细胞培养

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细胞培养范文第1篇

植物组织培养在农业生产中的应用、动物细胞培养的过程及影响因素一直是高考命题的热点。命题会利用信息材料为背景以图解的形式考查有关植物组织培养的相关知识，或结合植物育种、动物细胞培养等知识进行综合考查。

二、复习建议

本部分题目中常出现操作流程图或装置图，如植物组织培养的操作流程图、动物细胞培养过程图等，复习过程中要注意运用列表比较的方法分析不同技术手段的异同点，注意掌握各种技术手段中的特殊点和关键环节；要善于识别这些图解，要知道图中所表示的物质、结构和过程，知道每个环节的操作要点，并对一些现象进行正确分析。

三、知识梳理

（一）植物组织培养

1.原理：植物细胞具有全能性。

2.过程。

3.植物组织培养过程的几点说明。

（1）外植体的选择与制备。

①选择外植体时，由于外植体的脱分化难易因植物种类、器官来源及生理状况的不同而有很大差异，因此，选择哪些作为外植体应注意。一般来讲，烟草、胡萝卜、植物的花和幼嫩的组织脱分化相对较易，而植物的茎、叶和成熟的老组织则较难。

②制备外植体首先要消毒，其次要选取有形成层（形成层细胞易脱分化）的部分。

（2）严格的无菌条件。

植物组织培养用的培养基含有植物生长发育所需要的各种营养物质，这些营养物质同样为细菌等微小的生物提供了适合的营养。在这种培养基上，细菌等微小的生物比植物细胞具有更强的新陈代谢能力，它们比植物细胞生长、繁殖得更快，而且它们会产生毒素，使培养的植物细胞很快中毒死亡。因此，植物组织培养要想取得成功，必须有效地防止细菌等的污染，保证培养材料、培养基、培养用具严格无菌。

（3）完全的营养条件。

离体的植物细胞失去了植物的自养能力，所以需要为其提供包括水、有机营养、矿质营养、维生素等营养物质。

（4）光照条件。

离体的植物细胞、组织和器官脱分化形成愈伤组织时，需避光处理；而愈伤组织再分化形成植物幼苗时，需光照处理。

（5）激素调控。

①生长素类含量＞细胞分裂素类含量：诱导植物组织脱分化和根原基形成。

②生长素类含量＜细胞分裂素类含量：诱导愈伤组织再分化和芽原基形成。

③赤霉素类：促进分化的丛芽和小植株快速生长。

【易混警示】分化、脱分化、再分化。

比较内容脱分化再分化分化过程外植体愈伤组织愈伤组织幼苗形成体

特点排列疏松、高度液泡化的薄壁细胞有根、芽需要条件a.离体；b.适宜的营养；c.生长素/细胞分裂素的比例适中；d.不需光a.离体；b.适宜的营养；c.生长素/细胞分裂素的比例高（或低）诱导生根（或生芽）；d.光照在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构和生理功能上发生差异的过程，具有普遍性、持久性、稳定性和不可逆性；分化的结果是形成不同的组织器官，帮助个体完成正常的生长发育4.植物组织培养技术的应用。

（1）植物繁殖的新途径。

①微型繁殖。

实质植物组织培养原理植物细胞的全能性条件培养基中加入细胞生命活动所需的水、矿质元素和小分子有机物，还有激素，更重要的是所有加入的物质必须是无菌的，操作过程必须是在无菌条件下操作，这样繁殖的幼苗才是无毒的微型繁殖

技术的

优点a.能保持亲本的一切优良性状，子代个体具有的遗传物质与亲本一样

b.选材少，培养周期短，繁殖率高

c.不受自然生长季节的限制，便于自动化管理，有利于进行工厂化培养范围作物脱毒，人工种子中的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽的获得采用的技术均是微型繁殖②作物脱毒：a.解决方法：切取一定大小的茎尖进行组织培养，再生的植株就有可能不带病毒，从而获得脱毒苗。b.理论基础：植物分生区附近病毒极少，甚至无病毒。c.特点：繁殖速度快；幼苗遗传背景均一；不受季节和地区限制。

③人工种子（如下图）。

人工种子主要由三部分组成:

a.胚状体(分生组织),它相当于天然种子的胚,是有生命的物质结构；

b.供胚状体维持生命力和保证其在适宜的环境条件下生长发育的“人工胚乳”；

c.具有保护作用的“人工种皮”。

【特别提醒】人工种皮是保证包裹在其中的胚状体顺利生长发育成小植株的关键部分，针对植物种类和土壤等条件，在人工种子的包裹剂中还可以加入适量的养分、无机盐、有机碳源以及农药、抗生素、有益菌等。为了促进胚状体的生长发育，还可以向人工种皮中加入一些植物生长调节剂。

（2）作物新品种的培育。

①单倍体育种：花药离体培养过程就是植物组织培养过程。

a.原理：整个单倍体育种过程的原理是染色体变异，其中的花药离体培养是利用细胞的全能性。

b.过程：通过花药离体培养获得单倍体植株，染色体加倍后当年可得到稳定遗传的优良品种，极大地缩短了育种年限。如下图：

花药离体培养单倍体幼苗种水仙素诱导染色体数目加倍纯合子

②突变体的利用。

a.来源：植物组织培养过程中，由于培养细胞一直处于不断分生状态，容易受到培养条件和外界压力的影响而产生突变，从这些突变的个体中可以筛选出对人们有用的个体，培育新品种。如下图：

b.实质：植物组织培养。

c.形成原因:培养细胞一直处于不断分生的状态，容易受外界一些条件的影响而发生突变。

③细胞产物的工厂化生产：可以利用植物组织培养技术大量生产某些细胞产物，如蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱等。

【易混警示】单倍体育种和突变体利用的比较。

项目原理优点成果单倍体

育种染色体变异明显缩短育种年限单育1号烟草品种，11号水稻和京花1号小麦品种等突变体

利用基因突变产生新基因，大幅度改良某些性状抗花叶病毒的甘蔗；抗盐碱的野生烟草等（二）动物细胞培养

1．概念：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。

2．操作流程。

3.过程解读。

（1）原理：细胞增殖。

(2)动物细胞培养的条件。

①充足的营养供给――微量元素、无机盐、糖类、氨基酸、促生长因子、血清等。

②适宜的温度、适宜的pH。

③气体环境：O2、CO2。

④无菌、无毒环境培养液和培养用具杀菌消毒

培养过程加抗生素杀菌

定期更换培养液，清除代谢产物

（3）动物细胞要分散成单个细胞培养的原因：分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难，因此，这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。同时，分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。

（4）选取幼龄动物的组织、器官作为材料的原因：动物细胞培养时，一般选取幼龄动物的组织、器官，其细胞的分化程度较低,增殖能力强,有丝分裂旺盛，容易培养。

（5）胰蛋白酶在培养过程中的作用及与原代培养和传代培养的联系。

原代培养和传代培养一般均需对细胞进行胰蛋白酶细胞分散处理，区分两种“培养”的关键是看用胰蛋白酶处理的对象。

①第一次：用胰蛋白酶对剪碎的动物组织进行处理，分散后培养，即为原代培养。

②第二次：细胞培养过程中出现接触抑制，用胰蛋白酶使其从瓶壁上脱离下来，分散到多个培养瓶中继续培养，即为传代培养。

（6）细胞贴壁和接触抑制。

悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。

4.植物组织培养与动物细胞培养的比较。

比较项目植物组织培养动物细胞培养培养基的物

理性质固体培养基液体培养基(合成培养基)原理细胞的全能性细胞的增殖培养的成分水、矿质元素、维生素、蔗糖、氨基酸、琼脂等葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等结果新的植株或组织新的细胞系或细胞株目的①苗木的快速繁殖；②培养无病毒植株；③生产药物、香料等；④制备人工种子；⑤单倍体育种获得细胞或细胞的产物（如单克隆抗体）取材植物细嫩的部位或花药等动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织其他条件均为无菌操作，需要适宜的温度、pH、O2等条件【特别提醒】①两种技术手段培养过程中都进行了有丝分裂，都是无性繁殖，都可称克隆，都不涉及减数分裂。

②植物组织培养最终产生新个体，体现了细胞的全能性；动物细胞培养产生大量细胞，不形成新个体，故不能体现细胞的全能性。

【易混警示】原代培养和传代培养的辨析。

原代培养传代培养可有两种表述：a.细胞悬液第一次在瓶中培养，没有分瓶培养之前的细胞培养；b.第1代细胞的培养与传10代以内的细胞培养同样有两种表述：a.细胞悬液培养一段时间后，分瓶再进行的细胞培养；b.传10代以后的细胞培养四、典例展示

例1.通过植物组织培养技术可以快速繁殖、生产药物及培育无病毒的植物等。据图甲、表乙回答问题。

离体的植物器官、组织或细胞①愈伤组织②胚状体培养植物体

图甲植物组织培养过程

表乙：植物的花芽分别在含有不同比例的生长素和细胞分裂素的培养基中的生长状况

A组B组C组D组E组生长素03ppm3ppm0.03ppm0细胞分裂素00.2ppm0.002ppm1.0ppm0.2ppm花芽生

长状况仍是组

织切块形成愈

伤组织愈伤组织

分化出根愈伤组织分

化出嫩芽稍生长(1)离体的植物器官、组织或细胞能够被培养成新的植物体的原因是。

(2)用植物组织培养方法诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状体结构，若包裹上人造种皮，制成人工种子，可能解决有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题。胚状体来源于离体的植物体细胞，其形成过程中要经过的生理变化大体上是图甲中［］和［］过程，在此过程中被培养的细胞始终受的调节(［］内填序号)。

(3)应用植物组织培养技术培养茎尖或根尖组织可获得无病毒植株，其原因是。

(4)从表乙的实验结果可看出：生长素和细胞分裂素是实验中的两种重要物质。其中，新芽形成必需的条件是；而在培养形成完整新个体过程中，对它们的调控关键是。

解析：(1)植物组织培养的原理是细胞的全能性。(2)①是脱分化，得到愈伤组织，②是再分化，得到胚状体。(3)植物的根尖或茎尖分裂快，病毒尚未来得及侵染。培养茎尖或根尖组织可获得无病毒植株。(4)由表乙D组看出，细胞分裂素的浓度大于生长素的浓度，脱分化出嫩芽。在不同培养期，细胞分裂素与生长素的浓度和比例不同，分化的器官就不同，在组织培养过程中，其浓度和比例非常关键。

答案：(1)植物细胞的全能性(2)①脱分化②再分化植物激素(3)植物的茎尖或根尖很少被病毒感染，甚至无病毒(4)细胞分裂素的浓度大于生长素的浓度适当调控好不同培养期的培养基中细胞分裂素与生长素的浓度和它们的比例

例2.（2014・甘肃秦安一中第一次检测卷）某研究小组为测定药物对体外培养细胞的毒性，准备对某种动物的肝肿瘤细胞（甲）和正常肝细胞（乙）进行细胞培养。下列说法不正确的是（）

A．在利用两种肝组织块制备肝细胞悬液时，也可用胃蛋白酶处理

B．为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的抗生素

C．细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是维持培养液的pH

D．将数量相等的甲、乙细胞分别置于相同适宜条件下培养，一段时间后，会观察到甲细胞的数量比乙细胞的数量多

解析：胃蛋白酶最适pH是1.5，而一般细胞培养在pH是6.5~8.0，所以不能用胃蛋白酶处理，A项错误。抗生素可以有效抑制细菌的繁殖，所以可以加入适量抗生素，B项正确。细胞培养过程中，5%CO2的作用是调节细胞培养液的pH值，故C项正确。因为肝肿瘤细胞在适宜条件下具有无限增殖的能力，而普通细胞没有此特性，所以D项正确。

答案：A

例3.回答下列有关动物细胞培养的问题。

(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的。此时，瓶壁上形成的细胞层数是。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是。

(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成细胞，该种细胞的黏着性，细胞膜表面蛋白质(糖蛋白)的量。

(3)现用某种大分子染料，对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不被染色，原因是。

(4)检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选细胞分裂到期的细胞用显微镜进行观察。

(5)在细胞培养过程中，通常在条件下保存细胞。

解析：（1）在动物细胞培养过程中，细胞会表现出接触抑制现象，此时是单层细胞。用胰蛋白酶可以使贴壁细胞从瓶壁上分离开来。（2）随着细胞传代培养代数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现衰老甚至死亡的现象，但极少数细胞可以连续增殖，有些细胞会因遗传物质改变而变成不死性细胞。（3）由于活细胞的细胞膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，而死细胞的细胞膜丧失选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色。（4）由于细胞分裂中期染色体形态固定、数目清晰，因此可作为显微镜观察染色体数目的最佳时期。（5）冷冻或超低温、液氮条件下，细胞中酶的活性降低，细胞新陈代谢的速率降低，故适宜保存细胞。

答案：(1)相互接触接触抑制单层(或一层)胰蛋白酶(2)衰老甚至死亡不死性（大大）降低减少(3)由于活细胞的细胞膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，故活细胞不被染色(或由于死细胞的细胞膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内)(4)中(5)冷冻(或超低温、液氮)

五、巩固训练

1.（2013・北京市东城区期末卷）右图表示一定条件下将胡萝卜的离体组织培育形成试管苗的过程。下列有关叙述不正确的是（）

A．需在无菌条件下将离体组织接种到培养基中

B．图中①②过程分别表示脱分化和再分化

C．利用此过程获得的试管苗均为纯合子

D．此实验说明分化的植物细胞仍具有全部的遗传信息

2.植物组织培养依据的原理、培养过程的顺序及诱导的植物激素分别是（）

①体细胞全能性②离体植物器官、组织或细胞③根、芽④生长素和细胞分裂素⑤生长素和乙烯⑥愈伤组织⑦再分化⑧脱分化⑨植物体

A．①、②⑦⑥⑧③⑨、④

B．①、②⑧⑥⑦③⑨、④

C．①、⑥②⑨⑧③⑦、⑤

D．①、②⑨⑧⑥⑦③、⑤

3.下列关于动物细胞培养的叙述中，错误的是（）

A．用于培养的细胞多取自动物胚胎或幼龄动物

B．培养过程中需要使用胰蛋白酶等获得细胞悬液

C．动物细胞培养时要保证氧气供应，不能通二氧化碳

D．动物细胞培养时的培养基是液体培养基，并要加入血清

4.下列与动物细胞培养有关的表述中，不正确的是（）

A.动物细胞培养需要无菌、营养、适宜的温度和pH等条件

B.用胰蛋白酶作用于离体的动物组织，使其分散成单个细胞

C.放入CO2培养箱中培养动物细胞的主要目的是为了满足细胞对CO2的需求

D.细胞株一般具有恒定的染色体组型、生化特性等

5.（2013・吉林省吉林一中高三第二次摸底考试卷）植物组织培养是克隆植物的一种方法，过程如下图所示，请回答相应的问题。

(1)为了获得脱毒植株，外植体往往取自植物的花芽、叶芽等处的分生组织，其原因是。

(2)培养皿中的培养基除添加营养物质外，还需要添加植物激素，其目的是诱导外植体。

(3)在生产实践中为获得大量的细胞产物，如紫杉醇，可将①放入液体培养基中，经机械作用分散成单个细胞，制备成细胞浮液，再经过即可获得大量细胞。

(4)组织培养过程需要植物生长和繁殖的最适条件，否则在光学显微镜下可能观察到发生异常，进而使植物出现遗传不稳定甚至不育。

(5)植物组织培养技术不仅应用于花卉和果树的快速大量繁殖以及脱毒植株的获取，还广泛用于、、等育种过程中。

6.制造人工种子的原理是在组织培养得到的“胚状体”的最外面用一层有机膜包裹，并在薄膜以内放入一些营养物质，这层膜和这些营养物质分别具有种皮和胚乳的功能（如下图所示）。在制造过程中还可以加入某些农药、菌肥等。据此材料回答下列问题：

（1）胚状体来源于离体的植物体细胞，其形成过程中要经过的生理变化大体上是和。在这一过程中被培养的细胞始终受的调节。

（2）从保证人造种子正常生命力及生态系统物质循环上来看，其外部薄膜应具有等的特点。

7.（2013・福建福州期中卷）下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答：

（1）容器A取材于动物胚胎或幼龄动物的原因是。

（2）容器B中一般先用酶处理，消化组织中的胶原纤维，这利用了酶的性，这样做是为了使细胞分散开来，便于细胞与充分接触。

（3）C瓶内的培养为，这一时期的细胞具有恒定的、和生化特性等。

（4）为了把C瓶中的细胞分散到D瓶中，用处理，然后配制成，再分装。

（5）在D瓶中正常培养了一段时间后，发现细胞全部死亡。原因是。

参考答案

1.C2.B3.C4.C

5.（1）这些部位很少受到病毒等病原体的侵害

（2）脱分化和再分化

（3）愈伤组织细胞分裂

（4）染色体结构和数目

（5）植物体细胞杂交育种基因工程育种单倍体育种

6.（1）脱分化再分化植物激素

（2）半透性（透水、透气性）和能被微生物降解

7.（1）细胞分裂旺盛

（2）胰蛋白专一培养液

（3）原代培养染色体组型病毒敏感性

细胞培养范文第2篇

【关键词】细胞培养室；技术服务与交流；培养室建设与管理

实验室是高等学校从事科研的重要基地，营造一个好的实验研究环境对实验室管理和建设起着至关重要的作用。实验室管理质量的好坏，直接关系到实验研究是否进展顺利。良好的实验室建设，能给研究者带来愉快的心情，同时也能有效的提高研究质量。

细胞培养室是综合实验室的一个重要组成部分, 细胞培养技术是生命科学各研究领域的一种最基本、最重要、也是应用最广泛的研究技术之一。对于高等医学院校来说,各生物医学相关学科均建有细胞培养实验室，其规模、档次、技术水平、使用效率、管理模式、服务保障等方面都缺乏统一的标准，普遍存在着小而全、投资分散、资金浪费、缺乏有效管理、无法提供服务保障、不利于技术交流和创新等诸多问题。本文总结了笔者在细胞实验室管理与建设方面的一些经验，并与广大同行进行探讨。

1 细胞培养室的服务职能

细胞培养除了需要娴熟的操作技术外，更多的体现在培养技术的过程复杂，无菌要求严格。研究人员掌握该门技术的时间周期较长。如果成天陷入清洗，包装和消毒等简单繁琐的劳动中，就会影响研究人员专心致志地从事研究活动中更重要的环节。建立大型细胞培养室，由专人进行工作流程服务，实验室按研究人员的要求提供标准化、规范化的实验用品和材料，可以极大地提高细胞培养实验室的成功率，确保实验器材符合细胞培养的要求，减少研究人员的无谓劳动。因此可以将研究人员从烦琐的劳动中解放出来，安心从事更重要的研究活动。

2 细胞培养实验室的技术交流

细胞培养是一项通用的技术平台。但针对各个研究课题而言，每个研究人员进行细胞培养的目的和要求又各不相同，即既有共性，又有特殊性。一个学科自建的细胞培养室，一般仅局限于本学科领域内有限的研究方向所必需的细胞培养方法和技术，对其它的特殊方法了解不多，因此不利于技术创新。即便是某个研究生掌握的新方法，常常由于毕业分配等原因离开科室，而使新的特殊技术不复存在，不利于特殊技术的建立和完善。

如果大型细胞培养室面向全校开放，自学科的研究人员中具有丰富科研经验的研究人员、博士、硕士等不同层次、不同研究目的和不同要求，他们相互之间不存在利害关系，容易交流，毫无技术保留。每个人的经验和教训很快为大家所用，可极大缩短技术学习的周期和提高新技术的交流。同时，实验室建立了技术档案制度，不同学科的研究人员探索的新技术不会因走人而流失，可以极大地丰富和积累特殊技术，提高技术水平，为后来者提供更多的方便。

3 细胞培养室的建设

3．1 细胞培养室面积和房间安排 实验室的面积应由实验台的长度、净化工作台的大小等仪器设备情况决定，同时还应考虑科研及实验人员有足够的空间，以便安全地进行科研及实验活动。此外,还应设置面积不小于6 m2的缓冲间及与工作分开的更衣柜等。如果细胞培养室面积大于一个标准单元，至少应有两个出口，以随时保持畅通。细胞室里的试验台和仪器布局应合理。一般来说，二氧化碳培养箱和净化工台不应对着门摆放，离心机不应离得太远。

3．2 培养室的环境和设施 ① 照明以不影响对实验中产生的各种现象的观察为基准，一般采用荧光灯。宜设置专门电力变压器供电,提高供电质量和可靠性；②房间装修密闭性应较高，且不宜开设外窗，设窗主要为采光好，必要时还应安装空调。门、窗、墙表面应涂布便于清洗去污和耐腐蚀的材料。由于细胞原代培养要求较高，设置空气净化装置；③对于配制有毒的试剂，产生较大的气味和有害气体的实验应在规范的通风柜中操作。操作有放射性同位素的实验,应配备个人防护用品和淋浴室,其废液应妥善处理。

4 细胞培养室管理制度的建立

4．1 消毒清洁制度 ①每个进入细胞室的工作人员应保证其个人卫生；②进入缓冲间时,应更换洁净的工作服和拖鞋,进入培养室时须戴帽子和口罩。如做原代培养,工作服应消毒；③第一个进入培养室的人员请及时开启空气净化装置,最后离开人员请关闭空气净化装置；④每天实验前必须紫外线常规消毒1 h。每周一次卫生消毒工作并做空气细菌培养检查。每月一次全面清洁工作。

4．2 培养箱的使用 ①每天观察二氧化碳压力表,及时更换二氧化碳钢瓶。同时观察二氧化碳流量指示表,同时培养箱内应放置一温度计,记录其温度与指示表温度是否一致；②培养箱应划分不同区域，不同细胞应放不同区域，同时保持适当的湿度；③有的培养箱有高温消毒功能，注意非管理人员不要动此功能键，以免造成某些元件烧毁。

4．3 洁净工作台的使用 ①使用前1 h应紫外线照射；②洁净台内也应划分不同的区域，如材料区、操作区、污物区等；③注意安全，特别是酒精灯，如有酒精漏出应立即吸干擦净，如发生意外用纱布、棉布类盖灭酒精灯；④ 实验完毕,所用过的器皿、杂物必须清理,同时进行台面清洁。

4．4 液氮瓶和低温冰箱的管理 ①定期检查液氮的容量，并做好记录；②存、取细胞株时，注意防冻安全；③存放细胞株时，根据其种类不同，放置不同盒内，同时应标记好名称和时间并记录；④低温冰箱使用时应按其种类划分不同区域，做好标记并记录。

4．5 实验室资料管理制度 ①收集课题计划书、实验路线、操作步骤、操作记录，各种实验的数据及仪器说明书等；②由负责人指定专人负责并督促不同时段内完成。如果有不规范的资料，请有关人员及时纠正；③资料归档后的资料由专人统一管理。若有些课题涉及专利与发明等知识产权问题，应注意保密。

总之,随着现代科学技术的快速发展,适应高等医学院校科研要求,如何建设好和管理好大型细胞培养实验室对于促进学校科学研究水平的提升是值得探讨的课题。

参考文献

［1］ 张远方. 高校合并后实验室管理模式的探讨. 实验室研究与探索，2003，22（1）：118-120.

［2］ 崔冬生，李增宁，顾平，等. 细胞培养室管理规则. 华北煤炭医学院学报，2004，6（3）：395-396.

［3］ 陈乃清，宋平，李晓迎，等. 改革细胞生物学实验教学,提高学生综合素质. 实验技术与管理，2002，19（2）:8-11.

细胞培养范文第3篇

关键词：羊水细胞；染色体异常；染色体核型分析；产前诊断

降低出生缺陷提高出生人口素质是卫生部门的长期工作目标，当前，羊膜腔穿刺术仍然是应用最广泛而且准确的产前诊断方法。收集羊水中的胎儿上皮脱落细胞进行培养，从而获得胎儿染色体中期分裂相，进行核型分析，是防止染色体病患儿出生的有效手段。

1 资料与方法

1.1一般资料 2013年1月～2014年2月来我院围产保健科门诊及遗传咨询门诊就诊的具有产前诊断指征的孕妇879例，年龄18～44岁，孕龄18～22+6w，其中产前筛查高风险551例，高龄孕妇298例，其余30例（不良孕产史12例，彩超提示胎儿畸形16例，先天愚型孕妇1例），孕妇要求行羊膜腔穿刺术1例。

1.2方法

1.2.1采样 在常规无菌条件下行羊膜腔穿刺术，B超引导下进行穿刺，最初的1～2ml羊水弃去，随后抽取羊水20ml，注入2支15ml无菌离心管中（每支10ml）离心。

1.2.2接种 羊水标本以2100r/min离心后弃上清液，加羊水培养基（AmnioMAX-Ⅱ）5ml于离心管中混匀后移入羊水培养瓶中，后置于5%CO2，37℃培养，按卫生部产前诊断行业标准（WS322《胎儿染色体异常与开放性神经管缺陷的产前筛查与诊断技术标准》）要求分别采用两套培养系统进行培养与制片。

1.2.3收获 培养7d后观察细胞生长情况，视情况换液，当培养瓶中有9～16个细胞克隆贴壁生长，且细胞克隆中有较多大、园、折光性强的分裂细胞时，加秋水仙素后继续培养2～4h再进行收获。

1.2.4制片 经过低浓度胰酶短时消化、刮细胞、离心、低渗、固定等步骤，将获得的沉淀制成细胞悬液，湿冰片滴片，每瓶培养物分开制片编号，经过75℃烤片3h、G显带。

1.2.5分析 每例标本选择形态适中、显带清楚、带数320条以上的核型分析6个，计数20个核型，如遇有疑问的标本则需增加分析和计数的分裂相数。本实验室从实验到核型分析均分两组，由两人进行，两组分析878例羊水染色体结果均一致。

2 结果

2.1共采集标本879例，培养成功878例，培养成功率达99.89%。在成功培养的878例羊水染色体分析中，核型为46，XY451例（51.37%），46，XX427例（48.63%），检出染色体异常15例，占受检人数的1.71%（15/878），染色体数目异常9例（60%），其中常染色体数目异常8例，分别为21三体6例，18三体1例，13三体1例；性染色体数目异常1例，核型为47，XYY；染色体结构异常6例（40%），其中罗伯逊易位3例，其他平衡易位3例；正常变异染色体81例（9.21%），其中inv（9）12例；D、G组染色体的短臂和随体增加共46例；1、9、16号染色体异染色质区增加共18例；Y染色体长臂增加5例。

2.2行羊膜腔穿刺术的879例孕妇，有1例孕妇术后1d出现下腹疼痛，因及时就诊，未发生流产。术后均未发生感染、胎盘早剥、阴道流血、胎膜早破、羊水栓塞及胎儿损伤等并发症。

3 讨论

3.1羊膜腔穿刺术在产前诊断中的应用 在产前及时、安全、准确地诊断胎儿遗传病，有利于医务人员和孕妇共同协商、选择恰当的处理方案。产前诊断的方法很多，包括细胞遗传学、生化遗传学以及分子遗传学等。其中通过羊膜腔穿刺、培养羊水细胞、进行核型分析的细胞遗传学方法诊断胎儿染色体核型异常，是目前临床上使用最广泛的一种方法。羊膜腔穿刺羊水细胞培养是当前细胞遗传产前诊断的金标准[1]。

羊膜腔穿刺是一种通过B超引导，经腹部穿刺羊膜腔收集羊水的方法。我们在实际工作中深刻地体会到，只要严格遵循操作规范，积极探索操作方法，运用羊膜腔穿刺开展产前诊断具有非常高的临床价值。

羊膜腔穿刺作为一种创伤性诊断方法，其对母亲和胎儿的影响是导致孕妇及其家属焦虑的主要原因。据文献报道，孕中期羊膜腔穿刺的流产率在0.5%～1%[2]。为了减轻创伤，我们严格控制操作指征，努力预防感染，术后密切随访，及时处理潜在风险。在我们的临床操作中，并没有发生术后流产的情况。

多数情况下，在孕中期（18～22+6w）行羊膜腔穿刺效果较好。穿刺过早，虽然有活性的羊水细胞比例高，但羊水细胞数量不足，对胎儿损伤较大；过晚穿刺，羊水细胞活力减弱，培养效果欠佳[3]。

3.2羊水细胞核型分析诊断唐氏综合征 唐氏综合征（21三体综合征）是常见的三体综合征，是由于患者细胞内多了1条21号染色体造成的。表现为智力中重度低下、特殊面容及各种先天畸形的综合征，发病率为1/600～1/800[4]。在妊娠过程中，患该病的胎儿更容易流产、死产，因此孕中期的检出率应高于新生儿[5]。在我们检出的孕中期染色体核型异常的胎儿中，40%的为21三体综合征，并已全部引产。

研究发现，在某些特定人群中该病的发生率明显增高，包括：①筛查阳性者；②母亲分娩时年龄35岁以上；③曾生育唐氏综合征患儿；④父母有一方是累及21号染色体罗伯逊易位或其他平衡易位携带者或21号染色体镶嵌体。对于这部分人群，是非常有必要行孕中期羊膜腔穿刺术的。在我们发现的6例唐氏综合征患者中，3例孕妇为产前筛查高风险，2例孕妇为高龄，1例孕妇本人为唐氏综合征患者。

3.3其他异常核型的产前诊断 据文献报道，新生儿中染色体异常的发生率为1/150～1/120。其中，21三体发生率最高，其次为性染色体异常和结构性染色体异常[6]。筛选的基本原则是一方面尽可能让所有潜在的患者被检出，降低漏检率，另一方面应严格控制接受产前诊断的孕妇例数，以减少诊断过程对产妇身体和心理的不良影响以及医疗资源的不当耗费。本研究中1例18三体和1例13三体，它们是因彩超提示畸形而作羊水穿刺，穿刺后就引产，其表型与染色体结果相符；1例47，XYY，它是最常见的性染色体疾病之一，小孩已出生，其表型并未见异常。XYY综合征的产前诊断指征不明，多为零星发现。

染色体易位是染色体结构异常中最常见的情况。如果易位没有导致遗传物质的丢失，并不表现出病理特征，即为平衡易位。亲代中一方若为平衡易位携带者，其子代核型可能出现3种情况：①正常；②表型正常的平衡易位携带者；③不平衡易位。出现不平衡易位的胎儿往往流产，如果存活，常表现为不同程度的畸形或发育缺陷。因此夫妇双方中一方为平衡易位携带者的，也应建议接受产前诊断。本研究中，发生罗伯逊易位和其他平衡易位有6例羊水标本，对其表性正常的父母作外周血染色体检查，发现父母与胎儿核型一致的有5例，有1例父母染色体均正常，说明该胎儿易位为新发生的。对于6例的随访，已正常分娩，新生儿表型均正常。

3.4染色体正常变异的产前诊断 染色体变异属遗传多态性改变，一般不引起临床症状[7]。在878例羊水细胞染色体核型中，染色体正常变异的异常检出率为9.21%，inv（9）12例，全部为臂间倒位，D、G组染色体的短臂和随体增加最多达46例，1、9、16号染色体次缢痕增加共18例，Y染色体长臂增加（大Y）5例。81例染色体正常变异者中有79例做了父母的外周血染色体检查，结果均与胎儿一致。胎儿出生后进行了随访表型均为正常。

对于染色体病的产前诊断，逐渐受到医务工作者和广大孕产妇的重视。经羊膜腔穿刺、培养羊水细胞、开展产前诊断的技术虽然相对安全、有效，但如何准确界定适用指征、改良细胞培养技术，尤其是如何更加精确描述染色体结构异常乃至基因的缺失、突变等，仍待我们进一步深入探索。

参考文献：

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细胞培养范文第4篇

【关键词】 PC3前列腺癌细胞;非CO2依赖;survivin;caspase3

Methods Prostate carcinoma cell line PC3 was cultured using　CO2independent culture cell system and CO2dependent culture cell system at 37℃ in 50mL/L carbon dioxide incubator and at 37℃ in air incubator. The pH of culture medium with the two culture cell systems was detected. Differences in cell viability were assayed with CCK8 test and colony forming assay. The expressions of survivin and caspase3 mRNA of cell culturing with the two systems were detected by RTPCR assay.　Results Under the two culture cell systems， the pH trend was the same (P>0.05)， PC3 cell proliferation and the expressions of survivin and caspase3 mRNA of the cell had no obvious differences (P>0.05).Conclusion CO2independent culture cell system is parallel to CO2dependent culture cell system in their effects on cell proliferation and gene expression.

KEY WORDS: PC3 prostate carcinoma cell; CO2independent; surviving; caspase3

前列腺癌(prostate carcinoma， PC)是男性泌尿生殖系统中常见的恶性肿瘤。目前，我国临床发现的前列腺癌有逐年上升的趋势[1]。20世纪90年代我国前列腺癌的发病率较50年代增长了近5倍[2]。其治疗方法包括前列腺切除术、内分泌治疗等，但其预后欠佳。

而近年来，以抗肿瘤药物个体化治疗为目的的抗肿瘤药物敏感性试验愈来愈受到重视，王共先等[3]探讨了前列腺癌细胞的原代和传代培养的方法;张勇等[4]曾对激素难治性前列腺癌细胞进行化疗药物敏感性比较。但是，这些研究均基于CO2依赖型细胞培养系统。它不仅需配备CO2培养箱及相关设备，耗费多，而且对操作人员技术水平要求高，不便于该试验的普及推广。而非CO2依赖型细胞培养系统(专利申请中)不仅不需要CO2培养箱，可节省资金，而且操作方便，可以为众多的科研人员提供一种新的选择。目前，对前列腺癌细胞采取非CO2依赖型细胞培养系统及在此基础上进行前列腺癌个体化药敏试验国内未见报道。这已经成为体外药敏试验在临床广泛应用必须迫切突破的瓶颈。本研究旨在探讨非CO2依赖型肿瘤细胞培养系统对PC3细胞增殖的影响及其与CO2依赖型肿瘤细胞培养系统有无差异。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人激素难治性前列腺癌细胞株PC3

(中国科学院上海生命科学院细胞资源中心)，DMEM培养液(GIBCO公司)，培养基配制按GIBCO公司说明书，非CO2依赖型细胞培养基的配制为DMEM培养液加入某些成分(专利申请中)后调至pH值约7.4。小牛血清(GIBCO公司)，RTPCR反应体系(Promega公司)。CCK8试剂(大连宝生物有限公司)，caspase3 mRNA及survivin mRNA引物由上海赛百盛生物技术有限责任公司合成。

1.2 实验分组 共分为4组，即：37℃培养箱、大气环境下CO2依赖型细胞培养(大气 A)组，37℃培养箱、大气环境下非CO2依赖型细胞培养组(大气B)，37℃(50mL/L，CO2)培养箱CO2依赖型细胞培养(CO2A)组，37℃

(50mL/L，CO2)培养箱非CO2依赖型细胞培养(CO2B)组。

1.3 细胞培养 PC3细胞均用含100mL/L胎牛血清(FBS)、100u/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基，在37℃培养箱、大气环境下和37℃(50mL/L，CO2)培养箱中培养，实验用细胞为接种后24h的对数生长期细胞。

1.4 两种系统培养基pH值的测定 将两种系统培养基分别置于37℃培养箱、大气环境中和37℃(50mL/L，CO2)培养箱中培养，24h后开始测定pH值，连测7d并记录数值。

1.5 克隆形成后的计数 取对数生长期细胞用2.5mL/L胰蛋白酶消化，用CO2依赖型细胞培养基和非CO2依赖型细胞培养基配成单个细胞，以1500个/孔细胞接种于6孔培养板中，每孔体积2mL培养基。分别置于37℃培养箱、大气环境中和37℃、50mL/L CO2培养箱中进行培养2周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇5mL，固定15min。然后去固定液，加适量Giemsa/结晶紫应用染色液染10～30min，后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，在低倍显微镜下计数大于50个细胞的克隆数。

1.6 细胞增殖曲线的绘制 使用上述两种培养基在96孔板中接种1.5×103/孔的细胞，每孔体积200μL，连续培养7d。用MTS法绘制细胞生长曲线。每孔加入10μL CCK8液，分别在37℃培养箱、大气环境中和37℃、50mL/L CO2培养箱中培养，2h后吸出上清，用Model550 ELISA plate reader读取450nm的吸光度。活细胞的数量与吸光度成正比。

1.7 流式细胞仪检测细胞的凋亡率及对细胞周期的影响 用上述两种培养基置10cm皿中培养细胞，分别在37℃培养箱、大气环境中和37℃、50mL/L CO2培养箱中进行培养。24h贴壁后收集细胞，制成单细胞悬液，700mL/L乙醇固定，4℃保存过夜，-20℃保存(有效期为1周)。检测前用PBS洗去固定液，加入20μL RnaseA，37℃孵育30min后，暗处加PI染液，冰浴30min，染色后以300目筛网过滤。调整细胞浓度为

1×105～1×106/mL，上流式细胞仪检测，激发光源为氩离子，激发波长488nm，用Multicycle DNA分析软件行细胞周期的测定。

1.8 Survivin、caspase3的测定 取对数生长期PC3细胞按大气A组、大气B组、CO2A组、CO2B组分别孵育24、48h后，使用Trizol试剂按照一步法抽提各组细胞株的总RNA，取5μL RNA稀释10倍分别测定细胞总RNA在260nm和280nm处的吸光度值(A)，并计算RNA的含量和纯度。以1μL总RNA为模板，20μL体系进行逆转录合成cDNA。将合成的cDNA稀释20倍后进行PCR扩增，caspase3 mRNA上游引物：5′TGACCGAGGCTACATTCA

GATGACACC3′，下游引物：5′CAAGAGAGTTG

GGCTGACCAGAAACAC3′，扩增产物365bp;survivin mRNA上游引物：5′CCCTTTCTCAAGGAC

CACCGCATC3′，下游引物：5′CACTGAGAACG

AGCCAGACTTGGC3′扩增产物

133bp;βactin上游引物：5′AGTGTGACGTGGACATCCGCA3′，下游引物：5′ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC3′，扩增产物243bp。加入survivin上下游引物各

0.25μL、caspase3上下游引物各0.25μL，取5μL PCR产物于25g/L琼脂糖凝胶电泳来分析结果，以DNA Marker来指示大小。

1.9 统计学处理 所有实验均重复3次，用±s表示。应用SPSS 11.0软件进行统计学处理，重复测量的方差分析采用F检验。P

2 结 果

2.1 培养基pH值的比较 CO2A组、CO2B组、大气A组、大气B组的pH值见图1。大气B组与CO2A组和CO2B组pH值未见显著性差异(P>0.05)，大气A组与CO2A组、CO2B组pH值有显著性差异(P

图1 不同组培养基连续7d 的pH值的测定

Fig.1 Testing of 7day pH value in culture medium of different groups

2.2 克隆数的比较 CO2A组、CO2B组、大气A组和大气B组的肉眼克隆见图2。大气B组(373±10)与CO2A组(352±11)和CO2B(362±11)组未见显著性差异(P>0.05)，大气A组(58±5)与CO2A组、CO2B组有显著性差异(P

2.3 增殖曲线的比较 由图3可知，CO2A组和CO2B组均与大气B组细胞增殖无显著变化，差异不具有显著性(P>0.05);大气A组与各组相比细胞增殖显著下降，具有显著性差异(P

2.4 细胞周期及凋亡率的比较 细胞凋亡数随着作用时间的延长而增加，大气A组更加明显。CO2A组与大气B组凋亡率无显著变化，差异不具有显著性(P>0.05);大气A组与各组相比凋亡率显著升高，具有显著性差异(P

2.5 Survivin、caspase3因子表达的比较 不同组培养细胞24、48h后提取总RNA，逆转录后进行RTPCR，结果显示：大气B组与CO2A组、CO2B组表达survivin、caspase3未见明显变化。随着培养时间的延长，大气A组caspase3表达增高，survivin mRNA的表达并未明显变化(图5、图6)。

3 讨 论

大多数细胞系在pH值7.4生长最好，不同细胞株之间差别不大。但是，一些正常成纤维细胞系在pH 7.4～7.7生长最好，而一些转化细胞可能在pH 7.0～7.4生长的会更好些[5]。据报道上皮细胞可以维持在pH 5.5[67]。

一般CO2依赖型细胞培养系统中培养基的pH在7.0～7.4之间。由于碳酸盐pH缓冲系统是一种生理pH缓冲系统(人体血液中最重要的pH缓冲系统)。

所以，大多数培养液用它来维持稳定的pH。为了维持稳定的pH，培养箱中的CO2需要维持在20～100mL/L之间，以保持培养液中溶解的CO2的浓度。

由于空气中的CO2浓度很低，如果细胞不在CO2培养箱中培养，培养液中的HCO-3会被耗尽，这样会影响细胞的正常生长，甚至导致细胞死亡。所以，大部分细胞的培养，还是需要CO2培养箱。而CO2非依赖型细胞培养系统的培养基中某些成分也可使pH值稳定在7.4左右，维持弱碱环境，达到与普通培养基一样的效果，有利于细胞株的生长。大气B组与CO2A组pH值比较无显著性差异(P>0.05)即可证明。而CO2依赖型细胞培养系统在37℃培养箱(大气环境)的效果明显差于非CO2依赖型细胞培养系统在37℃培养箱(大气环境)的效果。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins， IAPs)中结构独特的新成员，于1997年由耶鲁大学ALTIERI等[8]用效应细胞蛋白酶受体1(effecter cell protease receptor1， EPR1)cDNA在人类基因组库的杂交筛选中首先分离出来。它可直接抑制末端效应器caspase3和caspase7并干扰caspase9的活性，阻止细胞凋亡[9]。而survivin基因在恶性肿瘤中的高表达与肿瘤的凋亡抗性密切相关。Caspase属于半胱氨酸蛋白酶家族，caspase家族在细胞凋亡信号传导过程中起到核心作用。例如，caspase3在凋亡途径处于下游，是细胞凋亡的关键信号酶[10]。凋亡的三种途径最后汇聚到同一通路，均切割激活caspase3，最终致细胞凋亡[11]。因此，检测caspase3的活性有助于发现早期的凋亡细胞[12]。本实验结果显示大气B组与CO2A组、CO2B组表达survivin、caspase3未见明显变化，而随着培养时间的延长，大气A组可使caspase3表达水平相应升高，survivin mRNA表达水平未见明显变化。从而，证明了非CO2依赖型细胞培养体系在大气环境下减缓细胞凋亡的速率同CO2依赖型细胞培养体系无显著差别。

综上所述，非CO2依赖型肿瘤细胞培养系统对PC3细胞增殖与CO2依赖型肿瘤细胞培养系统并无差异。而传统的CO2依赖型细胞培养系统不仅需

要CO2培养箱(价格昂贵)，而且对于操作人员技术要求高，步骤繁琐。本系统的应用不仅不需要CO2培养箱，而且节省资金，操作方便，可以为众多的科研人员提供一种新的选择。另外，本实验将为该套系统的应用积累相关经验，并为该套系统的规模化推广奠定基础。同时，亦将有助于突破体外药敏试验的瓶颈，促进体外药敏试验的实用性及准确性的提高，使肿瘤患者的个体化治疗逐渐成为现实。

参考文献

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细胞培养范文第5篇

关键词：Moodle平台；动物细胞培养；资源设计

中图分类号：G434

如今网络资源丰富，大部分都呈现线性特征，多数网站主要以文本堆积、链接、知识点罗列为主，存在着如：学习系统导航性不强[1]、轻网络教学资源设计[2]、轻知识获取与互动[3]等不足，尤其互动性和生成性网络学习资源较为薄弱，学习者达不到利用网络有效学习的目的。Moodle是由澳大利亚MartinDougiamas博士主持开发的课程管理系统，Moodle平台主要包括网站管理、课程管理、学习管理三大功能，浙江万里学院对Moodle平台进行了二次开发，能利用Moodle平台辅助日常教学、进行课程日常管理和学习资源建设、进行深入研究教学和学习等，动物细胞培养实践操作性强，实验前需要学生利用教学资源进行学习，撰写实验设计报告，事先预习实验过程，熟悉操作流程，我们在利用这平台强化《动物细胞培养》的学习资源建设，探索解决实验课老师上课讲解占用时间过多，学生实验时间被压缩、不足，老师示范指导不够，实验教学效果不理想的不足方面，作了一些探索与实践。

一、基于Moodle平台学习资源设计的原则

学习资源具有动态、共享、直观等等特点，在设计上需要遵循一下三个原则：

1.教学性原则

学生是教学的主体，教师是导学者，教师要学会判断学习资源的价值，当教师在教学设计上发现有价值的“知识点”时及时上传，使全体学生马上能受益，资源的教学价值得以实现。

2.实用性原则

教师要选择适合网络平台的教学方法和手段来支持教学，资源与教学紧密结合，能应用于实验课程实践。

3.融入性原则

学习资源的生成与学生积极的融入紧密相关，学习资源的设计必须以学生为学习主体参与为基本前提，才能调动学生的学习积极性，进而转化为学习的动力、产生学习成效。同时，教师作为导学者，要充分发挥学生的主观能动性，鼓励学生参与到网络平台的学习、交流探讨中，并将学生收集到的网络资源及时上传到平台，营造自由开放、交流合作的学习氛围。

二、基于Moodle平台学习资源设计的策略与实践

1.教学目标的设计

教学目标的设计，要考虑学生个体差异，同时关注期望目标与实际结果的差异。教学设计要以问题为导向、以项目为抓手入手，提高学生的学习积极性，使其主动参与到实验中。如为了增强学生对于动物细胞培养兴趣，一开始就提出“病毒性疫苗是如何制备的”这一问题，引导学生去思考如何培养细胞为病毒的繁殖打下基础，达到动物细胞培养的教学目标。

2.学习资源的设计

学习资源的设计应更灵活、生动，以项目为基本点，尽量利用D片、虚拟实验将实验形象展示出来，并且将学生感兴趣的实验内容贯穿于学习资源中，提高学生的学习兴趣。

3.实验情境的设计

在新的实验项目开始前，教师通过问题以引起学生的好奇与思考，激发学生的求知欲和实验兴趣，比如在讲授“新城疫灭活疫苗的制备”，提出新城疫病毒易在哪些细胞中生长、如何制备这些细胞等问题，让每一位学生撰写“实验设计报告”，写出实验中所需要的器材、培养用液、实验操作步骤、可能出现的问题等，并让学生们在小组内相互讨论，形成小组设计报告，再在全班交流，上传到moodle平台，经过老师审核后开展实验，要求学生在moodle平台观看虚拟实验，写出实验体会、感悟，这样，有助于学生激发学生的学习积极性，加深实验前的感知，锻炼学生准备实验的能力，以此激活学生的思维，带着问题阅读有关资料，积极地探索，使学习达到良好的效果。

4.考评体系的设计

《动物细胞培养》实验课的考核重点是学生实验设计能力、动手能力、分析能力、创新能力等，考察学生在实验过程中操作是否规范、是否掌握了某种实验操作技能、是否达到了实验要求、能否对实验结果进行有效分析、有无创新性的见解等。学生实验评价采用“平时表现（占10%）实验设计报告（占10%）+实验操作考试（占20%）+实验原理考试（占20%）+实验总结报告（占20%）+小组内互评（占20%）”的方式，强化实验过程性考核，体现学生综合素质。

5、实验完成后进行实验结果的分析

动物细胞培养技术是一门对操作技能要求高、实验结果又常容易失败的实验，而且实验的多数内容都涉及到对细胞的形态、大小、数量、活性等进行观察分析，要求学生在每一次实验课结束后，完成对实验结果分析、判断，这样，不仅能够加强感性认识，还能找出实验成功或者失败之处，有利于在提高下次实验的成功率。

综上所述，动物细胞培养技术作为一门实践性很强的课程，通过moodle平台的有效学习资源，使学生更好地掌握和熟悉细胞培养的基本技术，并为其今后其它课程的学习和将来毕业后的工作创造条件、奠定基础。

参考文献：

[1]张强.网络课程现状调查分析[J].甘肃联合大学学报（自然科学版）.2009.23（4）：85-88

细胞培养范文第6篇

【关键词】 淋巴细胞微核； 标本制作； 健康监护； 放射

淋巴细胞微核测定是细胞遗传学方法之一，对淋巴细胞微核率的观察，不仅能早期发现辐射效应，而且还能对受照个体进行生物剂量估算，是《职业健康监护管理办法》中接触放射性工作人员进行健康监护中的必检项目之一［1］，是评价放射工作者所受辐射损伤的一项非常有意义的指标。为了提高微核的检出率和阅片效率，应严格按照操作规程进行实验操作。笔者所在实验室是北京市能够承担放射性危害因素职业健康监护工作为数不多的几家单位之一，现将工作中总结的一些具体的操作方法和注意事项报道如下。

1 资料与方法

1.1 样本来源 接触放射性工作的岗前、在岗及离岗人员。

1.2 方法

1.2.1 接种 消毒1640培养基，抽静脉血接种于1640培养基内混匀，浓度要适当（血量：25～30滴）。瓶上写清楚受检者姓名或者实验室自行编号。

1.2.2 培养 接种后将培养基放于（37±0.5） ℃恒温培养箱内培养72 h。

1.3 收获

1.3.1 收集细胞 将细胞悬液混匀倒入编好号的洁净离心管中，1500 rpm离心5 min，弃上清液。

1.3.2 低渗 加入0.075 mol/L氯化钾低渗夜5 ml，用滴管轻打混匀，低渗10 min。

1.3.3 预固定 加入1 ml固定液，轻轻混匀后1500 rpm离心5 min。固定液为甲醇:冰醋酸（3∶1）。

1.3.4 固定 弃上清液，加入5 ml固定液，轻轻混匀，静置10 min，1500 rpm离心5 min，弃上清液。重复操作固定步骤2～3次，直至固定液透明为止。

1.3.5 制悬液 弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液打匀。

1.3.6 滴片 吸取细胞悬液滴在一张洁净的4 ℃湿的载玻片上，轻吹散，风干，及时正确编号。

1.3.7 染色 Giemsa染液染色20 min左右，细水冲洗多余染液，风干。

1.3.8 镜检 光学显微镜下计数1000个胞体完整、已转化的淋巴细胞，计数淋巴细胞微核，以千分率（‰）表示。

1.3.9 微核判定标准 微核应位于完整的淋巴细胞胞浆内，与主核完全分开（如有重叠或相切，必须看到各自的完整核膜），呈圆形或椭圆形，结构与主核相同，着色与主核一致或略浅，不折光，大小为主核的1/3以下的小核［2］。

1.4 好片的评价标准 细胞数量多、分布均匀、密度适中、染色清晰、核浆分明、透明度好。

2 注意事项

2.1 要严格进行消毒，避免细胞在培养过程中细菌污染，影响制片效果及阅片。

2.2 接种血液量要适当，太多不容易打散，太少不易观察。以5 ml注射器接种约25～30滴为宜。

2.3 培养温度应严格控制在（37±0.5）℃。

2.4 低渗的目的是使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀。低渗过度，淋巴细胞也会破裂；低渗不足则胞浆厚，可能使微核漏检。低渗液的量、处理时间均与细胞的数量有关。低渗处理浓度及时间要适当，且低渗后混匀细胞时一定要轻，否则会引起膜破裂。

2.5 离心速度过高或时间过长，细胞团不易打散或细胞破碎；反之，细胞易丢失。

2.6 固定液应在使用前新配制。微核制备操作过程中最关键的步骤是低渗处理，根据接种血液量多少决定加低渗液量的多少，将培养物全部转入洁净离心管后，应尽快加入固定液进行预固定。

3 讨论

淋巴细胞微核是细胞的染色体发生断裂之后，细胞进入下一次分裂时，染色体片段不能随着有丝分裂进入子细胞，而在胞浆中形成直径小于主核1/3的碎片，它可以是整条染色体，也可以是染色体片段，嗜色性和主核一致，完全与主核分开的圆形或椭圆形的微小核。各种理化因素作用于细胞染色体，影响其正常的功能，使细胞的DNA复制和染色体分裂受到破坏，纺锤体的功能受到影响产生微核，是染色体畸变间期表现出的一种损伤类型。微核率可以反映致畸因素对细胞的损伤程度和染色体稳定性［3］。淋巴细胞微核测定是放射工作人员职业健康检查的特殊检查项目，是最直接反映辐射损伤的检查项目之一。随着核科学的快速发展，放射工作人员逐渐增加以及职业病防治法的颁布实施，职业健康检查日益受到重视，参加职业健康检查的放射工作人员逐年增多。淋巴细胞微核测定的特点是：测定对象为活的细胞，全部为手工操作、环节多、时间长，易受各种因素的影响而导致结果的偏离。这就要求必须做好每一步工作，才能制备出良好的淋巴细胞微核片，提高淋巴细胞微核检出率和阅片效率，及时准确反映辐射损伤情况。

淋巴细胞微核标本的制作每一步都非常关键，出现失误就会导致片子质量出现问题，影响检查结果。实验人员应严格按照操作规程进行实验操作，以确保微核标本片的制备质量，提高微核检出率和阅片效率，及时准确反映辐射损伤情况，对辐射防护作出正确评价，对放射工作人员的健康进行监护，对意外照射、突发事件估算剂量，为放射患者诊断和治疗提供可靠依据。

参 考 文 献

［1］ 北京市卫生局.《职业健康监护管理办法》附件1［R］.职业卫生文件汇编（一），2000:47-48.

［2］ WS/T187-1999.淋巴细胞微核估算受照剂量方法［M］.北京:中国标准出版社,1999:146.

细胞培养范文第7篇

【摘要】 目的 探讨银屑病成纤维细胞对角质形成细胞增殖的作用。方法 原代培养银屑病成纤维细胞、正常人成纤维细胞，无血清培养的角质形成细胞，四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)检测银屑病成纤维细胞、正常人成纤维细胞培养上清对角质形成细胞增殖的影响。结果 银屑病成纤维细胞培养上清培养的角质形成细胞的增殖活性高于正常人成纤维细胞培养上清组和无血清培养的角质形成细胞。结论 银屑病成纤维细胞可能通过释放某些可溶性细胞因子促进角质形成细胞的增殖，维持银屑病皮损表皮的过度增殖状态。

【关键词】 银屑病 成纤维细胞 角质形成细胞 增殖

Effects of cultured supernatant of fibroblast from psoriaticlesions on proliferation activity of keratinocytes

【Abstract】 Objective To investigate the effects of fibroblasts in psoriatic lesions on proliferation activity of keratinocyte.Methods Fibroblasts in psoriatic lesions and normal skin were primarily cultured seperately. Keratinocytes in normal skin were also cultured by Keratinocyte Cell serum free medium(KC-SFM). The effects of cultured supernatant of fibroblast from psoriatic lesion or normal skin on keratinocytes were determined by MTT colorimetric methods.Results As opposed to cultured supernatants of normal fibroblasts or KC-SFM， cultured supernatants of fibroblasts from psoriatic lesions increased the proliferative activity of keratinocytes significantly.Conclusion Fibroblasts in psoriatic lesions can promote the proliferation of keratinocytes and maintain the hyperproliferative state of psoriatic epidermis， which may be mediated by soluble cytokines released by fibroblasts.

【Key words】 psoriasis fibroblast keratinocyte proliferation

银屑病是一种以表皮过度增殖为特征的慢性炎症性皮肤病，至今，造成表皮过度增殖的原因尚不十分清楚。本实验通过观察银屑病成纤维细胞培养上清和正常人成纤维细胞培养上清对角质形成细胞影响，探讨成纤维细胞在银屑病发病中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂 DMEM培养基、角质形成细胞无血清培养基(KC-SFM)、 Dispase(Gibco，USA)，MTT为(Sigma，USA)。完整的KC-SFM配制：KC-SFM l00ml加入EGF 0.5μg及BPE 5mg。成纤维细胞培养液配制：DMEM 80ml加入胎牛血清 20ml。银屑病患者活检标本，健康成人包皮均来自西京医院门诊。

1.2 成纤维细胞培养 取病理确诊的银屑病患者活检标本，0.25％洗必泰液消毒10min，无菌生理盐水漂洗3次，剪去皮下组织，0.25％Dispase消化4℃，16h。分离表皮，将真皮剪碎，0.25％胰蛋白酶室温消化15min，终止消化，自然沉降，收集上层细胞悬液后，重复消化收集。细胞悬液1200r／min离心洗涤2次，含10％胎牛血清DMEM重悬，调整细胞浓度为105／ml，接种于96孔培养板。37℃，5％CO2：孵育，隔日换液，至70％融合，收集换液后48h后的培养上清备用。取手术切除的健康成人包皮，以相同方法培养正常人成纤维细胞，收集培养上清。

1.3 角质形成细胞培养 取手术切除的健康儿童包皮，0.25％洗必泰液消毒10min，无菌生理盐水漂洗3次，剪去皮下组织，并剪成5mm×10mm［2］皮块，0.25％Dispase消化 4℃，16h。分离表皮，表皮用0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶 (1：1)室温消化10min，吸管吹打表皮，尼龙网过滤收集基底细胞，含10％胎牛血清DMEM，1000r／min离心洗涤2次，每次10min。用KC-SFM调整细胞浓度为105／ml，接种于96孔培养板。37℃，5％CO2孵育，隔日换液，至70％融合。每孔分别加入 100μl银屑病和正常人成纤维细胞培养上清，再加入100μl完整的KC-SFM，孵育72h，每组设3个复孔。

1.4 MTT法检测细胞代谢活性 MTT法观察银屑病成纤维细胞、正常人成纤维细胞的生长曲线，每组设3个复孔；于培养的24h、48h、72h用MTT法检测正常人成纤维细胞培养上清和银屑病成纤维细胞培养上清处理的角质形成细胞的代谢活性(KC-SFM为阴性对照)；每孔分别加入20μl MTT溶液(浓度为5g／L，用PBS稀释)，孵育4h后吸除，二甲基亚砜显色10min，用酶联免疫检测仪以490nm检测A值。

1.5 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件对数据进行配对t验。

2 结果

2.1 成纤维细胞生长曲线 见图1，MTT法观察培养的银屑病成纤维细胞和正常人成纤维细胞的生长速度，每天测定的A490nm值，共7d，经配对t检验比较差异无显著性(P＞0.05)。

2.2 成纤维细胞培养上清对角质形成细胞代谢活性的影响 用MTT法检测角质形成细胞代谢活性，采用SPSS10.0统计软件对数据进行配对t检验后发现，银屑病成纤维细胞培养上清处理的角质形成细胞的代谢活性明显高于正常人成纤维细胞培养上清处理的角质形成细胞和KC-SFM培养的角质形成细胞(P值均小于0.05)，正常人成纤维细胞培养上清处理的角质形成细胞和KC-SFM培养的的角质形成细胞代谢活性差异无显著性(P>0.05)。(见表2)

3 讨论

银屑病是一种以表皮过度增殖为特征的慢性炎症性皮肤病，成纤维细胞对银屑病角质形成细胞异常增殖的影响日益受到人们的重视。Saiag P用皮肤类似物模型发现银屑病成纤维细胞可维持银屑病皮损表皮的高增殖状态，而正常人成纤维细胞则不能维持银屑病皮损表皮的高增殖状态，因此，推测银屑病的原发缺陷可能在真皮［1］。本实验发现银屑病成纤维细胞培养上清能明显促进角质形成细胞的增殖，说明银屑病成纤维细胞对角质形成细胞增殖的作用并不依赖细胞间的相互接触。

有研究发现银屑病成纤维细胞能产生较高水平的IL-6［2］、IL-8［3］、角质形成细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)［4］、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)［5］、内皮细胞刺激血管生长因子 (endothelial cell stimulating angiogenesis factor，ESAF)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)［6］。笔者在实验中发现银屑病成纤维细胞和正常人成纤维细胞的增殖活性上没有差异，其生长曲线基本一致。因此，笔者认为银屑病成纤维细胞在增殖活性并不存在异常，其异常主要在于表达某些细胞因子的差异，银屑病成纤维细胞通过旁分泌释放高水平的细胞因子可能是造成角质形成细胞过度增殖的重要始动因素。

1 Saiag P，Coulomb B，Lebreton C，et al.Psoriatic fibroblasts induce hyperproliferation of normal keratinocytes in a skin equivalent model in vitro.Science，1985，230(4726):669-672.

2 Debets R，Hegmans JP，Buurman WA，et al.Expression of cytokines and their receptors by psoriatic fibroblasts Ⅱ decreased TNF receptor expression.Cytokine，1996，8(1):80-88.

3 KonstantinovaNV，Duong DM，Remenyik E，et al.Interleukin-8 is induced in skin equivalents and is highest in those derived from psoriatic fibroblasts. J Invest Dermatol，1996，107(4):615-621.

4 Finch PW，Murphy F，Cardinale I，et al.Altered expression of keratinocyte growth factor and its receptor in psoriasis.Am J Pathol，1997，151(6):1619-1628.

细胞培养范文第8篇

1 细胞培养的历史沿革

细胞生物学是生命科学的理论基础，也是现代生命科学的前沿科学，而细胞培养是其中的重要部分。细胞培养分为原代培养和传代培养[2]，目前细胞培养技术广泛应用于生物医学各个领域，是分子生物学和实验室生物技术等的核心实验室技术[3]。细胞培养始于20世纪初，1907年，Harrison利用悬滴法将分离自青蛙胚胎的神经细胞种植在青蛙的淋巴液中，首次在体外模拟了细胞的生长活动，为后来开展体外细胞研究开辟了新途径， Harrison也因此被誉为“细胞培养之父”[4]。1910年， Burrows在从Harrison实验室学习了这种技术以后尝试用鸡血浆代替淋巴液培养细胞并获成功。此后，Burrows与其外科医生出身的同事Alexis Carrel进一步致力于哺乳动物组织的培养技术研究。1912年，Alexis Carrel[4]将外科手术严格的无菌技术引入细胞培养并发明了专门的细胞培瓶（Carr-el flask，卡氏培养瓶），显著改良了Harrison所建立的培养技术并将其应用于成年组织细胞和肿瘤细胞的体外培养实践中，由于此研究成果的重大贡献，1912年，Alexis Carrel被授予诺贝尔医学与生理学奖，此后Alexis Carrel在体外成功培养了分离自鸡胚心脏的心肌细胞，并将其一直培养到了1946年，证明了体外细胞不但可以存活而且能传代增殖。1949年，Alan Parks发明了-196℃超低温冻存细胞的技术，成为细胞培养历史上又一次重大的技术进步。此后，抗生素和胰蛋白酶的出现，也极大地促进了细胞培养技术的发展。1952年，GO Gey[4]成功地培养了人类肿瘤组织并建立至今仍使用的HeLa细胞系，使细胞培养发展到人类组织培养阶段。20世纪80年代，以众多细胞系的建立为特点。现在细胞培养基本上渗透到到生命科学的各个领域，随着培养条件的改善，该技术也越来越容易掌握。

2 根据材料和细胞接触方式的细胞毒性评价方法

依据接触方式，目前常用的评价口腔医疗器械细胞毒性试验方法有以下三种[5]：琼脂扩散试验、滤膜扩散实验、直接接触实验。①琼脂扩散试验（间接接触试验）：适用于固体（包括粉末）和液体等试验材料的检测，通过琼脂糖扩散后来评价材料的非特异性细胞毒性；②滤膜扩散实验（间接接触试验）：适用于固体（包括粉末）和液体等试验材料的检测，通过乙酸纤维素滤膜扩散后评价材料的非特异性细胞毒性；③直接接触实验（包括浸提液试验）：该试验适用于评价固体材料和材料浸提液或液体材料的细胞毒性。

在应用直接接触试验时，体外培养的细胞，失去了身体神经体液的调节和细胞间相互作用的影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，而且其生长受营养条件、生长空间等因素的限制，所以，Hensten 等[6]认为，直接接触法所得的结果不能反映材料在口腔内实际的生物相容性，缺乏准确性。在间接接触试验中，琼脂扩散试验和滤膜扩散实验利用可溶性抗原与相应抗体特异性结合，从而来检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。Murray 等[7]研究表明在间接接触试验中，琼脂或者滤膜作为屏障用于模拟口腔黏膜，能较为真实地反映口腔的环境，但琼脂类材料和牙本质的渗透性还是有很大的区别[8]，故而间接接触试验不能有效地反映牙本质情况，目前的标准体外细胞毒性试验存在一些不足之处，主要原因是试验细胞与试验材料之间没有牙本质屏障[9]。近年来，国内陈志军等[10]利用人工羟基磷灰石陶瓷片模拟牙本质，从而确保牙本质通透性的可控性，为口腔材料体外细胞毒性试验提供了一个高效可靠的评价方法。

3 生物学终点评价细胞毒性的评价形式

生物学终点评价形式包括以下五种：

3.1细胞形态学评价：主要是观察细胞的形态变化，该方法是最早用于检测细胞损伤的方法，通过在显微镜下观察细胞形态的改变，可以判断细胞是否有污染、是否健康以及增殖情况。在显微镜下，通过观察裂解细胞所占的比例来评估细胞毒性级别，Sujata等[11]研究得出细胞形态学评价方法与MTT法等定量细胞毒性法的Perason相关系数为0.9，表明两者具有良好的相关性。目前，该方法仍广泛用于生物材料细胞毒性的评价。

3.2细胞膜性效应评价：主要是从细胞膜的通透性改变方面来鉴别存活细胞与死亡细胞，包括以下两种试验方法。

3.2.1中性红摄取试验（NRU）：1986年，Borenfreund等[12]建立中性红摄取试验，并对多种材料细胞毒性进行评价，表明该试验是快速评价细胞毒性的方法。国际标准ISO已收录该检测方法，经济合作与发展组织（OECD）也于2010年将该方法列为细胞毒性试验预测急性经口毒性试验起始剂量的指导性文件[13]。

3.2.2乳酸脱氢酶释放法（LDH 释放法）：乳酸脱氢酶（LDH）是活细胞胞浆内酶之一，正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至细胞外，所以培养基中该酶活性与被裂解的细胞数量成正比，采用全自动生化分析仪直接检测细胞培养板上清液中LDH，可以反映细胞损伤程度。此方法操作简便，灵敏度高，用LDH释放法检测肿瘤患者CIK细胞（细胞因子诱导的杀伤细胞）活力，有助于CIK疗法适应患者的选择及个体疗效观察[14]。

3.3细胞代谢活性评价：该方法是通过检测细胞生物代谢或生物合成功能的改变来了解细胞损伤作用，当前，以活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶作为生物学终点的评价方法可以灵敏地反映材料对细胞的损害程度[15]。主要包括MTT实验和XTT实验。

3.3.1 MTT试验：MTT试验以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthia-hiazo（-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT噻唑蓝为基础，通过MTT噻唑蓝作用于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶，生成非水溶性的蓝紫色结晶甲（Formazan）并沉积在细胞中，且MTT结晶形成的量与细胞数成正比。目前该试验作为材料细胞毒性评价方法，实验步骤规范标准化，结果准确，简便快速[16-17]，但是在试验过程的结晶产物，需要用二甲基亚矾（DMSO）溶解后才能测定光吸收值，若是溶解不充分，会影响测定结果，从而使得MTT灵敏度略差，因此，杨晓冉等[18]建议MTT法和中性红摄取试验（NRU）联合使用。

3.3.2 XTT试验：XTT试验在MTT的基础上，省去溶解还原产物结晶的步骤，1988年，Scudiero等[19]首次采用该方法检测细胞增殖。XTT是一种与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色甲肷产物，当XTT与电子偶合剂共同使用时，甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。该试验方法较MTT 法具有显著优点，已被纳入国际标准ISO10993-5：2009中，但XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用，成本较高。

3.4细胞增殖率评价：主要是观察材料或材料浸提液与细胞接触后细胞生长速度和增殖的变化，主要有克隆形成试验。最早由Tuchiya提出，用克隆形成率（实验组克隆数/对照组克隆数）来评价材料的细胞毒性。Tuchiya等[20]研究表明，克隆形成试验较分子滤过法、琼脂覆盖法、中性红摄取法更为敏感，目前该方法已收录在国际标准ISO 10993-5：2009中。

3.5 DNA合成率检测评价：通过测定有丝分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力，主要有5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）渗入法和胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法。敏感性很高，但重复性略差[21]。

综上所述，评价材料的体细胞毒性的试验方法较多，而由于不同材料接触方式及毒理不一，各试验方法之间又存在很大的敏感差异。因此，Weyermann等[22]提倡在选择试验方法时，必须根据“最接近应用状况”的原则，合理地选择样品与细胞的接触方式和检测生物学终点的评价方法。

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