基因治疗
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基因治疗范文第1篇
关键词: 胃肿瘤;肿瘤基因;基因疗法;述评
中图号:R735.2
引言
肿瘤发生的直接原因是基因的改变，致使正常细胞转变成肿瘤细胞，癌基因的激活与抑癌基因的失活起了重要作用.近年来与胃癌发生有关的癌基因和抑癌基因受到重视，如何扭转或恢复癌基因或抑癌基因的异常改变也成为防治胃癌的研究热点.
1 胃癌相关基因
1.1 癌基因
已知与胃癌相关的癌基因有:c-myc，ras，hst，c-erbB-2，k-sam，n-myc，met，p53（突变型）等.它们通过点突变、扩增或易位在肿瘤的启动、促癌以及进展阶段过度表达，引起胃粘膜上皮细胞转化和无限制的增殖，最终导致胃癌的形成、发展和转化.在各种癌基因中ras基因特别是h-ras基因与胃癌的关系比较密切，其所编码的蛋白质rasp12具有调节细胞生长和分化的功能，它的异常表达对细胞恶变和胃癌的恶性表形起着重要作用.此外，还有一些分子对胃癌细胞的增殖、分化、转移等恶性行为有关.如增殖细胞核抗原（PCNA）、端粒酶、转化生长因子-β1 （TGF-β1 ）、免疫抑制酸性蛋白（IAP）等.
1.2 抑癌基因
抑癌基因存在于正常细胞中，是细胞正常增殖的稳定因素，Rb基因是最早发现的人体抑癌基因.此后陆续发现了多种抑癌基因，和胃癌有关的有p53，DCC，APC，MCC等.p53基因是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的基因，定位于17号染色体短臂上.野生型p53基因在细胞损伤修复过程中，监视着基因组DNA的完整性.当细胞受到射线或某些药物作用而发生DNA损伤时，p53基因所编码的蛋白能使细胞分裂停止在G1/S期，使细胞充分修复DNA的损伤使之恢复正常.倘不能恢复，野生型p53基因还能启动细胞的凋亡过程从而引导细胞的程序性死亡，阻止具有癌变倾向的突变细胞出现.但野生型p53基因很容易发生突变，转变成突变型p53基因.突变型p53基因不但丧失了抑制肿瘤发生的作用，反而具有致癌作用，成为癌基因.定位于18号染色体长臂的DCC基因，定位于5号染色体短臂的APC基因和MCC基因也是近年来发现的抑癌基因，它们的缺乏或突变常见于结、直肠癌，也可在胃癌中发现.此外nm23和p16基因也被认为是肿瘤抑制基因.
2 基因治疗
利用分子遗传学技术干预靶细胞的有关基因，从而使肿瘤的发生和生长受到控制的基因治疗方法是近年来研究的热点之一.基因治疗的策略大致有:①原位修复有缺陷的基因;②将抑癌基因导入肿瘤细胞;③应用反义核糖酸封闭mRNA，以抑制癌基因的表达;④将具有杀伤肿瘤细胞能力的细胞因子（如IL-2，TNF，IFN）基因导入肿瘤细胞或淋巴细胞，再将其注入肿瘤患者或荷瘤动物;⑤将自杀基因导入肿瘤细胞，例如把单纯疱疹病毒的胸苷激酶（HS-TK）基因转染肿瘤细胞，使癌细胞对抗肿瘤药羟甲基无环鸟苷敏感，然后用该药杀灭肿瘤细胞.近年来，笔者等曾对胃癌细胞株及裸鼠体内的移植性胃癌进行了基因治疗的实验观察，初步实验结果简述如下.
2.1 野生型p53基因转染胃癌细胞
SGC7901胃癌细胞转染了野生型p53的cDNA之后称为SGC7901/Wt.p53细胞，与未经转染的CGC7901相比，其生长速度减慢，细胞倍增时间延长，细胞形态也有改变.胞体变小，胞核固缩，核内染色质凝集成团块状或呈边集现象，并呈现凋亡征;流式细胞仪的分析图上出现凋亡细胞峰.裸鼠体内移植瘤的实验表明SGC7901/Wt.p53细胞致癌率明显降低，成瘤后其生长速度减慢，与对照组比较，肿瘤体积明显细小，荷瘤动物存活时间也明显延长.
2.2 脱氧胸苷激酶（TK）基因转染胃癌细胞将TK基因转染SGC7901胃癌细胞
由于TK的表达产物可使羟甲基无环鸟苷（GCV）变为细胞毒性物质，以杀死肿瘤细胞，原来对GCV无反应的SGC7901经转染了TK基因后可被GVC杀伤.试管内实验荷瘤裸鼠体内试验证明GCV对其具有杀伤和抑制作用.
2.3 PCNA的反义转染胃癌细胞
增殖细胞核抗原是DNA聚合酶的辅助因子，为DNA合成所必需.它在DNA复制、细胞增殖及细胞周期调控过程中发挥了重要的作用.利用RCNA的反义RNA可抑制PCNA的表达，从而改变肿瘤的恶性行为.当SGC7901胃癌细胞被转染了PCNA反义RNA后，其生长速度减慢，并出现细胞变性、坏死及凋亡.裸鼠移植试验证明，肿瘤形成缓慢，瘤体缩小.
2.4 端粒酶反义RNA转染胃癌细胞
端粒酶存在于各种恶性肿瘤细胞中，它具有复制染色体末端DNA，延长端粒长度和维持细胞增殖能力的作用，它的活化是恶性肿瘤细胞无限制增殖的重要基础.根据作者的观察，在38例胃癌、29例癌前病变、38例临近胃癌的正常胃组织和3例胃癌细胞系中，端粒酶活 性表达率分别为84.2%，17.2%，5.2%和100%.实验证明将端粒酶反义RNA转染SGC7901胃癌细胞后，出现细胞变性、坏死、凋亡等现象.其产生胃癌相关抗原（MGB2Ag）的能力下降，端粒长度短，细胞生长速度减慢，在裸鼠体内致癌性降低.
2.5 周期蛋白DI反义RNA转染胃癌细胞
周期蛋白（cyclin）D1在细胞周期的调控中具有重要作用，它能够缩短细胞周期，促进细胞增殖及导致细胞癌变.Cyclin D1基因位于11号染色体长臂，被视为一种癌基因，将cyclin D1的反义RNA转染CGS7901胃癌细胞系后，可使细胞倍增时间延长，处于G0/G1期的细胞增多而处于S期的细胞减少，对裸鼠的致癌能力也下降.
2.6 针对cerbB2特异性核酶基因转染胃癌细胞
基因治疗范文第2篇
关键词：肺癌；基因治疗；非病毒载体
中图分类号：R734.2文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007) 05-0042-04
Application of Nonviral Gene Vectors in Gene Therapy of Lung Cancer
YE Jie-sheng, ZHANG Na, ZOU Wei-wei, Wang Ju-tao
(School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Jinan 250012, China)
Abstract：This paper briefly reviews the general principles and development of gene delivery with emphasis on the recent developments in the arena of lung cancer using nonviral (naked DNA, polycationic polymers, cationic liposomes) vectors. Employing gene transfer techniques to achieve therapeutically useful levels of expression of therapeutic gene in the lung could provide a new strategy for the treatment of lung cancer.
Key words：lung cancer; gene therapy; nonviral vectors
尽管肺癌的诊断和治疗取得了进展，但近5年来癌症的存活率只有14%，仅略高于20世纪60年代早期的8％ [1]，多数晚期肺癌患者最终只能选择放弃治疗。现行肺癌治疗方案存在的主要问题是缺乏肿瘤特异性而产生毒副作用，因此，基因疗法作为未来癌症治疗策略引起了越来越多的关注。基因治疗的关键技术是基因传递载体的选择。基因传递载体可分为2类：病毒载体（逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒等）和非病毒载体（裸DNA、聚阳离子聚合物、阳离子脂质体等）。采用病毒型基因载体虽取得了一定的成效，但有缺陷，包括基因突变、致癌作用以及免疫反应使基因表达过于短暂等。此外，病毒载体还受插入病毒基因组外源基因大小的限制。而非病毒基因传递系统凭借其低毒性、低免疫原性和较易制备等优点有望成为体内基因治疗的理想载体。基因载体技术的快速发展使非病毒基因治疗手段更加适用于死亡率高的疾病如肺癌等。现对目前用于介导肺癌基因治疗的主要非病毒基因载体作一介绍。
1裸DNA
非病毒基因传递系统研究中最简单的方法就是直接使用的质粒DNA进行基因转染。自从Wolff等最先证明骨骼肌可被DNA转染以来，裸质粒DNA注射介导外源基因转移和表达已被广泛应用。质粒具有制备简便、廉价且安全性较高等优点，然而，质粒转染率通常较低且基因表达短暂。实验证明，采用快速注射和电穿孔技术对肺癌施行基因治疗能够提高药物的药效，从而在一定程度上弥补直接使用裸DNA转染的不足。
1.1快速注射技术
快速注射技术是近年在基因治疗领域应用相对广泛的一种无针注射技术。Walther 等[2]在患有路易士肺癌的小鼠肿瘤部0.30 Mpa压力下快速注射3~5 mg质粒DNA，结果显示，注射48 h后 LacZ 或GFP中度表达，72，96 h后上述高度表达。同时注射TNF-α和载体携带的LacZ，在注射24，48，72，96和120 h后肿瘤组织中均能有效的表达和分泌细胞因子与LacZ。
1.2电穿孔技术
20世纪60年代提出的电穿孔术是一项通过控制电场强度使细胞通透性增加的技术，1988年首次用于将基因导入肺上皮细胞。为了提高非病毒载体在肺部基因转染的水平，Dean等[3]将电穿孔术用于肺部，结果表明，电穿孔术能将裸DNA导入肺中，安全有效并为以后的肺靶向基因治疗奠定了基础。有报道，采用基因枪[4]或结合核酸酶抑制剂[5] 治疗肺癌也能够获得较高的基因表达。
2阳离子聚合物
采用裸质粒DNA作为基因转移载体的方法尽管简便易行，但也有缺陷，例如穿透细胞能力弱，很难有效地转入细胞核，能被质粒转导的肿瘤细胞数量和比例小。因此，它极易被组织清除，难以全身转运。为了提高基因转染率，许多可用于体内实验的新型阳离子聚合物载体相继问世，常见的有聚乙烯亚胺、多聚赖氨酸和壳聚糖。
2.1聚乙烯亚胺
聚乙烯亚胺（PEI）是首个用于组织培养和体内试验的阳离子聚合物。PEI最显著的特点是携带较高的正电荷密度。PEI的每3个原子中就有1个能质子化的氮原子，从而使PEI中的正电荷密度达到20~25 μeq/g [6]。Abdallah等指出，PEI的体内转染率受到相对分子质量的影响，还发现，相对分子质量为25 000的PEI的转染率比相对分子质量大的高。PEI在体内能有效地将DNA运送至肿瘤组织，尽管有报道，PEI能够有效地通过静脉注射[7]，瘤内注射[8]或者微泵给药用于癌症的体内治疗，然而，通过吸入给药的基因传递可能更适用于肺部疾病的治疗，因为它能到达更大的表面积并且避免其它系统给药方式的风险[9]。
有学者用含有鼠IL-12基因的PEI气雾剂（PEI/IL-12，600 μL PEI 和2 mg IL-12）连续2周治疗骨肉瘤肺部转移的小鼠，每周给药2次，结果显示，IL-12中的p35 和p40亚基在小鼠肺部高度表达而肝脏不表达。此气雾剂单剂量给药24 h后IL-12 的mRNA表达最高，持续监测7 d该表达逐渐减弱。用气雾剂治疗6周后，血浆中未检测到IL-12蛋白质，接受气雾剂治疗的小鼠肺部肿瘤数量显著减少[10]。因病毒载体含有能靶向于细胞核受体的特异蛋白质，因此，很多来源于病毒蛋白质的多肽用于增强质粒的转运。同样，为了提高基于PEI处方的转染率和靶向效率，PEI也常连接特定的病毒蛋白质。研究表明，与HIV-1 TAT蛋白转导区相关的寡肽能够通过共价键与PEI和PEG结合形成TAT-PEG-PEI结合物。有学者研究了结合DNA的PEI和TAT-PEG-PEI聚合物在体外（A549细胞）和小鼠气管滴注给药的转染率。结果显示，在A549细胞中使用TAT-PEG-PEI（0.2 ng/mg蛋白质）时荧光素酶的表达比使用PEI（2 ng/mg）时低，但在小鼠体内采用TAT-PEG-PEI的转染率明显高于PEI[11]。此外，PEI与某些配基（如单糖）接合后能够增强对特定细胞的靶向性。Kim等[9]研究发现，将含有葡萄糖基化的PEI，重组质粒 pcDNA3.0-磷酸酶和除去张力蛋白的10号染色体（PTEN）的复合物通过鼻吸入方式为肺癌模型小鼠给药，结果表明小鼠肺部的PTEN蛋白高度表达。
2.2多聚赖氨酸
多聚赖氨酸（PLL）及其衍生物是广泛用于基因传递的阳离子多肽。为了获得较高的转染率，多聚赖氨酸及其衍生物常与氯喹、受体交联剂一起使用，或者共价结合泊洛沙姆、PEG 和棕榈酰等。而且，多聚赖氨酸能提高病毒介导的基因转染率。当表皮生长因子-多聚赖氨酸结合物和DNA的复合物与几种不同的肺癌细胞株进行孵育时，在含有内体溶解试剂的情况下，基因表达水平提高。
2.3壳聚糖
与结构复杂的合成非病毒基因传递载体（PEI，PLL）不同，壳聚糖是仅含有少量多聚阳离子的天然物质。它通过几丁质在碱性条件下脱乙酰基获得，具有无毒，生物相容性好，生物可降解等特点，并且能与DNA形成聚合电解质络合物[12]。因而，壳聚糖及其衍生物有望成为安全有效的阳离子基因载体。用壳聚糖制成的基因干粉剂是一种有效的肺部基因传递系统。N/P比值为5的壳聚糖-pDNA粉末能将巨细胞病毒启动子（pCMV-Luc）溶液中荧光素酶的活性提高27倍。 这些结果表明，加入壳聚糖能抑制pDNA的降解，提高药物粉末产量[13]。尽管壳聚糖及其衍生物直接用于肺癌的基因治疗实验不多，但在此领域有很多基础性研究[13-16]。我们相信，采用天然壳聚糖对肺癌进行基因治疗是很有潜力的。
3阳离子脂质体
脂质体作为一种极具潜力的药物载体受到广泛关注。脂质体易于制备，具有很高的生物相容性并能负载多种药物，如DNA和诊断药物等。但是，通常采用的阴离子脂质体和中性脂质体由于受DNA在其囊泡中包封率的影响，其转染率不是很高。总的来说，这些脂质体的转染在体外有效，体内转染率却很低。由于阳离子脂质体粒子表面所带的正电荷能与带负电荷的细胞膜结合，因此在介导基因转染和传递方面引起关注。如果DNA-脂质体复合物的组成可控，基于阳离子脂质体的基因传递系统将会有效地用于基因传递。然而，有的学者认为，脂质体的粒径并不是表面电荷决定脂质复合物体外转染率的主要因素，而通过控制脂质复合物的理化性质（DNA与脂质体的比率）可以实现肺癌病灶特定部位的基因表达[17]。虽然在细胞培养中使用高剂量的阳离子脂质体可能会有毒性，但在人体中使用脂质体尚未见有毒性或炎症反应的报道[18]。Ramesh[19] 等阐述了一种改良的阳离子脂质体DOTAP-Chol，它能够有效地传递肿瘤抑制基因p53 和脆性组氨酸三联体基因（fragile histidine triad，FHIT），使它们集中在人原发肺癌和实验性转移病灶中，在前者25％的肿瘤细胞以及后者10％的肿瘤细胞中发现基因表达。当用DOTAP-Chol-p53 和 FHIT 复合物治疗时发现原发性和继发性肺癌的肿瘤生长均被有效抑制。与单一疗法相比，多联疗法中基因表达提高了2.5倍，疗效明显增加。辅助成分例如蛋白质，或者某些氨基酸能够提高基因效率并能促进对肺部的靶向选择性。当前的阳离子脂质体能通过静注给药，经皮给药，气管内给药等获得较高的转染率并能明显地浓集于肺部。而且，随着新型阳离子脂质的出现（如吡啶阳离子脂质），阳离子脂质体用于治疗肺癌显示出了很大的潜力。近年，脂质纳米粒也用于肺癌的基因治疗，结合基因DOTAP-Chol的使用已有报道。Ramesh[20]指出，DOTAP-Chol纳米粒能有效地将抑癌基因传递到原发性和转移的肺部肿瘤细胞，他们评估了纳米粒介导的人mda-7/IL-24基因在体内上述两种肺部肿瘤中的传递。证明DOTAP-Chol能有效地将mda-7/IL-24基因传递至病灶，最终导致肿瘤生长被抑制。虽然结合DNA的DOTAP-Chol纳米粒复合物是全身治疗的有效载体，但是，剂量依赖性炎症应答的引发导致其应用受限。Began等[21]发现，DNA-脂质纳米粒全身给药能在体内外引发多种与炎症有关的信号分子。使用对抗信号分子的小分子抑制物能够产生抑制作用从而降低炎症，但不影响所载基因的表达。
4展望
基因疗法很有希望成为攻克肺癌的重要手段。近期的肺癌临床前实验已取得了很有前景的结果，证实非病毒载体的转染率在细胞水平上有了很大的提高。然而，须首先对基因传递系统进行不断优化才能使非病毒基因最终安全有效地用于肺癌的治疗。在肺癌治疗的整个基因传递过程中包含很多步骤，应该充分了解各种非病毒载体的理化性质对每一步的影响。因此，对于非病毒载体介导的肺癌基因治疗的安全性及表达机制的研究仍然是任重道远。
参考文献
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基因治疗范文第3篇
肿瘤基因治疗是用正常或野生型基因修正或置换肿瘤细胞的某些基因，或引入有治疗价值的其他来源基因，达到治疗肿瘤的目的。自杀基因治疗是肿瘤基因治疗方法之一，是将某些细菌、病毒和真菌中对药物敏感的基因转导人肿瘤细胞，此基因编码的特异性酶类又称为前药转换酶，能将原先对肿瘤细胞无毒或毒性极低的药物前体，在肿瘤细胞内代谢成毒性产物，提高肿瘤细胞对药物敏感性，从而杀死肿瘤细胞而不伤及正常细胞。因此，这类前药转换酶基因被称为“自杀基因”，又称前药敏感基因；自杀基因治疗又称为病毒介导的酶／药物前体疗法。
自杀基因有多种，目前研究应用较多的是单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／丙氧鸟苷(TK／GCV)系统。用这种自杀基因转染肿瘤细胞后，能够高特异性地抑制和杀伤肿瘤细胞而不出现明显的毒副作用。1986年，国际上首次报道TK基因用于治疗脑恶性肿瘤，取得了较好效果。2000年，德国完成了治疗多形性恶性脑胶质瘤的III期临床试验。随后，美国及日本等国家也分别报道了结肠癌、卵巢癌及前列腺癌等临床试验结果。我国李宁教授领导的团队利用TK自杀基因治疗肝癌的起步较早，目前已经完成了II期临床研究，显示出对肝癌细胞有较好的抑制和杀伤效果，大多数病人都能够很好耐受。
大家知道，癌症患者早期多没有症状，往往是在体检或就诊时偶然发现，初次诊断时就已经是中晚期，失去了手术治疗的最佳机会。随着肿瘤多学科综合治疗的日趋完善，对这些中晚期肿瘤可以通过术前化疗和术后新辅助治疗，提高治愈率，显著延长大部分患者的生存期。但是由于肝癌本身的生物学特性，其对放、化疗的敏感性较低而副作用非常突出，同时肝脏又是人体重要的代谢器官，放、化疗常常会使患者无法耐受，难以获得和其他肿瘤一样的治疗效果。肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，由于起病隐匿，发现晚，进展快，死亡率高，素有“癌王”之称。自杀基因治疗作为一种有效的生物治疗方法，由于其特异的分子靶向性和低毒性，在肝癌的治疗中发挥重要作用。
自杀基因治疗可以采取局部注射及动脉灌注等多种方式进行，其成功要点是如何有利于提高自杀基因对肿瘤细胞的转染效率。在以往的治疗过程中发现，自杀基因治疗通常会存在基因转染效率较低的情况，也就是说当基因注射到体内以后，真正到达肿瘤细胞内的基因数量有限，因此，对肿瘤细胞的抑制和杀伤就打了折扣。较好的选择是将自杀基因治疗和其他方法联合应用，达到最大限度地杀伤肿瘤细胞、激活免疫系统而保持正常组织功能的目的。由于自杀基因毒副作用较小，其联合应用适应疗比较广泛。对于早期肝癌，自杀基因的术前局部治疗及术后动脉灌注，可以最大限度地清除微小转移灶，防止肝癌的复发和转移，获得根治效果；对于中晚期肝癌，自杀基因可以联合射频及介入治疗，也可单独进行局部或肝动脉灌注治疗。基于肝脏强大的再生和代偿功能，有效的联合治疗可以明显延长患者的生存期，最终达到使肝癌成为人类慢性疾病的目标。
自杀基因治疗目前处于临床转化阶段，无论研究还是临床应用，都存在不少问题和困难。例如，如何检测体内有效的自杀基因浓度，特别是靶部位的有效浓度，对于定量评估自杀基因的疗效具有重要意义。此外，联合其他治疗的有效率也有待循证医学的证实。尽管如此，相信随着多学科综合治疗的日趋完善，在循证医学的指导下，肝癌自杀基因治疗将不断发展和完善，形成自杀基因的规范化治疗与个体化治疗的统一，为肝癌患者造福。
名词解释
基因治疗范文第4篇
关键词：基因治疗 心肌梗死 血管再生
1 概述
血管再生的基因治疗心肌梗死可分为单独基因治疗和基因联合细胞治疗[2]。两者主要采用诱导血管再生的方法，将具有促血管新生的蛋白或多肽经过载体包装并注射或灌注到目标区域，以促进微血管的再生；基因治疗主要是将含有相关基因的载体或其他物质直接注入心肌内[3]，不依耐细胞作用，隔段时间观察心肌修复及功能恢复情况[4]。基因联合细胞治疗主要是联合基因转染细胞，移植至梗死心肌，隔段时间观测其表达情况，目前转染的细胞主要有年轻的骨髓间充质干细胞、经遗传工程处理过的老化骨髓间充质干细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞、脂肪来源的干细胞、单核细胞、内皮祖细胞、肌细胞等。目前研究发现联合后具有很强的协同促进血管生成作用，但程序较前者更复杂且耗时。
2.目前研究较明确的基因
2.1人类生长因子基因 它表达的人类生长因子是一种生物活性肽复合物，有多个特殊氨基酸组成的肽链，进入人体血液后，促进下丘脑自行分泌人体生长素，而人体生长素对我们的生长发育、各种蛋白质的合成、细胞的修复和分裂繁殖、 激发胸腺恢复功能，增强人体免疫力、促进新陈代谢、增强人体排毒功能、再造老器官功能、抗击衰老、整体增进健康水平有着决定性的作用。研究发现心肌内低剂量注入人类生长因子质粒和结合声波的微气泡是治疗心肌梗死的一种有效方法[5]
2.2成纤维细胞生长因子（FGF）基因 它表达的产物包括23种亚类多肽，在血管再生中起作用的主要是碱性成纤维细胞生长因子bFGF，它是细胞生长和分化的重要调节因子，促进血管生成是bFGF的重要功能之一，有显著促进血管侧支循环的作用[6]，促细胞增值，细胞趋化及细胞迁移作用，研究证明过表达bFGF促进大鼠急性缺血心肌的毛细血管增生作用[7]。
2.3血管内皮生长因子基因 它所表达的产物是一类多效性多肽，由平滑肌细胞、黏液细胞、肾小球膜细胞等分泌，并通过旁分泌和自分泌机制特异性作用于血管内皮细胞，促进内皮细胞增殖，抑制内皮细胞凋亡，诱导血管生成[8]，它是体内新生血管的重要调节物质。人为增加梗死区局部的VEGF浓度，可以促使梗死区心肌新血管生成数，改善缺血心肌的血液供应，减少梗死范围，从而改善心脏功能。VEGF是血管内皮细胞有效的有丝分裂原，它能诱导细胞表达纤维蛋白溶酶原激活因子（PA）、胶原酶和尿激酶纤维蛋白溶酶原激活子受体，这在介导细胞侵入及组织修复中起重要作用，尿激酶基因、Shh蛋白基因也能够促进血管生成，改善局部供血，治疗心肌梗死[9]，VEGF还可促进血管通透性增加，参加诱导血管再生[10]的早期步骤。
2.4前列腺素1合酶基因 转染骨髓间充质干细胞可以促进新生血管的形成和提高旁分泌效应[11]。
2.5血小板生长因子基因可通过血管再生机制修理心肌缺血、保护心脏、募集反应生成血管。
2.6早期生长反应基因-1是较早期的协调基因，已被应用到缺血再灌注损伤的发病机制中，研究显示直接注入猪冠脉内早期生长反应基因-1在人冠脉再狭窄中有潜在的应用价值[12].其他研究明确的还有生长激素基因、血管生成素基因、血红素氧化酶基因[13]等。
3研究尚在进行的一些基因：
3.1microRNA 在心肌缺血缺氧时表达明显异常，它们对心血管疾病的发生和发展起着重要作用，miRNA 参与了心肌缺血缺氧过程中细胞的凋亡、再生、电传导等病理生理过程，在急性心肌缺血中的作用机制已逐渐得到认识，miRNA可能成为心肌损伤的重要生物学标记[14]，对预防及早期诊断急性心肌梗死带来帮助[15]。
3.2凝血栓蛋白-1又称血小板反应素一l（TSP-1），为一种细胞外基质蛋白，大量存在于血小板颗粒和细胞外基质中冠，TSP-1的编码基因位于15q15上，由186状静脉窦逆行灌注血管内皮生长，其多态性与冠心病之间的关系还存在争议。有研究发现白介素-6基因与心肌梗死也相关[16]。
3.3Ca2+-ATP酶基因其参于修复、细胞凋亡和肿瘤细胞增殖等过程，较多研究也显示基因perl和Empl在心肌梗死的治疗过程中发挥重要的作用，可能为药物治疗心肌梗死潜在的作用靶点，具有进一步深入研究的价值[17]。
3.4粒系集落刺激因子基因 是指能够刺激多能造血干细胞和不同分化阶段的造血干细胞增殖分化，并在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子研究显示该基因对心肌缺血损伤疗效不确定，需待进一步证明。
4问题和展望
目前基因治疗心肌梗死仍存在诸多问题：①靶基因的界定。多数心血管疾病是多基因异常，这就给我们对靶基因的界定和选择带来了一定困难②载体构建。构建安全、高效、免疫原性低的载体是基因治疗的一大热点。③载体选择。基因治疗的载体选择是不可避免的研究内容，因为不同的载体目的基因表达不同、细胞亚定位不同。④基因转移法。建立安全有效地基因导入方法也很关键，一般而言，直接基因转移法优于间接法[18]。心肌梗死是种发病较快的疾病，而血管再生基因治疗心肌梗死需要较长时间，选择在高危人群预防性的导入再生基因，减少因原发血管病变导致心肌梗死的发病率将成为研究新方向。
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基因治疗范文第5篇
皮肤的衰老是由遗传基因DNA决定的
脱氧核酸的功能片段就是基因，由基因所传递的各类程序是人类衰老和寿命长短的物质基础。这种物质基础是在生物进化中形成的，对每个个体来说，是生来注定的。但是，外部环境又会使遗传基因产生一定的变化，这就是变异的一面。
随着人体内在的老化，细胞再生和分裂所必须的核酸和酶变得越来越贫乏，表现为纤维的损伤和断裂，致使皮肤松弛、变薄、生出皱纹，而外在的日光照晒导致皮肤变厚、失去弹性、黑色素沉着且毫无光泽。
皱纹形成的根本原因是细胞衰老
随着现代生命科学的突飞猛进，科学家们已能在基因水平上对衰老的细胞进行调控，向衰老的细胞提供一种染色体端粒酶，这种酶能够延长细胞的寿命，从而达到延缓机体衰老的目的。
普通的人体细胞每分裂一次，染色体两头的端粒就会变短一点，细胞因此慢慢变老。大约分裂70次之后，端粒就会变得太短而不能保护染色体，一旦细胞不能再进行分裂，死期也就到了，而端粒酶能使变短的端粒重新生长到原来的长度，延长细胞的寿命。
美国科学家最近宣布，宾夕法尼亚州大学VNIVERSITY OF PENNESYLVANIA医学院发明了新的基因治疗GENETHERAPY法，他们取出人体细胞在实验室中进行基因改造，成功地给老化的细胞注入了新的活力，大大延长了细胞的寿命。
核酸，神奇的青春元素
美国生物医学科学家经过多年的研究和临床实践，发现随着年龄的增长，DNA RNA的合成越来越不足，会导致蛋白质、酶合成量与质的不足，从而表现为细胞与组织器官结构、功能缺陷，百病丛生。
基因治疗范文第6篇
1 基因在ALI/ARDS发病机制中的地位
ALI/ARDS的发生发展是环境因素和遗传因素综合作用的结果，发病机制复杂。常见导致ALI/ARDS发生的危险因素包括肺内源性因素如肺炎、误吸等，和肺外源性因素如全身性感染、创伤、烧伤、休克等［2］。然而，在接触危险因素的人群中，仅有部分患者发展成为ALI/ARDS，并最终死于ARDS，而且即便是同一危险因素对人体的打击程度相同，不同个体对ALI/ARDS的易感性及预后也不同，推测基因在人类对ALI/ARDS的易感性及预后中扮演了重要的角色［3］。目前发现与ALI/ARDS发生发展相关的基因位点约有17个，它们参与机体免疫炎症反应、氧化应激、凝血、血管功能损伤等过程，并最终影响ALI/ARDS的发生、严重程度及患者的预后［4］。
1.1 基因影响ALI/ARDS的易感性
目前发现有多个基因位点的基因多态性与ALI/ARDS易感性相关，主要包括血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）基因多态性、表面活性蛋白B（surfactant protein-B，SP-B）基因多态性等。ACE基因位于人类第17对染色体长臂3区5带（17q35），其基因型包括3种：插入型纯合子I/I、删除型纯合子D/D和杂合子I/D。D/D基因型患者的ACE表达高于I/I基因型患者，在ARDS患者中D等位基因出现的频率远高于对照人群［5-6］。SP-B是防止肺泡塌陷，维持正常肺功能的重要物质［7］。SP-B是由2号染色体短臂上的单基因编码，其基因组序列具有特征性，不同人群第4个内含子内CA单核苷酸串联重复序列数不同， ALI/ARDS患者重复序列出现的频率比健康对照组高［8］。此外白细胞介素（interleukin，IL）IL-6、IL-10基因多态性也与ALI/ARDS的发生相关［9-10］。提示存在这些基因位点多态性的患者更容易发生ALI/ARDS。
1.2 基因影响ALI/ARDS的严重程度
研究发现IL-8、IL-10及核转录因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）基因多态性与ALI/ARDS的严重程度相关。IL-8基因多态性位点251位A等位基因合成IL-8比T等位基因明显增加，患者病情重，机械通气时间延长［11］。而IL-10基因型为1082GG的患者病情严重程度降低，器官功能障碍的程度亦降低［12］。NF-κB是重要的导致炎症反应的核转录因子，其多态性基因位点的插入缺失突变影响ALI/ARDS患者的严重程度，而与患者预后无关［13］。
1.3 基因影响ALI/ARDS患者的预后
目前与ALI/ARDS患者预后相关的基因包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和ACE2。SOD是一种抗氧化酶，SOD基因位于4号染色体上，其基因多态性来源于编码区编码精氨酸的序列被替换为甘氨酸序列，则细胞内SOD的产生将增加10倍，抗氧化作用加强，患者预后改善［14］。ACE D/D基因型患者不仅与ALI/ARDS易感性相关，也影响患者的预后，含有此类基因型的ALI/ARDS患者预后差［6］。
可见，ALI/ARDS的发生发展与基因异常表达密切相关，提示ALI/ARDS的治疗不应该仅停留在器官功能支持层面上，基因治疗可能是其重要的治疗策略之一。
2 ALI/ARDS基因治疗策略
基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因或核苷酸序列通过一定方式导入靶细胞或组织以纠正基因的缺陷或者改变某一特定产物的表达，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。可分为胚胎细胞基因治疗和成体细胞基因治疗［15］。
2.1 ALI/ARDS基因治疗的优势
ALI/ARDS采用基因治疗具有一定的优势［16］：（1）ALI/ARDS是一个急性发作并且病程相对短暂的综合征，仅需短疗程基因治疗，无需反复给药诱发机体的免疫炎症反应；（2）气道上皮和远端肺泡上皮可以通过气道内给药，靶向作用好；（3）心脏泵出的血液需通过肺循环才能到达全身各处器官，因此通过静脉给药对肺微血管内皮细胞也具有较好的靶向作用；（4）基因治疗可针对ALI/ARDS的不同时期发挥治疗作用；（5）基因治疗可特异性地针对ALI/ARDS损伤和修复的某一机制如凝血、氧化应激、上皮间充质转化等发挥靶向治疗作用。
2.2 ALI/ARDS基因治疗的分类
ALI/ARDS基因治疗按基因操作方式分为两类：一类为基因修正和基因置换，即在原位将缺陷基因的异常序列进行精确的修复。通过同源重组技术将外源正常的基因在特定的部位进行重组，从而使缺陷基因在原位特异性修复。另一类为基因增强和基因失活，即不去除异常基因，而通过导入外源基因使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能；或特异封闭某些基因的翻译或转录，以达到抑制某些异常基因表达［17-18］。此外，通过药物等方式调节细胞或组织器官的外遗传机制如DNA的甲基化、非编码RNA、及组蛋白翻译后修饰（甲基化、乙酰化、磷酸化）亦可达到增高或降低某一特定基因表达的目的［19］。尽管ALI/ARDS的发生可能与患者存在某种易感基因相关，但目前ALI/ARDS的基因治疗主要依赖第二类方法来改变肺组织局部相关产物的表达，从而促进肺损伤的修复。
2.3 ALI/ARDS基因治疗的载体选择
理想的载体不仅能够高效地向靶细胞转染较大外源性基因片段，防止其被核酶降解，还需调节外源基因在细胞内的表达，并且不产生插入突变，不引起免疫炎症反应等不良反应。目前常用载体分为病毒载体和非病毒载体两大类［18］。
2.3.1 病毒载体
腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒等是目前常用的病毒载体。腺病毒具有嗜上皮性，在ALI 的治疗过程中可能会导致一过性的肺泡上皮损伤，诱发免疫炎症反应［20］。逆转录病毒仅能转染分裂期细胞，对静止期细胞转染效率低，其应用受到一定限制［17］。腺相关病毒是一种有DNA缺陷的非致病性细小病毒，具有安全性好、宿主范围广等优点，目前已成为基因治疗研究的热点［21］。
2.3.2 非病毒载体
质粒、脂质体、寡聚核苷酸等非病毒载体在ALI/ARDS中也有较多的应用。它们成本低、安全，但其转染效率较病毒载体低［16］。近年来ALI的细胞治疗尤其是干细胞治疗发展迅速，目前已进入临床实验阶段，以细胞为基因载体的治疗形式亦得到较好的发展，不仅转染效率高，而且减轻免疫炎症反应，与细胞治疗具有协同作用，因而具有广泛的前景［22］。
3 基因治疗在ALI/ARDS治疗中的应用
ALI/ARDS的基因治疗主要通过携带肺保护基因至损伤肺组织，在局部高表达或沉默相关基因，抑制肺部炎症反应，促进肺水清除，改善内皮细胞功能，减轻肺纤维化，阻断ALI/ARDS发生发展的病理生理进程，促进肺损伤修复而达到治疗的目的。
3.1 基因治疗促进肺水肿液清除
通过基因转染促进肺水肿液的清除，从而纠正低氧是ALI/ARDS的重要治疗措施。肺水肿的发生不仅与肺毛细血管内皮-肺泡上皮屏障的破坏相关，还与肺泡上皮细胞肺水清除功能下降有关［23］。研究表明，在肺泡上皮细胞上存在多种离子通道，包括Na+通道（ENaC）、Na+-K+-ATP酶、K+通道等，随着Na+的转运可促进水的清除。不仅如此，角化细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）也可促进肺水的清除［24］。研究发现通过各种基因转染方法可使ENaC、Na+-K+-ATP酶及KGF等基因高表达，从而增强肺水转运而减轻肺水肿。
病毒载体介导的基因转染可显著促进肺水肿的吸收。目前已证实，在正常大鼠及呼吸机相关的ALI大鼠及高氧诱导的ALI大鼠的治疗中发现，由重组腺病毒介导的基因转染Na+-K+-ATP酶的α2亚基和β1亚基，可明显促进肺水清除［25-26］。Qiao等［23］通过慢病毒向分离的原代肺泡上皮细胞转染Na+-K+-ATP酶的β1亚基，亦可以增加Na+-K+-ATP酶的活性，促进肺水清除。
非病毒载体亦可承载促进肺水清除相关的基因。Stern等［27］的研究发现由脂质体介导的Na+-K+-ATP酶的α亚基和β亚基基因转染可减轻硫脲诱导的小鼠肺水肿的程度，而输注脂质体导致的肺部炎症反应轻微。脂质体还可转载KGF基因减轻油酸诱导ALI小鼠的肺损伤［28］，但较腺病毒转染效率低，效果差［29］。此外，电穿孔法可以直接把的DNA转入小鼠肺组织，不仅可以减轻内毒素诱导小鼠肺水肿，还可减少中性粒细胞和巨噬细胞的浸润，减轻肺组织的损伤程度［30］。可见，非病毒载体系统可介导基因转染促进肺水清除。
3.2 基因治疗抑制肺部炎症反应
失控的炎症反应是ALI/ARDS发生发展的重要机制之一，调节肺部及全身的炎症反应是ALI/ARDS基因治疗的重要方向。
基因治疗调节ALI/ARDS过度的炎症反应主要是通过携带具有抗炎作用的细胞因子的基因至肺损伤组织局部高表达，从而发挥抗炎的作用。尽管病毒载体可诱导宿主发生免疫炎症反应，但应用腺病毒向ALI小鼠转染IL-10［31］、干扰素蛋白10（IP-10）［32］、IL-12［33］、转化生长因子β1（TGF-β1）［34］等细胞因子基因后，被证实具有较好的抗炎效果，免疫炎症明显减轻，肺损伤也有所修复，并且小鼠病死率也有所下降。
为克服病毒载体诱发并加重宿主的免疫炎症反应，以非病毒载体为转染介质也有长足的发展，传统的以脂质体为载体的基因转染尽管可以一定程度上减轻肺损伤，但由于其转染效率低，抗炎效果不佳。近年来以细胞为载体的基因转染在ALI的治疗中具有重要的作用， McCarter等［35］以及Xu等［36］的研究证实通过向成纤维细胞和间充质干细胞内转染血管生成素1基因，并移植入内毒素诱导的ALI小鼠体内，可明显减轻小鼠肺部的炎症反应及肺损伤程度，而由细胞本身诱导的小鼠肺炎症反应非常轻微。因此，以细胞为载体的基因治疗是ALI/ARDS的治疗未来的发展方向。
3.3 基因治疗改善肺微血管内皮功能
内皮功能受损是ALI/ARDS的重要特点之一，在ALI/ARDS发生过程中具有重要的作用。内皮功能受损主要表现为其分泌功能和屏障功能受损，导致肺部炎症反应和肺水肿发生。因此，调节内皮功能是ALI/ARDS的重要治疗靶点之一。
基因治疗对内皮功能也具有一定的调节作用。它主要是通过转染内皮相关基因至机体内，使其在局部高表达，从而达到治疗的目的。Chicoine 等［37］的研究发现，将载有诱导性一氧化氮合酶（induced nitric-oxide synthase，iNOS）的腺病毒通过气管内注射移植入大鼠肺内，大鼠肺动脉内皮收缩功能减弱，并呈现时间依赖性，大鼠肺动脉高压明显改善。McCarter等［35］把血管生成素-1基因转染入成纤维细胞使其高表达并移植入LPS诱导的ALI大鼠体内，大鼠肺血管内皮分泌iNOS、血红素氧化酶增加，而内皮素-1表达降低，细胞间细胞黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1的表达恢复正常，肺内皮通透性降低，炎症反应减弱，肺损伤减轻。因此，基因治疗可以调节肺血管内皮细胞功能，促进肺损伤修复。
3.4 基因治疗减轻肺纤维化
肺纤维化是ALI/ARDS发生发展的终末阶段，病程难以逆转，致死率高。目前主要的治疗是激素抗炎治疗，但疗效不佳，缺乏有效的治疗方法。近年来基因治疗为其提供了新的途径。研究发现，在博来霉素诱导肺纤维化小鼠模型中，通过转染TGF-β1的RNA干扰片段，使小鼠TGF-β1基因沉默后小鼠肺纤维化程度明显减轻，肺功能增强［38］。在放射性肺损伤小鼠模型中，通过肌内注射载有可溶性肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）受体1的质粒后发现TNF-α的活性降低，肺纤维化减轻，免疫炎症反应轻微。不仅如此，以细胞为载体的基因治疗在肺纤维化中也得到了应用［39］。Aguilar等［40］在体外通过基因工程技术将KGF基因转染至间充质干细胞，并移植入博来霉素诱导的ALI小鼠体内，小鼠肺组织损伤减轻，后期肺组织内胶原沉积明显减少。此外，组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸的应用，亦可通过外遗传机制调控基因表达，发挥抗纤维化作用［41］。可见，基因治疗可以明显减轻肺纤维化。
4 ALI/ARDS基因治疗面临的挑战
尽管ALI/ARDS基因治疗已取得一定进展，但仍然还面临着许多挑战［16］。 （1）合适的治疗基因靶点的选择：目前影响ALI/ARDS的发生发展的因素很多，但选择合适的基因治疗靶点仍不确定；（2）载体的选择与改进：载体是介导基因治疗的重要工具，但在发挥治疗作用的同时也会对机体产生一定的不良反应，如诱导免疫炎症反应和宿主基因的插入突变和失活，因此对载体进行改进有利于提高基因治疗的安全性，也是基因治疗的前提所在；（3）目的基因的表达调控：对导入宿主细胞的目的基因的表达进行调控，有利于调控基因在不同的疾病状态下充分发挥治疗作用，是未来的研究方向；（4）基因治疗的靶向性：尽管ALI/ARDS的基因治疗具有一定的靶向性，但如何使目的基因在宿主基因某一特定部位进行插入整合仍是目前研究的难题。
总之，基因治疗在 ALI/ARDS治疗中的地位越来越受到重视，基因治疗可以通过抑制过度的炎症反应，促进肺水清除，改善内皮功能，减轻肺纤维化，从而减轻ALI /ARDS的严重程度并改善预后，但在治疗的靶向性、安全性等问题上仍然面临许多挑战，是今后重点的研究方向之一。
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（收稿日期：2012-11-06）
DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.03.001
基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（81000828）；国家自然科学基金面上项目（81070049）；国家自然科学基金面上项目（81170057）
作者单位：210009 南京，东南大学附属中大医院重症医学科
通信作者：邱海波，Email： .cn
基因治疗范文第7篇
随着对肿瘤发生发展分子机制认识的不断深入，肿瘤的基因治疗已成为攻克和治愈肿瘤最具希望和挑战的研究领域。如何建立安全有效的治疗基因导人系统成为研究者们首要解决的问题。目前，常用的载体主要有病毒载体和非病毒载体两类：病毒载体的转移效率高，在基础研究和临床试验中应用广泛，但近年来因存在安全性的问题，其使用受到了一定的制约；非病毒载基因导入的效率相对较低，但具有安全性好且容易制备的特点，日益受到人们的重视。现就近年来国内外对于肿瘤基因治疗载体的使用选择及安全性研究作一综述。
【关键词】 肿瘤；基因治疗；载体；安全性
肿瘤是一类严重危害人类健康的疾病，伴随竞争加剧和环境污染，预计到2020年将有近2000万/年的新发肿瘤病例，死亡人数可达到1200万/年。目前肿瘤的主要治疗手段是手术、放疗和化疗，虽然有一定成效，但是距离彻底根治肿瘤还很遥远，人们将希望寄托于基因治疗。目前，应用于肿瘤基因治疗研究的载体主要分为病毒性载体和非病毒性载体两大类。本文就目前在肿瘤基因治疗方面所应用的基因转运系统各常用载体的使用现状、安全性及其研究进展做一综述。
1 病毒载体
病毒能够自然感染细胞，从而可将自身的遗传物质带至宿主细胞。RNA和DNA病毒均可作为基因运载工具，病毒载体具有天然嗜性，使其能有效转导外源基因进入靶细胞。在基因治疗过程中，一方面要有效利用病毒感染细胞效率高的优点；另一方面又必须克服病毒载体的天然嗜性所带来的潜在安全性问题。
1．1 逆转录病毒载体
逆转录病毒(retrovinls，RV)为RNA病毒，该载体即是将结构基因去掉换成外源基因，在体外的包装细胞内组装成含有目的基因的重组逆转录病毒，该重组逆转录病毒不具致病性；在逆转录病毒感染细胞后，整合至细胞染色体上，从而实现其携带外源目的基因的作用；具有转染效率高，靶向性差，体内病毒滴度较低的特点。Barzon等［1］将白细胞介素-2基因和单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因同时插入反转录病毒载体治疗甲状腺癌，可使瘤体比单独利用白细胞介素-2基因进行治疗时缩小3～4倍。但逆转录病毒只能转染处于分裂增殖期的细胞，且与受染细胞的整和具有随机性，故具有潜在的危险性。因担忧其安全性问题，故目前逆转录病毒载体多用于体外转染［2］。现阶段国内外学者们仍在寻求开发新的更为高效安全稳定的逆转录病毒载体，如已报道的复制缺陷型泡沫病毒载体［3］等。
1．2 腺病毒载体
腺病毒(adenoviru，Ad)为双链DNA病毒，它能感染各时相的细胞，以其高效转染和高效表达而成为应用广泛的病毒载体［4］。常树建等［5］构建腺病毒载体介导抗-VEGF发状核酶的实验结果显示：腺病毒可高效感染HT-29 细胞，有效抑制VEGF的表达及移植瘤组织内血管的生成。但腺病毒作为载体也有自身的局限性：(1)表达时间短，容量小(4．5kb)，免疫原性强；(2)缺乏理想的动物模型来进行临床前毒性研究；(3)对肝细胞的天然嗜性容易造成腺病毒颗粒在肝脏中积累从而诱发肝脏损伤［6］，这些使得腺病毒作为基因治疗的载体具有一定的危险性，从而限制了其在临床上的应用。
1．3 腺病毒相关病毒载体
腺病毒相关病毒(adenovirus-associated virus，AAV)为单链DNA病毒，具有长期稳定整合的特点，且适用于表达生物活性物质的基因，在高滴度情况下也未发现引起炎症反应的副作用，已有逐步取代腺病毒载体之势。齐荣等［7］通过构建特异性杀伤肿瘤细胞的腺相关病毒载体AAV-hTERT-TRAIL的研究结果显示，其可以介导肿瘤细胞特异性基因表达与杀伤作用，同时对正常细胞无毒性。目前，该载体的主要局限是难以大量生产和载体容量有限，但新的复制模型有望解决这些问题。
1．4 单纯疱疹病毒载体
单纯疱疹病毒(herps simple virus，HSV)为双链DNA病毒，可引起口唇及生殖道黏膜感染，且具有嗜神经性。此类病毒感染神经未梢并导致潜伏感染，这一特性常被用来进行脑部肿瘤的基因治疗，但它所引起的神经毒性及潜伏性感染也不容忽视。研究显示，复制缺陷型载体则不含HSV-I的任何编码基因，细胞毒性及免疫原性小，基本消除了病毒基因表达的可能，使宿主细胞中不存在野生型潜伏感染而安全性好［8］ 。
1．5 痘病毒载体
痘病毒（poxvirus，PV）为双链DNA病毒，主要用于制备疫苗。痘病毒载体具有低毒性和高容量的特点，其与单纯疱疹病毒载体是仅有的能够同时携带多个外源基因的转运系统，因而作为体内转基因的载体是个不错的选择，但是在应用于人体时，由于其免疫原性强，限制了其在临床中的应用。近年，国外报道开发了一种新型减毒痘病毒载体NYVAC安全性高，目前已进入I／Ⅱ期临床试验［9］。
1．6 其它病毒载体
此外，慢病毒(lentivirus)、杆状病毒(Baculovirus)、重组仙台病毒(Sendai virus，SV)载体也有报道，但是要进入人体还需要进行大量深入的研究。
2 非病毒载体
欧美目前已有大于20％的临床研究应用非病毒载体，其中常用的主要包括：真核细胞表达质粒载体（裸DNA）、阳离子多聚物载体、脂质体、纳米粒、厌氧菌等。
2．1 真核细胞表达质粒载体 真核细胞表达质粒载体主要用于基因治疗的直接体内治疗方案，该方法是将治疗用的目的基因克隆到构建好的真核细胞表达质粒载体中去，采用裸DNA肌肉注射的方法，直接转移到体内，在肌肉组织中表达目的蛋白质，发挥治疗作用。目前也已构建了较多的真核细胞表达质粒载体系统，由于这类载体多有商品供应，类型的特色厂家已有介绍，故本文不再叙述。
2．2 阳离子多聚物载体
阳离子多聚物(cationic polymer)载体是用带正电多聚物静电结合、浓缩DNA，再通过静电作用结合细胞膜或通过携带的靶向配体与存在于细胞膜上的受体结合，内吞进入细胞内。目前常用的主要有聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、树状高分子载体、明胶、壳聚糖及其衍生物等。然而由于存在电荷相关毒性及较病毒载体低的转染率等缺点，其临床应用也受到限制。近年来，随着材料及合成技术的飞速发展，人工合成的生物可降解阳离子多聚物主要用于制备纳米级载体［10］。
2．3 纳米粒
纳米粒(nanoparticles) 是一类由天然高分子物质或合成高分子材料制成的粒径为纳米级的载体，其表面经过生物修饰或理化修饰后具有靶向作用。Iwasaki Y等的研究显示表面存在乙肝病毒的L抗原的L纳米粒具有嗜肝细胞性，其体内试验结果首次证明了纳米粒可用于将抗肿瘤的治疗基因导入人类肝脏肿瘤，值得关注［11］。而对脑肿瘤来说，利用人脑肿瘤原发部位的血管间隙较大、通透性增强和滞留效应，抗肿瘤药物的转运可通过直径小于80nm的纳米载体实现［12］。尽管如此，但纳米靶向载体还是存在着药物装载量偏低，靶向物质与药物载体结合的稳定强度低，靶向性药物存在毒性和组织特异性不理想，体内环境中纳米载体难以检测等系列问题，尚待深入研究。
2．4 阳离子脂质体
脂质体(1iposome)载体为脂质双分子层组成的环形封闭囊泡，它可通过被宿主细胞融合、内吞等方式将其所携带的核酸分子送入细胞。脂质体转染无插入突变的危险，而且无毒、无免疫原性，是近年发展起来的非常有前途的非病毒载体。但普通脂质体作为药物载体，仍存在靶分布特性不理想、贮存中稳定性欠佳等缺点，因而限制了脂质体在肿瘤化疗中的应用［13］。
2．5 活菌载体
基于实体瘤微环境缺氧的特性构建的重组厌氧菌载体，能特异性定居于肿瘤，通过产生细胞因子、毒素、酶类等活性物质或表达其所携带的目的基因起到治疗作用，现已初步显示出应用潜力。用于肿瘤基因治疗的厌氧菌载体具有以下特点：（1）易于生产，便于储存，使用更加方便；（2）可以作用于间质细胞，比病毒更易于从循环中清除，安全性高，其本身的抗瘤效果优于病毒；（3）治疗基因整合、发生遗传突变的可能性也减少；（4）靶向性优于病毒载体和脂质体载体。但厌氧菌载体也有其局限性：溶瘤治疗仅作用于厌氧区，这将阻碍专性厌氧菌穿透肿瘤间质“寻找”低氧区［14］。据目前研究来看，工程化厌氧菌和联合治疗的优化将有利于提高厌氧菌抗肿瘤治疗的疗效。目前研究较多的应用于肿瘤基因治疗的厌氧菌载体有双歧杆菌、沙门氏菌、梭状芽孢杆菌、乳酸杆菌等。
2. 5. 1 双歧杆菌属
双歧杆菌(Bifidobacterium)是寄居在人体和其他哺乳动物的肠道内的益生菌， Yazawa等［15］将长双歧杆菌鼠尾静脉注射入荷瘤小鼠，结果发现长双歧杆菌能够选择性在肿瘤组织内定植和生长而不累及正常组织，具有较好的靶向性，且未见小鼠出现由细菌进入体内所导致的任何不良反应。齐占朋等［16］通过对双歧杆菌表面分子完整肽聚糖(WPG)的研究发现，WPG能够抑制大肠癌Lovo细胞的增生，其机制与诱导癌细胞早期凋亡有关。与其他厌氧菌相比，双歧杆菌抗原性相对较弱而安全性较高，非常适宜作为基因治疗的载体，具有良好的应用前景和广阔的发展空间。
2. 5. 2 沙门氏菌属
沙门氏菌属(Salmonella)是一种G-兼性厌氧菌，属于胞内寄生菌。Che-Hsin Lee等［17］的实验表明携带内皮抑素表达的猪霍乱沙门氏菌载体能显著抑制肿瘤生长。以减毒沙门菌为肿瘤治疗基因的载体，通过口服途径使外源基因定位到肿瘤组织产生效应，避免了全身用药的不良反应 ［18］。此外，周易明等［19］的研究表明基因工程减毒的沙门氏菌VNP20009有着良好的低毒性以及肿瘤靶向性，具有作为肿瘤基因治疗载体的潜力。
2．5. 3 梭状芽孢杆菌属及乳酸菌
梭状芽孢杆菌属 (Clostridium)为一大类厌氧或微需氧的G+粗大杆菌，其某些菌种可以产生毒性很强的外毒素和侵袭性酶类，对人或动物致病。乳酸菌(Lacticacidbacterium，LAB)是在人类消化道、阴道、口腔黏膜中长期黏附和定居的非致病性G+厌氧菌。实验表明，乳酸杆菌是一种靶向性非常强的非致病性厌氧菌。近年来，Aires等［20］研究发现经过基因改造的乳酸杆菌可以很好地表达HPV-16 VI Ps病毒颗粒，用乳酸杆菌携带VI Ps病毒颗粒做黏膜疫苗治疗子宫颈癌。
3 结 语
理想的肿瘤基因治疗载体具备以下特点：安全、有效，靶向性好、可调控、长期稳定、容量大、易选择、易转移、穿透性能好、适度表达和制备方便等。现实应用的载体均不能达到理想标准。病毒性载体虽然转染效率高，但其免疫原性、细胞毒作用、携带外源基因的大小受限和病毒滴度不易提高等问题使其研究和应用受到一定限制；非病毒性载体虽然突出的优点就是安全、制备简单和巨大的携带外源基因的容量，但其转染效率较低且基因的表达时间较短也影响其应用；细菌具有侵袭性和靶向性，能够进入细胞并导入外源基因，且易于控制，是细菌成为高效特异的新型肿瘤基因治疗载体的有利条件，但是也存在着在体内的表达效率还不够理想的问题，部分厌氧菌仍存在安全隐患，还需要进行大量探索。
基因治疗载体存在着上述问题，使得肿瘤的基因治疗任重而道远。尽管目前肿瘤的基因疗法的研究大多还停留在实验研究阶段，相信在不久的将来，随着理想载体的研发使用，该疗法将会成为一种治疗癌症的重要手段被广泛应用于临床实践。
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基因治疗范文第8篇
关键词：慢病毒载体；载体构建；基因治疗
中图分类号：R373文献标识码：A文章编号：1673-2197（2009）02-0142-03
基因治疗是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RN段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。其关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。理想的基因载体应具备：靶向特异性；高度稳定、易制备、可浓缩和纯化；无毒性；有利于基因高效转移和长期表达；容量大，易人工合成，缺乏自动复制载体自身的能力［1］。由于病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚、易于改造和操作、感染效率高、有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的，而慢病毒载体由于其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力且转染效率高、靶向性好和持久性表达等特点，病毒载体系统就显得格外引人注目。
1 慢病毒及其载体的简介
慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本结构基因外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev［2］。慢病毒载体（Lentiviral vector， LV）作为外源基因载体，其产生均包括一个遗传割裂基因表达的设计。病毒元件要符合以下条件：①慢病毒组装辅助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒转基因载体RNA包括转基因表达盒；③异质糖蛋白。目前使用不同种属来源的慢病毒载体，包括来源于人类（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、猫（FIV）等其它物种［3］。
2 病毒载体的构建
由于慢病毒的一些自身因素，我们需对其进行以下的一些改建，使其可以更好地为疾病治疗和科研工作服务。
2.1 最小辅助包装元件
为了减少病毒序列的数量从而减少同源重组的风险，去除了组装慢病毒载体结构中不同辅助元件或用其它的特异序列来代替。其中包括原位癌激活基因序列的调整。另外，去掉附加或调节基因与gag-pol基因一样，已在一些慢病毒载体设计中得以应用［4］。
2.2 去掉附加基因
有几个HIV-1基因（vif，vpr，vpu，nef）对体外病毒复制不重要，但对体内病毒的致病性非常重要，甚至nef，vif，vpr整合在病毒颗粒内从而促进了载体的免疫原性。因此缺乏这些非重要基因时能够有效生产慢病毒载体是非常重要的［5］。然而，有研究表明在驻留型巨噬细胞和活性B淋巴母细胞的转导中需要nef，vif，vpr的参与［6］。因此，在去掉附加基因的过程中，要依具体情况决定基因的去留。
2.3 去除调节基因
有研究表明反式作用元件tat对全效慢病毒载体基因组RNA中的5’-LTR的tat依赖性U3序列已经被强效启动子序列取代。在安全性方面，通过在分散结构中进一步分裂原病毒基因组来表达rev。在设计双顺反子gag-pol，IRES，rev组装表达结构时也表达了rev基因结构。载体与rev效应元件（RRE）相互作用并影响了非剪接gag-pol mRNAs和转基因载体基因组RNA从核内输出。RRE序列已被异种病毒序列所取代，此种病毒序列能促进非剪接转录产物从核中输出或促进非剪接转录产物的稳定性。用这些异种输出序列取代RRE/rev引起了HIV-1或SIV载体效价的下降［7］。另外，实验表明宿主细胞因子参与了RRE包含的RNAs从核中输出的过程。
2.4 壳体化位点的最低要求
在大多数慢病毒载体壳体化位点要求在转移载体RNA中存在gag基因区的最小5'-片段，此片段含有对顺式组装活性有必要的主干环结构。在大多数慢病毒载体体系中，包含在N-末端片段落gag ORF，大约有300~400个碱基对，已经被移码突变截断，因此易感呈现gag肽的转录/翻译不会干预转基因的转录/翻译［8］。
3 慢病毒载体在疾病治疗方面的应用
慢病毒载体在基因治疗方面已取得了良好的效果，国外已经进行了一系列的从基础到临床的系统研究工作，包括构建有效载体所需的最少的HIV-1基因、SIN载体的构建、应用HIV-1载体包装细胞系、非人类慢病毒载体的应用等；尤其是在安全性方面，在用H1V-1为载体的体内及体外实验中，迄今尚未发现诱发宿主免疫反应的产生，表明其安全性是有保证的。
3.1 肿瘤治疗
大约30%的乳腺癌中有表皮生长因子受体家族蛋白HER2的过表达，HER2表达水平与病人的预后以及恶性程度密切相关。在以往鉴定的对HER2有良好RNAi效应的靶序列的基础上，构建了一系列U6和H双启动子小干扰RNA（siRNA）表达载体［9］，并转染HER2高表达乳腺癌SKBR3细胞定量测定了其HER2下调效应。程连胜［10］等做siRNA表达盒经LR重组反应被克隆入慢病毒载体中并成功包装成病毒的实验。由于siRNA是作用于mRNA上并导致其降解的，采用荧光定量PCR对感染siRNA慢病毒后乳腺癌SKBR3细胞HER2的mRNA水平进行了相对定量、蛋白印迹杂交和流式细胞仪等一系列实验证明：慢病毒介导的RNAi确实能有效地下调肿瘤抗原HER2的表达，结果显示，由于HER2下调导致了细胞生长抑制。由此可见，用慢病毒介导的RNAi对乳腺癌的治疗将有良好的应用前景。
自身分泌活动因子（AMF）是由肿瘤细胞分泌的，并且促进肿瘤细胞的生长。AMP和其受体（AMPR）的表达与许多低成活率和进行性的胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌、食道癌、皮肤恶性黑色素瘤和肺腺癌有着密切的关系［11-17］。最近有研究表明，AMP的突变对乳腺癌的进展和转移有着明显的促进作用。AMP表现出了与磷酸葡萄糖异构酶的一致的序列，它受小窝蛋白-1（Cav-1）的负向调节［18］。Kojic［19］等用慢病毒载体转导Cav-1基因到乳腺癌细胞中，实验结果表明，AMP的表达与Cav-1的表达有着明显的负相关性，Cav-1对AMP有强负调节作用，对癌细胞的生长有抑制作用。由此可推断，慢病毒载体介导的Cav-1对与AMP表达相关的恶性肿瘤应该有一定的治疗效果。
3.2 血液系统疾病的治疗
慢病毒载体不仅能感染造血干细胞（HSCs），使携带的目的基因整合至HSCs基因组内，且能利用病毒携带的调控元件，使目的基因随HSCs细胞特异性表达。Michel Sadelain［20］等用小鼠模拟了人α-地中海贫血的模型，并用慢病毒载体介导治疗基因进行治疗。实验载体来源于TNS9 vector，这个载体已表现出良好的转移治疗用的人类β-globin基因进入小鼠造血干细胞的能力［21-24］。对α-地中海贫血，除了将β-globin基因用α-globin基因替代外，原载体的原件都保留，将载体通过小鼠卵黄囊的血管直接注射进胚胎，但是转移进去的基因在表达过程中出现了衰减现象［20］，原因还有待于研究。但在对β-地中海贫血的治疗中，慢病毒介导的β-globin基因进入小鼠的造血干细胞却取得了不错的效果［25］。虽然慢病毒载体在地中海贫血治疗中不尽完美，但可以肯定的是，随着研究的深入，慢病毒载体在地中海贫血中的应用一定会有光明前景。
3.3 半月板的修复
张经纬等［26］用ViraPower慢病毒载体系统转载中碱性成纤维细胞生长因子，研究其在新西兰大白兔的半月板纤维软骨细胞损伤修复作用，结果发现转染48h后半月板细胞培养液中碱性成纤维细胞生长因子就有明显的表达；细胞DNA合成前期、DNA合成期、分裂前期及分裂期的时间较对照组和空白组缩短，并且胶原合成结果显示实验组细胞胶原高于对照组和空白组。表明利用慢病毒转基因技术能有效地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染入半月板纤维软骨细胞，继而促进半月板细胞的增殖和基质合成，有可能为治疗半月板损伤提供新的方法。
总之，尽管慢病毒载体目前还不尽完善，仍然存在很多的问题，但是由于慢病毒载体可转染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应、安全性好等优点，对转基因的治疗和研究有很大的诱惑力。相信随着技术的进步，该类载体将会得到进一步提高，并具有广阔的应用前景。
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