μmol/L）对ICaL呈浓度依赖性阻断作用，0，1，50，100 μmol/L作用时ICaL峰值分别为（0.79±0.05），（0.55±0.05），（0.42±0.05），（0.17±0.04 ）nA (F=159.104，P=0.000;多重比较后，任两组间P=0.000，图1）. 白藜芦醇作用后洗脱，ICaL大部分恢复（图2）.
转贴于
a：给药前;
b：1 μmol/L白藜芦醇; c：50 μmol/L白藜芦醇; d：100 μmol/L白藜芦醇.
图1不同浓度白藜芦醇对ICaL的影响（略）
a：给药前; b：50 μmol/L白藜芦醇;c：洗脱后.
图2白藜芦醇作用及洗脱后对ICaL的影响（略）
2.2对电流电压曲线的影响从保持电位-40 mV逐步去极化至+60 mV，阶跃为10 mV，持续时间200 ms. 50 μmol/L藜芦醇作用后，对钙电流的最大激活电位和反转电位均无影响，但使最大峰值电流降低（56.20±2.50）％（n=5，P＝0.000，图3）.
图350 μmol/L白藜芦醇对ICaL的IV曲线的影响（略）
2.3对稳态激活动力学曲线的影响根据上述脉冲刺激得到的电流值，按Boltzmann方程进行拟合:G/Gmax=1/［1+exp(VT－V1/2/κ)］. (G为电导，V1/2为曲线中点的电压，κ为曲线的斜率). 给予50 μmol/L白藜芦醇前后，V1/2/分别为（-18.97±4.08），（－15.97±4.13）mV（n=7，P=0.02）， κ分别为3.64±0.56，3.82±0.60（n=7，P=0.67）. 白藜芦醇能使激活曲线明显右移（图4）.
图4白藜芦醇对ICaL激活曲线的影响（略）
2.4对稳态失活动力学曲线的影响采用双脉冲刺激法，保持电位为-60 mV，开始逐步去极化至+30 mV，阶跃10 mV，持续1 s；在每次条件脉冲后都紧跟一个固定的去极化至10 mV，持续300 ms的脉冲，然后回到-60 mV. 将记录到的ICaL值经Boltzmann方程拟合I/Imax=1/［1+exp(VT-V1/2/κ)］. 50 μmol/L白藜芦醇作用前后，V1/2/分别为（－20.17±1.17），（－20.81±0.75）mV（n=8，P=0.20）， κ分别为7.16±1.04，6.97±0.67（n=8，P=0.90）. 因而白藜芦醇对ICaL稳态失活曲线无影响（图5）.
图5白藜芦醇对ICaL失活曲线的影响（略）
2.5对失活后恢复动力学曲线的作用采用双脉冲刺激法. 保持电位为-60 mV，给予去极化至10 mV的刺激，持续250 ms，回到保持电位持续50 ms后，再给予同样刺激，前后两个脉冲的间隔时间逐渐增加，每次增加50 ms，共9次脉冲. 加药前得到的曲线可以用单指数方程拟合. 给药前后的时间常数（τ）为（98.50±9.00），（54.53±4.27）ms( n=6，P=0.000，图6）.
图6白藜芦醇对ICaL失活后恢复曲线的影响（略）
3讨论
ICaL在心肌细胞电活动中起重要作用. 它是维持一个较长平台期的主要内向电流，为其他离子流的活动提供合适的电位条件. 钙通道阻滞剂不仅可以减少细胞内钙离子浓度，减少钙超载的发生，减少降解酶类的激活释放而引起的的心肌缺血再灌注损伤；还可以缩短APD，减少兴奋性折返引起的早后去极化，减少心律失常的发生.
白藜芦醇的研究最早始于“法国悖论”现象，即法国人喝大量葡萄酒，血液中饱和脂肪酸几乎是其他发达国家的四倍，但是罹患心脏病的危险确只是后者的三分之一［6］. 研究表明这种现象与葡萄酒中的一种称为白藜芦醇的物质有着密切关系，它可以减少心肌缺血再灌注损伤、舒张血管、抗动脉粥样硬化等. 白藜芦醇作为钙通道阻断剂减少胞内钙超载的特点进一步揭示其发挥心肌保护作用的机制. Pakaki等［7］研究发现预先给予大鼠不同剂量的白藜芦醇进行干预，可以不同程度的减少心肌缺血再灌注后室早室颤的发生率. 本试验可以进一步解释此研究结果，白藜芦醇作为钙通道阻断剂可以减少兴奋折返，减少心律失常的发生.
本实验不足之处是仅就正常心室肌细胞的钙通道进行研究，对于病理状态如缺血缺氧，以及其他通道如钠，钾，氯通道及其各种亚型，和细胞膜上的各种离子泵的作用还有待进一步研究.
参考文献
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白藜芦醇范文第4篇
【摘要】 目的： 观察白藜芦醇对大肠癌细胞生长增殖的影响，并从人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)表达及其启动子方面探讨可能的抗癌机制。方法： 以不同浓度的白藜芦醇处理大肠癌LS174T细胞后，收集细胞，分别采用荧光实时定量RTPCR和蛋白质印迹法检测癌细胞hTERT mRNA和蛋白水平。采用脂质体转染法将携带hTERT启动子和报告基因的质粒转染至大肠癌LS174T细胞中后，加入不同浓度的白藜芦醇，孵育48 h后，检测报告基因萤虫素酶活性。结果： 白藜芦醇处理大肠癌细胞后，增殖明显受到抑制，且与浓度有关。癌细胞hTERT mRNA和蛋白水平明显下调，且呈浓度和时间依赖性。白藜芦醇处理组萤虫素酶活性下降，且呈浓度依赖性。结论： hTERT启动子活性和hTERT表达下调，可能是白藜芦醇抑制癌细胞增殖的重要机制之一。
【关键词】 白藜芦醇; 大肠肿瘤; 人端粒酶逆转录酶; 启动子
[Abstract] Objective: To investigate the effect of resveratrol on human telomerase reverse transcriptase(hTERT) and its promoter of human colorectal cancer cell. Methods： After LS174T human colorectal cancer cell were treated with different dose of resveratrol，mRNA and protein of hTERT were determined by realtime PCR and Western blot，respectively. The plasmid inserted hTERT promoter was transected into LS174T cells by oligofecamine 2000， and different doses of resveratrol were added into culture media 2 hours later. After 48 hours， luciferase activity of colorectal cancer cell was determined. Results： The expression of mRNA and protein of hTERT of cells treated with resveratrol were downregulated in doseand timedependent manner. The luciferase activity of cancer cells treated with resveratrol were inhibited in dosedependent manner. Conclusion： Resveratrole may suppress telomerase activity through inhibiting expression of hTERT promoter of colorectal cancer cell.
[Key words] resveratrole; colorectal carcinoma; human telomerase reverse transcriptase; promoter
已有研究发现，85%～90%的肿瘤包括大肠癌中都有端粒酶的活化表达，而正常细胞(生殖细胞除外)及正常组织几乎没有端粒酶活性，正常细胞向肿瘤细胞转变过程中大多伴随端粒酶的激活[1]。端粒酶的活化可能是恶性肿瘤发生的关键环节之一[2]。目前研究证实，端粒酶蛋白质组分是其活性调控的主要成分，其中催化亚单位之一人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT) 的激活与端粒酶的激活密切相关，二者呈正相关[3-5]。
大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率逐渐增高。研究发现，端粒酶的激活在大肠黏膜癌变发生发展中起着重要的作用[3，4]。由正常大肠黏膜发展到大肠癌，端粒酶阳性表达率呈递增趋势[5]。因此，采用各种方法及从各种途径抑制端粒酶活性，将有助于大肠癌的综合治疗。
白藜芦醇(resveratrol)是从葡萄、水果和蓼科植物根部提取出来的有效成分，研究发现，该药具有抗氧化、抗炎的作用，而且对许多癌细胞生长具有一定的抑制作用。最近国内外学者研究表明，白藜芦醇的抗癌作用与抑制端粒酶活性有关[6-8]，但内在机制尚不清楚。为此，本研究采用白藜芦醇处理大肠癌细胞，观察其对癌细胞hTERT表达及其启动子的影响。
1 材料与方法
1.1 材 料
白藜芦醇，购自Alexis Biochemicals公司;大肠癌LS174T细胞株，人大肠癌LS174T细胞，购自中科院上海细胞库;胎牛血清购自High Clone;hTERT单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;hTERT启动子质粒TERT/Luc，含hTERT启动子序列，连接萤虫素酶报告基因，由美国Darmouth大学博士后李华构建，并经测序无误。荧虫素酶试剂盒和SV40质粒(连接报告基因)购自Promega公司;脂质体oligofecamine购自美国Invitrogen公司;hTERT定量PCR引物：上游5′CGTACAGGTTTCACGCATGTG3′，下游5′ATGACGCGCAGGAAAAATGT3′;FAM标记探针：5′FAMAGCTCCCATTTCATCAGCAAGTTTGGAATMARA3′。
1.2 白藜芦醇对大肠癌细胞增殖的影响
参照文献[9]进行，方法简略如下：以不同浓度(12.5，25，50，100，200，400 μmol/L)的白藜芦醇处理大肠癌细胞不同时间(24，48，72 h)后，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，继续培养4 h，去上清。每孔加入二甲基亚砜0.1 ml，摇床向上摇动约15 min，用酶标仪在波长570 nm处计数各孔光密度值(D值)。每组设3复孔。
细胞生长抑制率(inhibition ratio，IR)=
1-转染组试验孔D值空白对照孔D值×100%
1.3 白藜芦醇对大肠癌细胞hTERT mRNA水平的影响
1.3.1 RNA提取、逆转录cDNA合成 根据说明书提取细胞总RNA和合成cDNA。
1.3.2 荧光实时定量PCR 根据文献[10]进行。50 μl反应体系：hTERT基因上、下游引物各1.5 μl，FAM 1 μl，GAPDH探针2.5 μl，2×PCR Mix 缓冲液 26 μl，cDNA 10 μl，H2O 7.5 μl。然后再进行检测，循环反应条件为：50℃，2 min，1个循环;95℃，10 min，1个循环;95℃， 15 s，60℃，1 min。40个循环。
1.3.3 荧光实时定量PCR结果分析 测试样本一式3份，进行多次重复。hTERT基因表达的mRNA，以内参照GAPDH基因的表达按照如下公式进行相对定量：cDNAhTERT=cDNAGAPDH×2ΔCT(ΔCT =CTGAPDH-CThTERT)[cDNAhTERT和cDNAGAPDH分别表示hTERT和GAPDH的cDNA量，CTGAPDH及CT hTERT表示cDNA经PCR扩增到一定量时的循环数]。
1.4 白藜芦醇对大肠癌细胞hTERT蛋白水平的影响
采用蛋白质印迹法检测。收集细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液洗2次，加入细胞裂解液，在冰面上静置10～20 min，用细胞刮匀浆后，4℃，离心10 min，转速15 000 r/min，取上清，加入1/3体积的4×上样缓冲液，煮沸10 min使蛋白变性。样品蛋白经凝胶电泳分离、电转移至硝酸纤维素膜，室温封闭1 h后加入hTERT 单克隆抗体(1∶500)，4℃孵育过夜。漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶500)，37℃孵育1 h，漂洗后用ECL显色，曝光，冲洗胶片。
1.5 大肠癌细胞hTERT启动子活性测定
1.5.1 质粒转染 大肠癌LS174T细胞以5×105/孔接种于6孔培养板，24 h后根据脂质体说明书进行转染。将待转染质粒以脂质体DNA复合物的形式(比例为1∶10)加入上述细胞培养孔中，同时转染内对照SV40质粒。3复孔，重复3次。
1.5.2 萤虫素酶活性测定 质粒转染2 h后加入不同浓度的白藜芦醇， 24 h后更换含10 % 胎牛血清的新鲜培养液及相应浓度的白藜芦醇，于37℃细胞培养箱继续培养24 h后，用预冷的PBS洗3遍，消化收集细胞，加入1×PLB裂解液处理细胞后，用荧虫素酶试剂盒及萤虫素酶测定仪测定萤虫素酶活性。
1.6 统计学处理
所得数据用±s表示，采用SPPS10.0软件进行处理，组间比较用配对t检验分析。P
2 结 果
2.1 白藜芦醇对大肠癌细胞增殖的影响
以不同浓度的白藜芦醇处理大肠癌LS174T细胞不同时间后，采用MTT法检测癌细胞生长情况。结果表明，浓度为12.5 μmol/L的白藜芦醇即可对大肠癌LS174T细胞增殖具有抑制作用;随着浓度的增加，抑制作用明显增强;达到400 μmol/L时，增殖抑制作用无明显增加。见图1。
2.2 白藜芦醇对大肠癌细胞hTERT mRNA水平的影响
以不同浓度的白藜芦醇处理大肠癌LS174T细胞后，收获细胞，采用实时定量RTPCR检测hTERT mRNA水平。结果发现，白藜芦醇处理组细胞hTERT mRNA水平被有效地抑制，且呈浓度和时间依赖性(P
2.3 白藜芦醇对大肠癌细胞hTERT蛋白水平的影响
以不同浓度的白藜芦醇处理大肠癌细胞24，48，72 h后，通过蛋白质印迹法检测发现，处理组hTERT蛋白水平明显降低。见图3。
2.4 白藜芦醇对大肠癌细胞hTERT启动子表达的调控作用
为进一步了解白藜芦醇的抗癌作用是否与抑制hTERT表达有关，将hTERT启动子质粒TERT/Luc转染入大肠癌细胞中，2 h后加入不同浓度的白藜芦醇，48 h后测定hTERT启动子的表达情况。结果表明，与对照组比较，处理组hTERT启动子活性明显受到抑制，且呈浓度依赖性(P
3 讨 论
大肠癌在我国的发病率很高，寻找理想的药物是当务之急。许多学者研究发现，白藜芦醇对多种肿瘤细胞生长具有明显的抑制作用，其机制可能与端粒酶活性改变有关[6-8]。本研究在前期工作基础上，以白藜芦醇处理大肠癌细胞，观察了对hTERT表达及其启动子活性的影响。
端粒酶活化是大多数肿瘤发生的关键环节及细胞恶化的必经之路，因而端粒酶不但成为当今新的肿瘤标志物，而且已成为肿瘤基因治疗中一个新的理想靶点。所以，探讨其调控的相关机制，将有助于大肠癌等恶性肿瘤的基因治疗。研究发现，端粒酶催化亚单位hTERT具有限速作用，对端粒酶的活性调节最为重要。hTERT转录水平上的调控是端粒酶基因调控的主要途径[3-5]。
本研究将大肠癌细胞用不同浓度的白藜芦醇处理后，分别采用实时定量PCR和免疫荧光标记方法检测大肠癌细胞中hTERT mRNA和蛋白水平，结果发现，大肠癌细胞hTERT mRNA和蛋白被有效地抑制，且呈浓度和时间依赖性。提示白藜芦醇对大肠癌细胞端粒酶活性的抑制作用，与抑制hTERT激活有重要的关系。
为进一步了解白藜芦醇抑制端粒酶活性的机制，本研究通过萤虫素酶报告基因的方法探讨了该药对大肠癌细胞hTERT转录水平的影响。本课题组通过脂质体转染法，将hTERT启动子质粒转染至大肠癌细胞株中后，加入不同浓度的白藜芦醇，检测萤虫素酶活性。结果发现，处理组萤虫素酶活性下降，且呈浓度依赖性。由此提示，白藜芦醇抑制大肠癌细胞端粒酶活性机制之一为下调hTERT启动子表达。
总之，本研究说明，下调大肠癌细胞hTERT 启动子活性，从而抑制hTERT表达，是白藜芦醇抑制大肠癌细胞增殖和端粒酶活性的重要途径之一。
参考文献
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[8] Lanzilli G， Fuggetta MP， Tricarico M，et al. Resveratrol downregulates the growth and telomerase activity of breast cancer cells in vitro[J]. Int J Oncol，2006，28(3):641-648.
白藜芦醇范文第5篇
[关键词] 白藜芦醇;衰老;细胞凋亡
[中图分类号] R-33[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)02(c)-025-03
Investigation of the mechanism of hepatocellular effect of resveratrol on aging Kunming mice
LI Yongtao1, FEI Hongxin1, SHEN Lei1, JIANG Yang1, GUO Zhihong2, GAO Lei1, SHI Xiaofang1, LIU Wenhua1
(1.Qiqihar Medical University, Qiqihar 161000, China; 2.Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730070, China)
[Abstract] Objective: To study the effect of resveratrol on hepatocellular apoptosis-related protein Bcl-2 and Bax of aging Kunming mice and its impact on antioxidant capacity in female mice, and study the senility-delaying effect and mechanism of resveratrol on hepatic cells. Methods: Natural aging female mice were given different doses of exogenous resveratrol. Then apoptosis regulatory protein Bcl-2 and Bax expression in mice hepatocellular grandlose cells were detected by using immunohistochemical method. The contents of serum total superoxide dismutase activity and malondialdehyde were detected by using biochemical method. Results: Compared with the young control group, the resveratrol of Bcl-2 expression in aged control group was lower and the resveratrol of Bax expression was higher, serum SOD activity was decreased and the resveratrol of MDA was significantly increased (P
[Key words] Resveratrol; Aging; Cell apoptosis
白藜芦醇(resveratrol,Res)是广泛存在于葡萄、花生和多种传统中药中的一种多酚类化合物,具有降血脂、抗感染、抗氧化、抑制肿瘤细胞增殖、转移和促进凋亡等生物学功能,是近年中西医结合领域的一个研究热点[1-3]。本实验选用18月龄的衰老雌性昆明小鼠,观察白藜芦醇对肝细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达以及血清中SOD活力和MDA含量的影响,探讨延缓肝细胞衰老的途径和作用机制,为临床肝硬化、肝癌的预防和治疗提供理论依据。
1材料与方法
1.1实验动物
选用18月龄的自然衰老雌性昆明小鼠为实验组,体重(40±2) g;4月龄青年雌性昆明小鼠为青年对照组,体重(18±1) g,均由哈尔滨医科大学实验动物中心黄小义博士提供。将昆明小鼠做阴道细胞涂片,连续检查2个动情周期,无规律性周期变化者确定为自然衰老昆明小鼠,随机分为四组,分别为衰老对照组和白藜芦醇小、中、大剂量(40、120、180 mg/ml)组,连续腹腔注射9周,青年对照组注射等量生理盐水。
1.2 实验材料
白藜芦醇(Sigma公司)用二甲基亚砜(DMSO)配制;RPMI-1640(Gibco/BRL公司,USA);Bcl-2兔抗鼠多克隆抗体、Bax兔抗鼠多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司);SABC(兔IgG)-POD试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);MTT(上海华舜生物工程有限公司)。
1.3 实验标本采集与制备
雌性昆明小鼠末次给药24 h后,实验动物眶内静脉取血,取血后昆明小鼠断头处死,迅速摘取肝细胞,一侧置于10%甲醛溶液中固定,常规石蜡包埋切片。
1.4血清总SOD活力和MDA含量的测定
冰台上迅速取肝脏,放于Carnoy溶液固定后,制作石蜡切片,用PBS液(0.01 mol/L,pH 7.4)冲洗3次,每次5 min。H2O2室温孵育10 min,以消除内源性过氧化物酶的活性,室温下孵育10 min,蒸馏水冲洗,PBS浸泡5 min。10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭,室温孵育10 min。倾去上清液,勿洗,滴加1∶100比例稀释的一抗,37℃孵育1 h。PBS冲洗,5 min×3次。滴加第二代生物素标记过的二抗工作液,37℃或室温孵育30 min。PBS冲洗,5 min×3次。滴加第二代辣根酶标记的链霉卵白素工作液,37℃孵育30 min。PBS冲洗,5 min×3次。显色剂(DAB)显色,使用DAB显色试剂盒,取1 ml蒸馏水,加A、B、C试剂各1滴,混匀后加至切片上,室温显色,镜下控制反应时间。自来水充分冲洗,苏木精复染,封片。治疗组除用PBS代替一抗外,其他步骤相同。昆明小鼠处死后马上剥离肝脏,加入组织裂解液(50 mmol/L,Tris-HCl缓冲液,pH 7.4,10 g/L PMSF,0.5 mol/L EDTA),制成匀浆,4℃离心30 min,用2.5%戊二醛固定,继续用2%四氧化锇固定,脱水、包埋、切片和染色按常规处理,观察拍照,检测SOD、MDA的活性。
1.5 肝组织中Bcl-2及Bax的测定
用免疫组织化学SABC法,Bcl-2定位于核膜、粗面内质网和线粒体膜上,Bax定位于胞质。免疫细胞化学结果判定采用组织化学评分法。阳性染色为胞质内出现棕黄色颗粒,以i代表染色深浅,根据细胞着色的强弱分为4个等级:无着色0分,淡黄色1分,棕黄色2分,棕褐色3分。该评分法可反映单个细胞是否具有阳性表达及表达强弱,更客观地评价细胞蛋白的表达情况。
1.6 统计学分析
数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 11.0软件分析,实验结果采用t检验,P
2 结果
2.1 昆明小鼠血清SOD活力和MDA含量的变化
40、120、180 mg/ml各组白藜芦醇与衰老对照组比较,SOD水平有升高趋势,但差异无统计学意义,衰老对照组昆明小鼠SOD水平低于青年对照组(P
表1昆明小鼠血清SOD活力和MDA含量的变化(x±s)
与衰老对照组比较,*P
2.2昆明小鼠肝细胞Bcl-2及Bax的表达情况(图1、2)
青年对照组中昆明小鼠肝组织肝细胞形态清晰,胞质丰富,细胞核大而圆,细胞生长旺盛(图1A);衰老对照组中可以见到肝组织中肝细胞界限不清,细胞核深染,胞质中可以见到染色深的棕黄色结构(图1B);白藜芦醇中剂量组可见肝组织Bcl-2表达量少的组织中棕黄色颗粒较少,Bax表达肝组织中棕黄色颗粒较多(图1D、图2D);提示衰老对照组Bcl-2表达降低,Bax表达升高,胞质中棕黄色的颗粒较多(图2B),Bcl-2/Bax比值明显减小,白藜芦醇剂量组Bcl-2表达有升高趋势,而Bax表达低于衰老对照组(P
图1 昆明小鼠肝细胞Bcl-2的表达情况
(A.青年对照组;B.衰老对照组;C.白藜芦醇小剂量组;
D.白藜芦醇中剂量组;DAB显色,×400)
图2 昆明小鼠肝细胞Bax的表达情况
(A.青年对照组;B.衰老对照组;C.白藜芦醇小剂量组;
D.白藜芦醇中剂量组;DAB显色,×400)
2.3 昆明小鼠肝细胞Bcl-2及Bax的表达水平
见表2。
表2昆明小鼠肝细胞Bcl-2及Bax的表达情况(x±s)
与衰老对照组比较,*P
从表2中可以看出,昆明小鼠衰老后Bcl-2/Bax比值减小,昆明小鼠处于青壮年后Bcl-2/Bax比值增大,提示肝细胞的老化与Bcl-2/Bax密切相关。白藜芦醇中剂量组(120 mg/ml)作用于衰老昆明小鼠后Bcl-2/Bax升高明显,提示白藜芦醇作用于昆明小鼠肝组织后,可以改善Bcl-2/Bax,对衰老小鼠有一定的治疗作用。
3讨论
白藜芦醇分子式为C14H12O3,分子量为228.25 D,是许多植物中存在的一种活性非黄酮类多酚化合物,呈白色针状晶体,难溶于水,能溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮、DMSO等极性强的溶剂中。单药应用对晚期乳腺癌、肺癌、头颈部癌、食管癌、淋巴瘤均有一定的疗效,被认为是一种广谱抗癌药物,联合其他常用抗肿瘤药物,疗效明显提高,成为最有效的抗肿瘤药之一。自1940年该成分被发现以来,一直受到医药界的重视。研究表明,白藜芦醇具有抗肿瘤、抗心血管疾病、抗氧化、抗菌、抗感染、抑制血小板聚集、调节免疫等作用,已成为科学家们高度重视的天然活性成分,具有很大的药用价值和市场前景[4-6]。
细胞是否发生凋亡与凋亡抑制因子和凋亡活化因子之间的平衡密切相关。其中重要的有凋亡抑制因子Bcl-2、Bcl-XL和凋亡活化因子Bax、Bad等。bcl-2基因及其表达蛋白可明显延长细胞的存活时间,bcl-2基因位于18q21上,约230 kb,该基因有3个外显子和2个启动子,指导Bcl-2蛋白的合成。Bcl-2蛋白是一个线粒体外膜蛋白,其C端由19个氨基酸组成疏水段,使Bcl-2蛋白可以铆钉于核膜、粗面内质网和线粒体膜上,可能在核的运输、核微孔复合物的形成和核膜的维持等方面起重要作用。bax与bcl-2基因具有40%的同源性,位于19号染色体,长约4.5 kb,有6个外显子,指导Bax蛋白的合成。Bax增高,促进细胞凋亡;Bcl-2增高,抑制细胞凋亡,Bcl-2与Bax的相互作用是其中心环节[7-8]。白藜芦醇作用于衰老昆明小鼠后Bcl-2/Bax升高明显,提示白藜芦醇作用于昆明小鼠肝组织后,可以改善Bcl-2/Bax,对衰老小鼠有一定的治疗作用。
SOD是体内最重要的抗氧化酶,可明显增加O2-的歧化反应速度,从而清除细胞内过多的氧自由基,以减少氧自由基对细胞的损伤。如果SOD活性不足,不能及时发挥抗氧化作用,细胞就会受到氧自由基的攻击,引起细胞损伤。自由基对生殖功能有很大的影响,动物实验证实,抗氧化酶活性下降,氧自由基含量增多,会导致黄体细胞凋亡,引起黄体萎缩和凋亡,引起卵泡闭锁[9-10]。MDA是脂质过氧化物的代谢产物,如果细胞内氧自由基增多,可以与细胞质膜上磷脂中的多价不饱和脂肪酸发生过氧化反应,产生过氧化物,过氧化物进一步裂解成具有细胞毒性的MDA。MDA有很强的生物活性,而且化学性质较稳定,在很低的浓度下即可明显抑制细胞内许多酶的功能,通常用MDA来反映机体脂质过氧化的程度,间接反映氧自由基对细胞的损伤程度[11-12]。实验发现,衰老对照组血清SOD活力下降,MDA含量升高,表明衰老昆明小鼠有明显的自由基损伤,给予白藜芦醇后SOD活力虽有所升高,但差异无统计学意义;MDA含量明显下降,提示白藜芦醇可能通过抑制自由基的产生或直接清除自由基等途径减少自由基对细胞的损伤。
综上所述,白藜芦醇可以通过调控凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达以及对抗自由基对细胞的损伤来抑制细胞凋亡,而对细胞起到一定的保护作用。白藜芦醇对Bcl-2、Bax蛋白的调控可能是由于白藜芦醇通过对抗自由基作用降低细胞内有毒性的MDA等脂质过氧化物的含量,恢复了细胞内相关酶的活性,进而调控Bcl-2/Bax蛋白的表达,其具体机制有待于进一步研究。
[参考文献]
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白藜芦醇范文第6篇
【关键词】 白藜芦醇 胰腺癌 增殖 凋亡
Abstract: Objective:To explore the effect of resveratrol(Res) on the proliferation of pancreatic carcinoma MIAPaCa-2 cells in vitro and explore the rudimental mechanism. Methods: Methyl thiazolyl tetrazolium method (MTT) was used to detect the cell growth status of MIAPaCa-2 cells after treatment with Res. The morphologic changes of cells after treatment with Res were detected by inverted microscope and transmission electron microscope. The apoptosis rates were analyzed with flowcytometry(FCM) after the cells were treated with 25μmol·L-1， 50μmol·L-1， 100μmol·L-1 and 200μmol·L-1 Res for 48 h， respectively. Results: Res inhibited the proliferation of MIAPaCa-2 cells in a concentration-and time-dependent manner as measured by MTT method. After the cells were treated with Res， inverted microscope observed the reduction of the cell number and found significant morphologic changes， characterized by cell rounding and cell nuclear enrichment suggesting apoptosis. And the presence of typical morphological changes of apoptosis was confirmed with transmission electron microscope. The apoptosis rates at 25μmol·L-1， 50μmol·L-1， 100μmol·L-1 and 200μmol·L-1 Res-treated groups after treatment for 48 h， measured by FCM， were significantly higher than those in control groups(P
Key words: resveratrol; pancreatic carcinoma；proliferation；apoptosis
胰腺癌是一种恶性程度很高的消化道肿瘤， 在美国居癌症死因的第4位[1]，在我国其发病率也有上升趋势。胰腺癌由于早期临床表现隐匿，相当部分病人就诊时已属晚期，手术根治性切除率只有25%左右[2]，所以多数病人只能采用化疗、放疗等姑息性治疗手段，然而现有化疗药物，即使包括吉西他滨在内，对胰腺癌的治疗效果均欠佳。白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种多酚类化合物，在我国中药植物虎杖鲜根中有较高的含量[3]，近年研究发现Res对胃癌、乳腺癌等具有显著体外增殖抑制作用[4，5]，因此，Res有望成为治疗肿瘤的新药。目前关于Res和胰腺癌治疗方面的研究甚少，因此我们选择Res和胰腺癌MIAPaCa-2细胞为研究对象，通过体外实验观察Res对胰腺癌细胞增殖的影响，来初步探讨Res用于胰腺癌治疗的可能性。
1 材料和方法
1.1 细胞株与试剂 人胰腺癌MIAPaCa-2细胞株购自湖南远泰生物公司。Res购自美国Sigma公司，纯度>99.9%，用二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)溶解，配成 400μmol·L-1贮存液，消毒后，分装，于-20 ℃冻存备用。噻唑蓝(MTT)和 DMSO均为美国Amresco公司产品，处理细胞时，DMSO浓度≤0.1%(实验证实该浓度对细胞生长无影响)。DMEM培养基(Dulbecco modified Eagle medium)、0.25%胰酶为美国GIBCO公司产品，碘化丙啶(propidium iodine，PI)为美国Sigma公司产品。
1.2 细胞培养 人胰腺癌MIAPaCa-2细胞在 5%CO2，37 ℃条件下，用含10%小牛血清、1% L-谷氨酰胺、100 U·ml-1青霉素、100μg·ml-1链霉素的DMEM培养液传代培养，培养至70%～80%融合时，用0.25%胰酶消化传代继续培养。
1.3 MTT法检测Res处理后MIAPaCa-2细胞的增殖抑制率 胰腺癌MIAPaCa-2细胞用0.25%胰酶消化后，调整细胞浓度为1×105/ml，重新接种到96孔培养板上，约1×104/孔，于37 ℃过夜，使细胞贴壁生长，培养至细胞约70%融合。然后，将细胞分Res处理组、溶剂对照组及空白对照组：Res组分别换用含不同浓度Res(25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1)的培养液100μl；溶剂对照组换用100μl含与Res相应浓度DMSO的培养液；含100μl培养液(不含细胞与药物)孔板作为空白对照组。每组设3复孔。分别培养12 h、24 h、48 h、72 h后，加入MTT(5 mg·ml-1)20μl/孔，继续培养4 h后，去上清，加入DMSO 100μl/孔，室温振荡10 min，上酶标免疫测定仪检测，492 nm波长测定吸光度值(absorbance，A)。比色时，空白组调零。计算细胞增殖抑制率，抑制率=(1-处理组A/溶剂对照组A)×100%。绘制不同时间浓度-抑制率曲线。以上实验重复3次。
1.4 形态学观察
1.4.1 倒置光学显微镜观察：胰腺癌MIAPaCa-2细胞用0.25%胰酶消化后，调整细胞浓度为1×105/ml，重新接种到96孔培养板上，为1×104/孔，于37 ℃过夜，使细胞贴壁生长，培养至细胞约70%融合。将细胞分Res组和对照组：Res组分别换用含不同浓度Res(25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1)的培养液100μl，对照组含不加药物培养液100μl。于5%CO2、37 ℃条件下分别继续培养48 hr后，倒置光学显微镜观察细胞形态学改变并摄片。
1.4.2 透射电镜观察：胰腺癌MIAPaCa-2细胞用0.25%胰酶消化后，接种到6孔培养板上，于37 ℃过夜，使细胞贴壁生长，培养至细胞约70%融合。将细胞分Res组和对照组：Res组换用含25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1 Res的培养液，对照组含不加药物培养液。5%CO2、37 ℃条件下分别继续培养48 h后，分别收集对照组、Res处理组的细胞，送湘雅医学院电镜中心检测。
1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 胰腺癌MIAPaCa-2细胞用0.25%胰酶消化后，重新接种到6孔培养板上，于37 ℃过夜，使细胞贴壁生长，培养至细胞约70%融合。将细胞分Res组和对照组：Res组换用含不同浓度Res(25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1)的培养液，对照组含不加药物培养液。5%CO2、37 ℃条件下分别继续培养48 h后，收集对照组、25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1 Res处理组细胞(≥1×106)，加预冷70%乙醇固定过夜，用PI染色。流式细胞仪检测，multicycle软件分析结果。
1.6 统计学处理方法 单处理因素组间多样本均数的多重比较采用单因素方差分析，并用LSD-t检验进行样本均数间两两比较；多处理因素采用析因设计的方差分析，并用单因素方差分析和LSD-t检验进行样本均数间两两比较，用SPSS10.0软件分析结果。
2 结果
2.1 MTT比色法检测细胞增殖抑制率 分别用25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1处理MIAPaCa-2细胞12 h、24 h、48 h、72 h后，酶标仪测定A值结果后，计算增殖抑制率，具体结果见图1。用两因素析因设计方差分析后，结果显示：①不同浓度Res对胰腺癌MIAPaCa-2细胞增殖抑制率不同(F=526.12，P=0.000)；②Res不同作用时间对胰腺癌细胞增殖抑制率不同(F=805.27，P=0.000)。并用单因素方差分析和LSD-t检验进行样本均数间两两比较，结果分析示：除 100μmol·L-1与200μmol·L-1分别处理12 h或72 h抑制率差别无统计学意义外，其余各组在同一时间或同一浓度范围内，组间两两差异均有统计学意义(P
2.2 形态学观察
2.2.1 倒置光学显微镜：对照组细胞贴壁生长良好，细胞充分生长，透光度好。25μmol·L-1 Res外理MIAPaCa-2 细胞48 h后，倒置显微镜观察见极少量细胞变圆，核浓缩，随着药物作用浓度的增加，核浓缩细胞数量增多，细胞间隙增大，细胞数目减少，提示可能存在细胞凋亡，详见图2。
2.2.2 透射电镜观察：对照组细胞核大，圆形或椭圆形，形态较规则，染色质分布均匀，胞浆内有丰富的细胞器(见图3A)。25μmol·L-1 Res处理48 h后，电镜下见少数细胞出现细胞体积缩小，内容物浓缩，核体积变小，染色质聚集变粗，成块靠边，细胞器浓缩，细胞表面有突起，但细胞膜尚完整(见图3B)；随着药物浓度增大，电镜示细胞染色质更加密集，核碎裂增多及大量典型凋亡小体产生(见图3C、图3D)。结果见图3。
2.3 流式细胞仪检测凋亡率 结果示对照组细胞凋亡率为(2.40±0.50)%，25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1 Res处理48 h后细胞凋亡率分别为(4.60±1.25)%，(12.77±0.825)%，(23.40±2.50)%，(25.40±2.46)%，详见表1。各组均数比较的单因素方差分析得F=107.50，P=0.000，用LSD-t检验进行样本均数间两两比较示各处理组与对照组之间差异具有显著性(P
3 讨论
3.1 Res的分子结构及生物学作用 Res的化学名为芪三酚(3，5，4'-trihydroxystibene)，分子式是C14H12O3，相对分子量为228.25，属于非黄酮类多酚化合物，于1940年首次从毛叶藜芦(veratrumgrandiflorum)的根部分离获得。近年来的研究发现，Res广泛存在多种植物中，以中药植物虎杖中含量较为丰富。研究还证实，Res对人体具有调节脂类代谢、防止低密度脂蛋白氧化、清除自由基、抑制血小板聚集、保护心脑血管和抗炎、抗过敏与抗肿瘤等多种药理作用[6]；而且，Res为天然化合物，无毒副作用，故其药用价值极大，已引起了全世界科研人员的高度关注。本研究通过观察Res对胰腺癌MIAPaCa-2细胞体外增殖的影响并探讨其初步机制，旨在进一步认识该药的药理作用，为进一步利用开发该类药物提供实验依据。
3.2 Res对MIAPaCa-2细胞的增殖的影响 肿瘤对药物敏感的实验分为体内实验和体外实验两种，体外实验是体内实验的基础。本实验通过MTT法检测到Res对MIAPaCa-2细胞有显著增殖抑制作用，25μmol·L-1 Res对胰腺癌MIAPaCa-2细胞增殖抑制作用已经相当明显，作用72 h平均抑制率已达29.48%；当浓度提高到200μmol·L-1时，作用24 h、48 h、72 h其平均抑制率分别为45.41%，58.17%，76.04%。可见Res对胰腺癌MIAPaCa-2细胞的增殖抑制作用基本上呈时间、浓度依赖性。本实验为了进一步为Res体外对MIAPaCa-2细胞的增殖抑制作用提供形态学支持并探讨其初步作用机制，采用倒置显微镜和透射电镜对细胞形态进行了观察，结果证实Res作用后，胰腺癌细胞数目减少，并存在明显的细胞凋亡。而且，25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1 Res组凋亡率呈浓度依赖性(P
综上所述，Res体外可显著抑制胰腺癌MIAPaCa-2细胞的增殖，诱导凋亡是Res抑制胰腺癌MIAPaCa-2细胞增殖的重要机制，且诱导凋亡作用呈浓度依赖性。凋亡是细胞自身调节的一个程序性死亡过程，它不引起炎症反应，机体亦不会因此而引发不良现象。Res诱导胰腺癌MIAPaCa-2细胞凋亡进一步说明，它对治疗胰腺癌可能有着很好的应用前景；而且，由于Res是天然化合物，在自然界分布极广，目前体内实验又未发现任何毒副作用，为理想的天然抗癌药物。目前有关Res抗癌作用的机制研究进展很快，但多数还限于实验室阶段，如能彻底了解其抗癌机制，将会使该药物有更广阔的临床价值。
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白藜芦醇范文第7篇
【关键词】 白藜芦醇 细胞凋亡 白血病
ABSTRACT: Objective To explore the antileukemia effects of resveratrol on three leukemia cell lines HuT78， Jurkat and L1210 in vivo. Methods MTT colorimetry was used to measure the tumor cell growth repression rate. The level of Bcl2 was measured by Western blotting. The cell cycle of cells was analyzed by flow cytometry. The expression of pSTAT3 was determined by immunohistochemistry. Results Our findings indicated that resveratrol could inhibit proliferation， induce apoptosis， and influence cell cycle of HuT78， Jurkat and L1210 cells in a dose and timedependent manner and reduce the expression of pSTAT3 in vitro. Conclusion Resveratrol might have a chemotherapeutic potential for leukemia of various sources and reduce the expression of pSTAT3 which provides experiment evidence for its application in clinical treatment of leukemia.
KEY WORDS: resveratrol; apoptosis; leukemia
白血病是一种常见的造血组织恶性疾病，起源于造血干细胞的基因突变，化疗是目前治疗本病的主要手段。但是，化疗药物治疗白血病时往往也杀伤正常细胞，给机体的正常组织器官，特别是对骨髓和消化道造成功能性或器质性的损伤。此外，对化疗药物的耐受性也是白血病化疗失败的主要原因之一[1]。因此，迫切需要找到治疗白血病等全身性肿瘤的更好办法。祖国医学对肿瘤早有认识，主张辨证施治，强调整体观念。中药既能直接杀伤肿瘤细胞，也可以扶正固本、提高机体自身的抗肿瘤能力。本实验选用的反式白藜芦醇(transresveratrol)取自陕西地区中药虎杖，其有效成分白藜芦醇的提取率较高[2]。白藜芦醇化学名称芪三酚，属非黄酮类多酚化合物，是植物为抵抗外界刺激如紫外线、真菌、病毒感染或机械损伤而产生的一种植物抗毒素。虽然白藜芦醇的抗肿瘤作用已经在诸多细胞系中得到证实，但是具体应用剂量在不同的研究中存在较大差异。本研究选择3种不同来源的细胞白血病细胞株作为研究对象，采用多种研究方法，以图较为科学、全面地探讨白藜芦醇抗白血病作用及其可能的分子机制。
1 材料与方法
1.1 试剂与细胞 白藜芦醇(纯度98.36%)购自陕西赛德生物股份有限公司；MTT购自Sigma公司；RPMI 1640、 胎牛血清(FCS)购自Gibco公司；抗人(鼠)Bcl2抗体购自Labvision公司；抗鼠(人)pSTAT3多克隆抗体购自Santa Cruz公司；Annexin VFITC试剂盒购自晶美生物工程有限公司；小鼠淋巴细胞白血病细胞株(L1210)由西安交通大学生命科学与技术学院王一理老师惠赠；人皮肤T细胞淋巴瘤(HuT78)、人T淋巴细胞白血病细胞株(Jurkat， Clone E61)由西安交通大学医学院第一附属医院陈颖老师惠赠。
1.2 形态学观察 37℃、5%(体积分数)CO2培养箱，含10%(体积分数)胎牛血清的完全1640细胞培养基培养细胞。传代时，800r/min离心5min，收集细胞悬液。按1∶3或1∶4分入新的培养瓶中，再加入适量1640完全培养基。锥虫蓝染色法活细胞计数>95%后，于Nikon TMSF倒置显微镜下观察各白血病细胞在白藜芦醇作用前后的形态、结构及数量的变化。
1.3 苏木素伊红(HE)染色 0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25、50、100μmol/L白藜芦醇处理细胞12、24、48h后，涂片，HE染色观察白血病细胞的凋亡情况。
1.4 MTT比色法进行细胞增殖分析 将细胞以完全RPMI 1640培养基配成5000个/mL细胞悬液，按照文献[3]方法进行白血病细胞增殖分析，同时设小鼠成纤维细胞3T3作正常细胞对照。
1.5 流式细胞术分析细胞周期 各组细胞培养24h，换含0.5%(体积分数)血清的RPMI 1640培养基同步化12h[4]，调细胞浓度为1×105个/mL细胞悬液。实验组加3mL含白藜芦醇的培养基，对照组加等体积培养基，5%(体积分数)CO2，37℃，培养6h。PI染色后在FACSCalibur型流式细胞仪上测定。
1.6 磷脂酰丝氨酸外翻分析 调细胞浓度为1×105个/mL细胞悬液。实验组加含白藜芦醇的培养基，对照组加等体积培养基，5%(体积分数)CO2，37℃，分别培养12、24、48h。FITC标记的AnnexinV和PI染色后立即用激光共聚焦显微镜和FACScan流式细胞仪检测。
1.7 Western检测Bcl2蛋白的表达水平 提取细胞总蛋白，调蛋白质量浓度至2mg/L。SDSPAGE电泳，半干法转膜1.5-2h。加入Bcl2单抗(TBST 1∶200稀释)，HRP标记的二抗(TBST 1∶5000稀释)，ECL法检测，图片扫描并且定量分析。以βactin作内标参考。
1.8 SP法检测HuT78、Jurkat、L1210细胞pSTAT3的表达 实验步骤依据试剂盒说明。其中pSTAT3抗体为1∶100稀释，DAB显色、苏木素复染，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。阴性对照以0.01mol/L PBS代替一抗。在排除非特异性染色的情况下，以胞膜或胞质出现棕黄色连续或灶性颗粒性状分布为阳性表达。按照胞质和胞膜有无棕黄色染色及染色程度分为：(-)无阳性或阳性细胞70%。
1.9 统计学处理 所有数据均用SPSS13.0统计软件进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析(one way ANOVA)，方差不齐组经数据转换后再行方差分析；两样本间比较以Bonferroni t检验。以P
2 结果
2.1 白血病细胞HuT78、Jurkat、L1210的形态学改变 0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25、50、100μmol/L白藜芦醇分别作用HuT78、Jurkat、L1210细胞12、24、48h，细胞形态发生较大改变，呈一定的时间、剂量依赖性。药物处理后，可见细胞数量减少、部分胞体缩小、胞膜皱缩、胞间隙增大、胞质中出现大小不等的不规则空泡(图1)。
2.2 细胞凋亡情况 经HE染色后，光镜下观察其形态。对照组细胞体积较大，细胞呈圆形，透光性好，核大而明显，核仁清楚，胞浆少，核质比高。经白藜芦醇处理后，白血病细胞数量减少，细胞皱缩，核直径减小，核仁减少或消失，核染色质浓集呈紫蓝色致密的球状或呈圆形分布于核膜下，胞浆皱缩、嗜碱性增加(图2)。
2.3 白藜芦醇对白血病细胞的生长抑制作用 白藜芦醇作用不同时间后，3种白血病细胞HuT78、Jurkat和L1210均受到不同程度的生长抑制，且呈一定的时间－剂量依赖性(图3A-图3C)。同等条件下，白藜芦醇对L1210细胞的抑制作用最强，生长抑制率最高可达66.17%；对HuT78及Jurkat细胞的生长抑制率最高分别为62.24%、45.98%。虽然白藜芦醇对这3种白血病细胞具有明显的抑制作用，但是并不影响正常细胞的生长(图3D)。经统计分析，各白血病细胞与正常3T3细胞相比均有显著性差异(P
图1 100μmol/L白藜芦醇处理24h时各组细胞的形态学变化（略）
Fig.1 Morphological changes of cells treated with 100μmol/L resveratrol for 24h (×400)
A: HuT78 cells; B: Jurkat cells; C: L1210 cells
图2 100μmol/L白藜芦醇处理24h后各组白血病细胞的凋亡情况（略）
Fig.2 The apoptosis of tumor cells treated with 100μmol/L resveratrol for 24h (HE ×400)
A: HuT78 cells; B: Jurkat cells; C: L1210 cells
图3 MTT法分析白藜芦醇对白血病细胞的生长抑制作用（略）
Fig.3 Inhibition of growth of resveratrol determined by MTT assay
A: HuT78 cells; B: Jurkat cells; C: L1210 cells; D: mouse fibroblast 3T3 cells
2.4 白血病细胞周期的分布 流式细胞分析显示，白藜芦醇处理组较对照组G0/G1期细胞由34.93%减至30.12%，S期细胞由41.14%上升至49.17%(HuT78)；Jurkat细胞各周期未见显著变化；L1210细胞主要为S期改变：由59.02 %上升至65.57%，细胞被明显阻滞在S期(图4)。
图4 PI染色观察白藜芦醇对细胞周期分布的影响(培养6h)（略）
Fig.4 Resveratroinduced cell cycle perturbations and apoptosis in HuT78， Jurkat and L1210 cells cultured for 6h. Cells stained with PI
A， C， E: control cells incubated without resveratrol; B， D， F: HuT 78， Jurkat and L1210 cells treated with 50μmol/L resveratrol， respectively
2.5 白藜芦醇对白血病细胞凋亡的影响 激光共聚焦显微镜观察到50mol/L处理12h后，约25%L1210细胞发生早期凋亡，培养48h后，几乎所有的细胞都发生了凋亡或坏死(图5)。流式细胞术分析可见(图6)，100mol/L白藜芦醇作用12h，大多数HuT78细胞都发生了细胞凋亡(84.33%)；Jurkat细胞和L1210细胞的凋亡率分别为41.99%和50.94%。因此，同样条件下，白藜芦醇对HuT78细胞与L1210细胞的促凋亡作用强于对Jurkat细胞。
2.6 Bcl2蛋白的表达水平 本研究通过蛋白印迹法分析了不同浓度白藜芦醇对3种白血病细胞抗凋亡蛋白Bcl2的表达情况。与对照相比，白藜芦醇能明显降低HuT78、Jurkat与L1210细胞Bcl2蛋白的表达水平，且呈剂量依赖性(图7)。
图5 激光共聚焦显微镜观察50μmol/L白藜芦醇处理L1210细胞的形态变化（略）
Fig.5 The morphology of apoptotic cells treated with 50μmol/L resveratrol (×20)
A: 12h; B: 48h
图6 流式细胞术分析100μmol/L白藜芦醇处理12h时的细胞凋亡情况（略）
Fig.6 The apoptotsis of different cells treated with 100μmol/L resveratrol for 12h by flow cytometric analysis
A: HuT78 cells; B: Jurkat cells; C: L1210 cells
2.7 HuT78、Jurkat、L1210中pSTAT3蛋白的表达
pSTAT3在白血病细胞中表现为细胞质或细胞核呈棕黄色或含棕黄色颗粒，阳性表达>70%。细胞经白藜芦醇处理后免疫细胞化学结果显示，pSTAT3的表达水平显著下降(P
图7 不同剂量白藜芦醇处理48h后，HuT78、Jurkat和L1210细胞Bcl2蛋白的表达情况（略）
Fig.7 The relative expression level of Bcl2 in HuT78， Jurkat and L1210 cells treated with different doses of resveratrol for 48h
图8 白藜芦醇对HuT78、Jurkat和L1210细胞中pSTAT3表达的影响（略）
Fig.8 The expression of pSTAT3 in HuT78， Jurkat and L1210 cells
A: pSTAT3 in HuT78; B: pSTAT3 in HuT78 treated with 100μmol/L resveratrol for 24h; C: pSTAT3 in Jurkat; D: pSTAT3 in Jurkat treated with 100μmol/L resveratrol for 24h; E: pSTAT3 in L1210; F: pSTAT3 in L1210 treated with 100μmol/L resveratrol for 24h
3 讨论
本研究通过体外细胞培养，观察了不同浓度白藜芦醇对L1210、HuT78、Jurkat细胞的效应。白藜芦醇处理后，各组细胞都出现不同程度的形态学改变与细胞凋亡。比较3种白血病细胞可见，白藜芦醇对L1210 与HuT78细胞的生长抑制作用与促凋亡效应强于对Jurkat细胞。而且白藜芦醇在发挥对白血病细胞毒作用的同时，并不影响正常细胞的生长。鉴于抗肿瘤化疗药物往往都对正常细胞造成非特异性杀伤[5]，而从中草药或天然植物中提取的白藜芦醇不但具有良好的抗肿瘤效应，而且对正常细胞无明显的细胞毒作用。因此，对免疫缺乏人群具有更为重要的应用价值[6]。
在这些工作的基础上，本研究继续深入探讨引起3种白血病细胞凋亡可能的作用机制。Western Blot实验结果显示，HuT78、Jurkat与L1210细胞中均有抗凋亡蛋白Bcl2的高水平表达。体外研究显示，Bcl2表达增加可见于滤泡型淋巴瘤、白血病等血液系统恶性肿瘤，明显延长白血病细胞的生存时间。Bcl2通过广泛抑制各种刺激剂诱导的细胞凋亡、延长细胞活力而发挥生物学作用。此外，Bcl2家族还与白血病的多药耐药有关。高表达的Bcl2能使白血病细胞抵抗一些化疗药物所诱导的细胞凋亡，导致白血病细胞对化疗药物不敏感、预后差[78]。本研究结果提示，下调Bcl2蛋白表达可能是白藜芦醇诱导白血病细胞凋亡的机制之一。
越来越多的研究发现，相当一部分血液系统疾病的发生与造血调控异常有关。白血病是发生于造血干细胞的恶性克隆性疾病，JAK/STAT(signal transducers and activators of transcription，信号转导子和转录激活子)通路的持续激活与白血病细胞的增殖异常、凋亡受阻及分化障碍密切相关[910]。STAT家族是一组DNA结合蛋白，与酪氨酸磷酸化信号通路偶联，发挥转录调控作用，介导多种生物学效应，在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。研究证实，激活的STAT3信号能够将酪氨酸激酶信号进行整合，通过与DNA作用元件结合，激活与生长增殖有关的基因转录或者增加抗凋亡蛋白(如Bcl2)的表达，从而影响细胞存活和生长增殖，最终引起癌变。本研究发现，3种白血病细胞中均有较明显的STAT3酪氨酸磷酸化阳性表达，白藜芦醇能剂量依赖的减弱细胞中pSTAT3的表达。提示它能通过下调STAT3的酪氨酸磷酸化活性，使其下游靶基因蛋白Bcl2表达受阻，从而抑制白血病细胞的生长增殖、促进细胞凋亡。
许多抗肿瘤药物可以诱导肿瘤细胞周期阻滞，提示细胞周期阻滞在肿瘤细胞凋亡中能够发挥一定的作用。为研究白藜芦醇对白血病细胞增殖抑制作用的具体机制，本研究进一步观察了白藜芦醇处理后各组白血病细胞周期分布的变化。白藜芦醇对各组白血病细胞周期的影响与其增殖抑制效应密切相关。HuT78、L1210细胞出现明显的S期阻滞，Jurkat细胞的各周期未见显著性变化。实验结果可能与白藜芦醇对核苷酸还原酶和DNA聚合酶的抑制作用有关，因为这两种酶都是DNA合成过程中的关键酶，对于细胞通过S期至关重要[11]。白藜芦醇能通过干扰DNA复制，发挥对白血病细胞的增殖抑制作用。至于为什么3种白血病细胞接受同样作用后却产生了不同的结果，可能由于白藜芦醇对细胞周期的多个环节均有作用[12]，在不同细胞系，白藜芦醇发挥作用的具体途径可能并不一样。目前，对于白藜芦醇究竟如何影响细胞周期，各国科学家尚未达成共识。因此，有必要进一步深入研究，揭示白藜芦醇抗肿瘤作用的确切分子机制。
目前，关于白藜芦醇诱导细胞凋亡的报道有一些相互矛盾的结论。有研究表明，白藜芦醇的促凋亡作用可能涉及p53依赖/p53非依赖途径、线粒体途径、NFκB信号通路等多种机制[1314]。但是，与促凋亡作用相反。也有学者发现，白藜芦醇能明显抑制受放射线照射小鼠的脾细胞凋亡，提高脾脏凋亡抑制基因Bcl2的表达水平，阻止细胞凋亡的发生[1516]。造成这些相互矛盾结果的原因可能是细胞内对白藜芦醇发挥作用的受体具有不同水平，或者白藜芦醇在不同的细胞中具有不同的新陈代谢，以及不同的检测体系导致不同细胞对同一凋亡诱导剂的反应能力有所不同。细胞信号转导网络的交互性或许可以解释白藜芦醇诱导凋亡作用与抑制凋亡作用的矛盾。
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白藜芦醇范文第8篇
关键词：肝癌；Ras相关区域家族1A；甲基化
肝细胞癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一[1， 2]。近年来DNA甲基化在肝癌的发病过程中日益受到重视，在DNA甲基转移酶（DNMTs）的作用下，胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶（CpG）[3]。DNA异常甲基化可导致多种癌基因的激活和（或）抑癌基因的失活，与多种肿瘤的发生密切相关[4]。藜芦醇是广泛存在于各类植物中的一种天然多酚，研究显示其具有多重药理作用，包括心肌保护，抑制血小板凝集，抗炎、抗氧化作用以及血管舒张等。此外，白藜芦醇也能通过多种机制调节肿瘤细胞的增殖，侵袭以及凋亡，因此是一种潜在的高效肿瘤预防药物[5]。但其对肝癌细胞具有何种作用仍然不清楚。本研究旨在观察Rev能否影响肝癌HepG2细胞系中RASSF1A基因的表达和甲基化，以此为肿瘤肝癌的预防提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
白藜芦醇（纯度98%）为sigma产品；RASSF1A引物和其亚硫酸氢盐转化启动子区购于Integrated DNA Technology. M. SssI 甲基酶、S-腺蛋氨酸（3.2mmol/L）、10×保温缓冲液购于New England Biolab Inc，其余分析纯试剂主要购自生海生物工程有限公司。
1.2 细胞培养与活性研究
人肝癌细胞系HepG2用含10%牛胎儿血清、100U/mL的青霉素以及100U/ml的链霉素的DMEM培养基（pH7.4）中在37℃、5% CO2条件下培养。实验前将细胞密度调整至105/mL。实验分为阴性对照组和白藜芦醇处理组。其中对照组加入等量的DMEM培养基（含终浓度低于0.1%的DMSO）。处理组加入不同浓度的白藜芦醇在37℃下处理实验细胞24～72h。随后用于MTT分析，并计算抑制率。抑制率=（对照组OD值-实验室OD值）/对照组OD值×100%。
1.3 Western blot与甲基化活性分析
细胞处理完毕后，离心（
1.4 DNA提取和水解
获取1×107个Rev处理后的HepG2细胞，按照DNeasy Tissue kit （Qiagen）试剂盒操作步骤提取基因组DNA用于全细胞甲基化分析。DNA水解方法根据参考文献提供的方法进行[6]。
1.5 高效液相色谱- 电喷雾质谱检测
液相色谱包括HPLC 系统，色谱柱和预柱。流动相为0.1%甲酸-甲醇，流速为0.2 mL/min。电喷雾离子模式为正离子，扫描范围为m/z 100～2 000， 离子源温度450℃， 喷雾电压为415 kV，破簇电压为55 V，入口电压6 V。采用Sciex Analyst software软件处理数据。
2 结 果
2.1 Rev增加HepG2细胞RASSF1A mRNA和蛋白表达
如图1所示，HepG2细胞基础状态下RASSF1A表达水平较低，而经10 μmol/L 和30 μmol/L Rev处理后，能显著增强RASSF1A蛋白的表达。
图1. Rev对HepG2细胞RASSF1A mRNA和蛋白表达的影响
1.对照组；2.10 μmol/L Rev；3.30 μmol/L Rev
2.2 Rev能降低RASSF1A启动子区域以及全基因组和细核DNA甲基化以及DNMT1表达水平
高效液相色谱- 电喷雾质谱结果显示，30 μmol/L Rev处理HepG2细胞后，与对照组相比， RASSF1A启动子甲基化水平降低至32%，全基因组甲基化水平降低44%，与对照组相比，差异有统计学意义（P
2.3 Rev对肝癌细胞增殖的影响
HepG2细胞经Rev处理后，其增殖活性收到一定程度的抑制。其中10和30 μmol/L Rev作用后，细胞存活率降至36%和24%（P
3 讨 论
有证据表明Rev可能是肝癌的一种有效的预防和治疗剂。但是，Rev发挥作用的分子机制仍然不清楚。本研究中，我们首次证实Rev能上调肝癌细胞中因甲基化而失活的RASSF1A基因 mRNA和蛋白的表达。同时，RASSF1A的激活还与降低其启动子甲基化有关。此外，本研究也发现Rev对HepG2细胞增殖具有抑制作用。因此，Rev可能通过抑制DNA甲基化，从而抑制肝癌生长增殖。本研究发现Rev能在一定程度上抑制DNMT1的表达，从而通过降低RASSF1A启动子甲基化从而重新激活RASSF1A，这可能是其化学预防肝癌的一种新的分子机制。一些超甲基化沉默的抑癌基因，如GSTP1和MGMT，已经被认为在肝癌和其他癌细胞系中被外源性因素重新激活。这说明Rev能诱导DNA去甲基化以及重新激活由此沉默的抑癌基因。
尽管白藜芦醇具有多方面的正向生物学效应，但其在体内的转运和分布仍不清楚，由于它水溶性很低，因此白藜芦醇必须与相关蛋白结合后才能在血清中保持较高的浓度[7]。此外，对于治疗性的药物而言，其与转运蛋白的结合能力直接决定了其疗效。因此对于临床肝癌的治疗，其制作工艺还有待进一步完善以提高其药理动力学效应。
参考文献：
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