胚胎干细胞
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了八篇胚胎干细胞范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
胚胎干细胞范文第1篇
【摘要】 目的 观察补肾阴中药复方对胚胎干细胞活动的影响。方法 选用胚胎干细胞模型CRL-1825细胞株，加入补肾阴中药复方大鼠含药血清，观察补肾阴中药对干细胞分化、凋亡、细胞周期及其关键基因表达的影响。结果 补肾阴中药复方含药血清可以抑制干细胞的分化和凋亡，促进干细胞增殖以及细胞周期的进程，促进干细胞Wnt、Oct4等基因的表达，下调P16INK4a基因的表达。结论 补肾阴中药复方可以促进干细胞增殖、维持其不分化状态。
【关键词】 补肾阴；中药；胚胎干细胞
Abstract： Objective To study the effects of tonifying kidney-yin on activities of embryo stem cell. Methods Embryonic stem cell line CRL-1825 was choosed as model cell in present study， and tonifying kidney-yin herb serum was added to CRL-1825 cell. The influence of tonifying kidney-yin on stem cell differentiation， cell cycle， apotosis and express of key genes were observed. Results Tonifying kidney-yin can inhibit stem cell differentiation and apotosis， promote stem cell proliferation and progression of cell cycle. In addition， tonifying kidney-yin can up-regulate Wnt， Oct4 gene expression， and down-regulation P16INK4a expression. Conclusions Tonifying kidney-yin can promote stem cell proliferation and maintain the state of stem cell.
Key words： Tonifying the kidney-yin；Chiese herb；embryo stem cell
肾在中医学中具有极为重要的地位，肾为先天之本，肾主藏精，其精气促进人体的生长、发育和生殖，是人体生命活动的原动力。笔者从中医肾的角度理解胚胎干细胞，观察了补肾阴对胚胎干细胞增殖、分化、凋亡等基本生命活动的影响，以及补肾阴对胚胎干细胞功能关键决定基因Wnt 、Oct4、P16INK4a基因表达的影响。
1 实验材料
1.1 细胞株与试剂
小鼠胚胎干细胞CRL-1825细胞购自ATCC (American Type Culture Collection)；ATRA(all trans-retinoic acid)购自Panomics公司；DMSO购自Sigma公司；α-MEM培养基购自Hyclone公司；DeadEndTM Fluorometric TUNEL System购自Promega公司；CCK8(Cell Counting Kit-8)试剂购自Dojindo公司。其余为国产试剂。
1.2 仪器
培养箱：NUAIKE；流式细胞仪：BD FACSCalibur；倒置显微镜、免疫荧光显微镜：Olympus ；酶标仪：Bio-Rad；PCR仪：MJ Research Inc；凝胶成像系统：复日科技。
2 实验方法
2.1 左归丸处方组成及药物制备
熟地黄24 g，山药12 g，枸杞子12 g，山茱萸12 g，川牛膝9 g，菟丝子12 g，鹿角胶12 g，龟板胶12 g(按《景岳全书·新方八阵·补阵》中的配伍比例确定剂量)。以补肾中药气味并重的要求，上述药物除鹿角胶、龟板胶外，余药加8倍量水，煎煮2次，第1次2 h，第2次1 h，过滤，合并滤液。鹿角胶、龟板胶用适量水加热溶化，加入滤液，混匀，滤液浓缩至相对密度1.20(80 ℃)，4 ℃保存备用。由龙华医院中药制剂室提供。
2.2 含药血清的制备
选健康Wistar大鼠32只，雄性，SPF级，体重180～200 g，来源上海中医药大学实验动物中心。大鼠分为左归丸组(小、中、大剂量组)、生理盐水组，每组8只，分别按人鼠药物换算等效剂量的1、2、4倍喂饲大鼠左归丸，生理盐水组灌服等体积生理盐水，每天2次，连续3 d(灌药前禁食不禁水12 h)。末次给药后1 h腹主动脉采血，5 000 r/min离心分离并收集含药血清，56 ℃常规灭活30 min，0.2 μm滤膜过滤除菌，密封后于-20 ℃冰箱保存备用。
2.3 细胞培养与分化观察
CRL-1825细胞常规培养，1～2 d换培养基1次，2～3 d传代一次，传代时常规倒置显微镜观察并记录培养细胞形态。细胞分化实验中加入10%补肾阴中药复方大鼠含药血清(左归丸大、中、小剂量组)以及等体积空白血清(生理盐水组)，作用3 d后每组加入1% DMSO或1 nmol/L ATRA作用14 h，各组细胞进行光镜拍照。根据分化实验及预实验结果确定实验采用10%补肾阴中药复方大鼠含药血清中剂量组。
2.4 细胞增殖检测
细胞增殖采用CCK8方法进行。常规消化细胞，以2×103的密度接种细胞于96孔板，每组设3个复孔；接种后第2天加入10%含药血清以及等体积空白对照血清，并自接种后第2天开始每天取9孔加入CCK8试剂10 μL，37 ℃反应2 h后，450 nm波长测上清光密度。
2.5 细胞凋亡观测
常规消化细胞，以1×105/盘的密度接种细胞于3.5 cm培养皿，第2天加入10%含药血清以及等体积空白对照血清，作用3 d后加入400 μmol(终浓度)H2O2，作用14 h后取细胞检测凋亡。细胞凋亡采用TUNEL(TdT-meidated dUTP Nick-End Labling)法检测，操作按Promega公司说明书进行。
2.6 细胞周期的观测
常规消化传代细胞，加入10%含药血清以及等体积空白对照血清作用，3 d后细胞消化离心，调整浓度1×106/mL以上，70%酒精(终浓度)固定，PI(碘化吡啶)染色用于流式细胞仪检测细胞周期变化及增殖特性。
2.7 基因表达
采用RT-PCR法检测基因表达，总RNA在逆转录酶的作用下逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件为：94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，PCR产物在1%的agarose胶中电泳。反应中所用引物为，Oct3/4：5’- ATTCAGCCAAACGACCAT-3’，5’-CCCTGAGAAAGGAGACCC-3’；P16INK4a：5’-CCCTTGCCTGGAAAGATA-3’，5’-AACTATTCGGTGCGTTGG-3’；Wnt：5’-TGGCTGGGTTTCTGCTAC-3’，5’-CTCGGTTGACGATCTTGC-3’。
3 结果
3.1 补肾阴对胚胎干细胞分化的影响(见图1)
结果显示，CRL-1825细胞可在DMSO作用下分化，细胞呈现出菱形或梭形，丧失干细胞特有的形态以及克隆生长特性；在补肾阴中药的联合作用下，细胞部分分化，有部分细胞尚维持干细胞的形态，并有部分细胞仍呈克隆生长，提示补肾阴可以阻滞干细胞的分化。
3.2 补肾阴对胚胎干细胞增殖的影响
(见表1、图2)表1 补肾阴对胚胎干细胞周期的影响(略)注：与空白血清组以及空白组比较，*P
3.3 补肾阴对胚胎干细胞凋亡的影响
本研究采用H2O2诱导细胞凋亡，观察补肾阴对细胞凋亡的影响。结果显示，补肾阴可抑制H2O2诱导的细胞凋亡，与对照组比较差异显著。
3.4 补肾阴对胚胎干细胞基因表达的影响
在CRL-1825细胞培养基中加入10%含药血清以及等体积空白对照血清，提取细胞总RNA，RT-PCR检测补肾阴对干细胞基因表达的影响。结果显示，补肾阴可以促进干细胞Wnt、Oct4等基因的表达，下调P16INK4a基因的表达(见图3)。
4 讨论
本研究采用的CRL-1825细胞株来源于小鼠畸胎瘤，具有胚胎干细胞的基本特性。实验结果提示，补肾阴可以促进干细胞增殖，促进胚胎干细胞周期的进程，抑制细胞凋亡，同时可以维持胚胎干细胞不分化的状态，从而在实验体系中验证了胚胎干细胞与中医肾为先天之本、肾主藏精理论的联系。
本实验研究结果还显示，补肾阴可以促进干细胞Wnt、Oct4基因的表达，下调P16INK4a基因的表达。Wnt是Wnt/beta- catenin信号通路的重要蛋白，其在Presenilin酶以及frizzled等配体的作用下进而激活beta-catenin，beta- catenin入核与TCF等转录因子协同作用调控靶基因的转录，在维持干细胞状态方面起着重要的作用[1-2]；Oct4位于6p21.31，含360个氨基酸，同样是一个转录因子，其与ATTTGCAT特异序列结合介导靶基因的转录调控，与细胞核移植后的核再程化(nuclear reprogramming)相关，主要表达于胚胎干细胞，可作为胚胎干细胞的表型标志，并在干细胞增殖以及干细胞状态维持方面起着重要的作用[3-5]。P16INK4a是一个抑癌基因，是细胞周期激酶CDK4的抑制剂，通过调节CDK4以及P53的活性而促进细胞周期的进程，在G1期调控点起着重要的作用[6-8]。结果发现，补肾阴能促进胚胎干细胞增殖，促进细胞周期，以及维持干细胞不分化的状态，因此，有理由认为这与补肾阴上调Wnt、Oct4以及下调P16INK4a基因表达相关。
参考文献
[1] Kleber M， Sommer L. Wnt signaling and the regulation of stem cell function[J].Curr Opin Cell Biol，2004，16：681－687.
[2] Duncan AW， Rattis FM， DiMascio LN， et al. Integration of Notch and Wnt signaling in hematopoietic stem cell maintenance[J].Nat Immunol，2005，6：314－322.
[3] Brivanlou AH， Gage FH， Jaenisch R， et al. Enhanced：setting standards for human embryonic stem cells[J].Science，2003， 300： 913－916.
[4] Boiani M， Eckardt S， Scholer HR， et al. Oct4 distribution and level in mouse clones：consequences for pluripotency[J].Genes Dev， 2002， 16：1209－1219.
[5] Pan GJ， Chang ZY， Scholer HR， et al. Stem cell pluripotency and transcription factor Oct4[J].Cell Res，2002，12：321－329.
[6] Omura-Minamisawa M， Diccianni MB， Chang RC， et al. p16/p14 (ARF) cell cycle regulatory pathways in primary neuroblastoma：p16 expression is associated with advanced stage disease[J].Clin Cancer Res，2001，7：3481－3490.
胚胎干细胞范文第2篇
【关键词】 胚胎干细胞 诱导分化 机制 方法
【Abstract】 Embryonic stem cell is a kind of undifferentiated pluripotent stem cell， which stems from preimplantation ICM or early fetus primordial germ cell. The research about differentiation of embryonic stem cell has been a hotspot in medical field now， but the mechanism of differentiation and the directional differentiation have not known very well. Recently， there are dramatic developments in these fields， this paper elaborated the mechanisms differentiation on induced differentiation of embryonic stem cells， methods on induced differentiation of embryonic stem cells， questions on induced differentiation of embryonic stem cells.
【Key words】 embryonic stem cell; induced differentiation; mechanism; method
自1981年英国的Evans等从小鼠囊胚的内细胞团（Inner cell mass，ICM）分离建立胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES细胞）以来，ES细胞的研究就一直是各国研究的热点。近两年，ES细胞分化诱导以及调控方面的研究取得了很多重要的进展，已从ES细胞诱导出神经细胞、心肌细胞、血管和内皮细胞等。利用ES细胞的定向分化可望在基因研究、细胞治疗和组织器官替代治疗等的研究中发挥重要作用。
1 ES细胞定向分化的调节机制
自1988年发现了白血病抑制因子能抑制ES细胞分化后，人们就开始研究其定向分化，通过将外源基因转入ES细胞研究其表达及微环境对细胞分化的影响，认为ES细胞的分化受内源性因素和外源性因素的共同调节。分化机制如下。
1.1 内源性影响因素 内源性因素即不同基因在不同时间和空间的开启和关闭及各种转录因子等。从分子水平来看，ES细胞分化的本质问题是基因表达调控。
1.1.1 基因的差异表达 在个体发育中，基因按照一定程序，有选择地相继活化的现象称为基因的差异表达。在胚胎发育过程中所以能相继分化出各种新类型细胞，就是由于相关基因相继活化而合成特异蛋白质的结果。Cross等［1］研究证明细胞定型时是通过强化某些基因的表达并抑制另一些基因的表达来形成某个单一谱系所特有的基因表达型。如缺乏干细胞白血病转录因子的ES细胞不能分化为血细胞和内皮细胞共同的前体细胞。
1.1.2 基因的不同表达水平 有些基因如Oct-4基因和Nanog基因等在体内通过不同的表达水平来调控ES细胞的分化。
1.1.2.1 通过Oct-4基因的不同表达水平调控ES细胞分化 Oct-4基因是ES细胞的一个特异标志分子。Oct-4是一种调节性基因，它的职责是控制其他基因的表达。无论是在体内还是体外，Oct-4基因只在全能或多能性细胞如ES细胞和EG细胞中表达。Oct-4基因的敲除使小鼠胚胎不能形成ICM，而完全由滋养外胚层组成，并在植入时死亡。RNA干扰实验显示Oct-4表达下调引起ES细胞分化，形成滋养层或内胚层，说明Oct-4基因在维持胚胎细胞的发育全能性和ES细胞不分化状态的调节中起着重要的作用。Niwa等［2］研究发现，Oct-4不同的表达水平指导ES细胞的3种不同命运，即Oct-4表达上调2倍使ES细胞分化为原始内胚层细胞，Oct-4表达下调使ES细胞分化为滋养层细胞，Oct-4表达水平不变才能使ES细胞维持不分化状态。因此，Oct-4被视为多能细胞发动、维持及分化的主要候选调控因子。
1.1.2.2 Nanog基因维持ES细胞的不分化状态 近年来在确定维持ES细胞不分化状态相关基因方面最大进展也许是Nanog基因的发现［3］。Nanog基因仅在ES细胞异表达，在分化的ES细胞和体细胞中不表达；Nanog基因缺陷的ES细胞失去多能性，开始分化；导入了Nanog基因的ES细胞株在LIF拮抗剂存在时仍能保持30%的不分化ES细胞。Nanog在桑葚胚等全能胚胎中不表达，仅在囊胚期的ICM中表达，之后限制在晚期囊胚的外胚层表达，胚胎植入后Nanog的表达迅速降低。体内实验还表明Nanog基因缺陷的胚胎仅包括一些不能辨认的胚外组织，而没有外胚层或胚外外胚层。这些结果提示Nanog是Oct-4基因启动后维持内细胞团全能性所必需的。Nanog的作用机制目前尚不清楚。Nanog基因只在ES细胞中发挥作用，在其他干细胞中则处于休眠状态，如果能够找出某种方法激活该基因，成体干细胞也许就能再次成为ES细胞。
1.1.3 奢侈基因 某些基因对细胞自身生存并无直接影响，不是必需的，但却决定着细胞向特殊类型分化的物质基础。如编码肌细胞肌球蛋白的基因，编码结缔组织的胶原蛋白的基因等。Michael等［4］利用心肌细胞-肌球蛋白重链的启动子转染ES细胞，结果获得了99%的心肌细胞。
1.1.4 拯救因子和免疫“豁免”特权 研究人员发现ES细胞能够分泌出特殊的“拯救因子”来逆转小鼠的致死性的先天缺陷。尽管很少有干细胞真正长成健康的心脏组织，但研究人员发现干细胞能够分泌出特殊的分子，这些分子能发出信号给临近的心脏细胞从而修复先天缺陷器官的功能。另一个研究成果表明人类ES细胞具有独特的免疫“豁免”特权。实验证实在小鼠活体内移植的未分化人类ES细胞不会引起移植排斥的特定免疫反应，这项研究对人类ES细胞移植治疗具有重要意义。
1.1.5 细胞质在细胞分化中的作用 细胞质对ES细胞的分化方向起决定性作用。调节基因差异表达的物质存在于细胞质中。每个子细胞所继承细胞质的差异决定了各子细胞沿特定的方向分化。
1.2 外源性因素 外源性因素指细胞间的分化诱导、分化抑制作用及细胞外物质的介导作用等。细胞内基因表达的调控作用是ES细胞发生分化的决定因素。但细胞所在的环境条件对ES细胞的分化也有重要影响。
1.2.1 细胞间的分化诱导 细胞间的分化诱导是指一部分细胞对邻近细胞产生影响，并决定邻近细胞分化方向及形态发生的过程。诱导分化的机制还不清楚，可能与信号传导有关。如：hES细胞与鼠骨髓基质细胞系S17细胞或卵黄囊内皮细胞系C166细胞共培养，在添加胎牛血清的条件下，hES细胞可分化为CD34+的造血祖细胞。
1.2.2 细胞间的分化抑制 细胞间的分化抑制是指在胚胎发育中，已分化的组织细胞产生抑素，抑制邻近细胞进行同样分化以避免相同的器官重复发生或过度发育。如：把发育中的蛙胚置于含成体蛙脑碎片的培养液中一起培养，胚胎则不能发育成正常脑。
1.2.3 细胞外物质的介导作用 细胞外物质的介导作用分近距离与远距离两种，起近距离介导作用的主要是细胞外基质与黏附分子，起远距离介导作用的主要是激素与细胞因子等。目前研究最多的是生长因子，生长因子可诱导hES细胞在体外分化，但没有一种生长因子能诱导hES细胞定向分化为一种特定细胞。生长因子仅仅是增加某一种类型细胞的相对数量。Schuldiner等［5］研究了8种生长因子对hES细胞的诱导分化作用，发现：苯丙酸诺龙和转化生长因子β1主要诱导中胚层细胞形成；维甲酸、血管内皮生长因子、骨形态生成蛋白4和碱性成纤维生长因子主要诱导外胚层和中胚层细胞的形成；神经生长因子主要诱导三胚层所有细胞的形成。
2 ES细胞诱导分化的一般方法
ES细胞的诱导分化是目前研究的热点，人们通过不同的途径来实现这个目的。目前主要包括：外源性生长因子诱导ES细胞分化、转基因诱导ES细胞分化、通过将ES细胞与其他细胞共培养的方式诱导ES细胞分化等。
2.1 外源细胞生长因子诱导ES细胞分化 在体外诱导ES细胞分化方面，对细胞因子诱导法研究的最为广泛和深入，获得的研究成果到目前为止也最多。体外培养下，ES细胞对细胞因子具有依赖性。培养过程中添加或撤除某一种或某些细胞因子可指导ES细胞的增殖或分化。目前在发育学方面研究比较深入的诱导因子主要有：维甲酸（retinoic acid，RA）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors，FGFs）等。利用细胞因子诱导ES细胞朝一定方向分化时，一般采用分阶段的办法，即先得到类胚体（embryoid bodies，EBs），再在EBs的基础上进一步诱导使其分化为目的细胞。在各阶段添加的细胞因子不同，具体表现为细胞因子种类、浓度或组合的不同。目前利用此法，国内外学者已得到多种目的细胞，如：造血细胞、心肌细胞、神经细胞等。
2.1.1 RA诱导ES细胞分化 RA系维生素A的衍生物，它可以影响脊椎动物的发育和许多类型细胞的分化。RA不但可以通过经典的信号转导途径诱导ES细胞分化，还可以抑制LIF信号促进ES细胞分化。RA常被用来进行诱导多潜能干细胞向神经细胞分化的研究。Strbing等［6］研究显示，BLC6和D3 ES细胞自发分化产生的神经细胞只占EB的15％～30％，而用RA处理后EB中几乎全部细胞分化成神经细胞。Schuldiner等［7］证实，用高浓度RA（10-6M）诱导人ES细胞产生的神经细胞比未用RA处理的增加22％（76％:54%）。目前RA诱导ES细胞分化产生神经细胞的机制仍未阐明。已有报道指出，FGF信号通路在多种生物的胚胎神经发育过程中起关键作用［8］。Wilson等［9］也证实，FGF信号可以通过抑制BMPs表达，从而促进胚胎发育产生神经细胞。此外，Ying等［10］发现，FGF信号是ES细胞发生神经特异性分化所必需的。这些研究提示我们，RA诱导ES细胞向神经细胞分化的机制可能与FGF信号有关。
2.1.2 BMPs诱导ES细胞分化 BMPs是转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）超家族成员中最大的一族，通过调节多种基因活性，对中胚层形成、左右对称、神经系统发生、体节和骨骼发育、肢体形成及肾、胃肠、肺、牙齿的发育等基本过程产生影响。BMPs家族中，BMP-2和BMP-4在诱导ES细胞分化中发挥着重要作用。Kramer等［11］研究发现BMP-2以时间依赖的方式增加EB向软骨细胞分化，即在EB悬浮培养2～5日时加入BMP-2可以诱导其分化，而在EB悬浮培养0～2日或5～9日时加入BMP-2不产生作用。Li等［12］用猴ES细胞进行体外实验发现，将BMP-4加入ES细胞培养体系中，分化产生的造血前体细胞集落增加了17倍。Chadwick等［13］证明了BMP-4与造血细胞因子结合可以促进人ES细胞向造血系统分化。此外，Xu等［14］的实验显示BMP-4还可以诱导人ES细胞分化成为滋养层细胞。
2.1.3 FGFs诱导ES细胞分化 FGF-2是纤维母细胞生长因子家族成员，通过细胞表面的FGF受体（FGF receptor，FGFR）调节机体的生长和发育。FGFR属于酪氨酸激酶受体家族的一类，至少有5个成员，其中FGFR-1和FGFR-2是FGF-2的高亲和力的受体。FGF-2诱导的信号转导是正常细胞生长分化所必需的，参与血管新生、胚胎发育、骨骼形成等生理过程。Delra P等［15］比较了表达FGFR-1阳性和FGFR-1阴性的ES细胞分化产生心肌细胞的能力，结果显示来自FGFR-1阳性ES细胞的EB，有90%细胞分化为心肌细胞；而来自FGFR-1阴性ES细胞的EB，仅10％左右细胞分化为心肌细胞。由此可见，FGFR-1对于体外诱导ES细胞分化为心肌细胞是必需的，FGF/FGFR信号途径在体外心脏发育中发挥重要作用。此外，有研究表明FGF-2在某些情况下也可以诱导ES细胞向神经系统分化。FGF-3在原肠胚阶段的胚胎中表达，FGF-3信号途径可以促进神经系统的发育，因此利用FGF-3也可以诱导ES细胞向神经细胞特异分化。
转贴于
2.1.4 其他细胞/生长因子或化合物 除以上几种主要的诱导因子之外，其他一些细胞/生长因子或化合物也能诱导ES细胞分化，如造血生长因子（hemopoietic growth factor，HGF）可以增加ES细胞向中胚层分化，最终产生心肌细胞、造血细胞等。用activin-A处理分化5日的EB在最终的分化产物中出现大量肌细胞［16］。Sachinidis等［17］研究显示TGF-β可以调节ES细胞向心肌分化。二甲基亚砜作为细胞保护剂，也可以促进ES细胞向胚胎心脏细胞分化，诱导表达GATA-4和Nkx-2.5［18］。另外有报道指出，多种细胞因子共同作用促进ES细胞特异性分化的效率更高。Li等［19］用含有EGF、IGF-1和bFGF的培养基培养EB 10日，观察到96%的细胞表达神经前体细胞特异性标志，但需要说明的是，在应用这种策略时必须明确几种细胞因子的诱导分化方向是一致的。
2.2 转基因方法诱导ES细胞分化 细胞因子诱导分化的方法虽然操作简便，但其诱导产生的成熟细胞数量较少，而且纯度较低，不利于细胞移植治疗。人们开始尝试利用转基因方法达到诱导ES细胞定向分化，它主要是利用基因转染技术使某个促分化基因在ES细胞中过表达，从而调节ES细胞的分化。转基因方法诱导ES细胞分化已经取得了较好的效果。主要体现在以下两方面。
2.2.1 促分化基因导入诱导ES细胞分化 Vicario和Schimmang［20］报道，与添加FGF-2因子相比较，利用单纯疱疹病毒作为载体将FGF-2基因转入ES细胞中，诱导产生的神经细胞是前者的三倍。Prelle等［21］研究胰岛素生长因子Ⅱ（insulin growth factor，IGF Ⅱ）促进鼠ES细胞肌分化时发现，与未过表达IGF Ⅱ基因的ES细胞对比，过表达IGF Ⅱ是可以加速并增强ES细胞分化的。以上研究表明IGF Ⅱ加速ES细胞向肌细胞分化是与改变了肌发生相关基因的表达水平有关。
2.2.2 特异性转录因子异位表达诱导ES细胞分化 特异性转录因子异位表达就是将细胞系特异表达基因导入ES细胞，并使其表达，产生特异性转录因子。细胞系特定转录因子的异位表达可诱导ES细胞分化为目的细胞系。例如，成肌细胞决定基因（MyoD）同源异型基因B4和11（HoxB 4和Hox 11）的组成型异位表达可诱导小鼠ES细胞分化为肌肉细胞［22］、造血细胞［23］。然而ES细胞内诱导分化基因的组成型表达可能对ES细胞的增殖产生危害或诱导不可预料的分化。因此利用此法诱导ES细胞分化为目的细胞系，必须建立一适宜细胞系特异性转录因子的异位表达载体系统。Vallier等［24］构建了一双顺反子基因诱捕载体，该载体可驱动外源基因在体内及离体的条件下表达，且对导入ES细胞无损伤作用。利用此法可获得高纯度的目的细胞，同样亦存在目的细胞的安全性问题。
2.3 细胞共培养的方法诱导ES细胞分化 ES细胞生长的微环境对ES细胞分化有很大的影响。为了使ES细胞维持不分化状态，人们选择在鼠胚胎成纤维细胞制作的饲养层上培养ES细胞;并在培养基中添加LIF。Kaufman等［25］证明人ES细胞与鼠骨髓细胞系S17或卵黄囊内皮细胞系C166共培养，可以促进人ES细胞向造血前体细胞分化。Mummery等［26］将人的ES细胞与鼠血管内胚层样细胞（END-2）共培养，在12孔板上大约有（35±10）%的孔出现了搏动的区域，而且诱导的心肌细胞具有正常心肌细胞的功能。
以上三种诱导方法并不是孤立的，它们可以有机地结合起来。Kyba等［27］证明在ES细胞中条件表达Stat5可以诱导造血分化，而将表达Stat5的EB置于OP9基质细胞上培养，进一步增强了造血发生。这种相互结合的诱导方法有着广阔的应用前景。
3 ES细胞体外定向诱导分化研究存在的问题
ES细胞的定向诱导分化是ES细胞研究的主要方向，它为今后临床上进行细胞移植治疗提供了充足且良好的细胞来源，并且通过对诱导分化的研究可以揭开人类自身发育的神秘面纱;但是迄今为止，仍然未找到可以诱导生成大量较为单一细胞的方法。细胞因子诱导方法虽然被广泛采用，但由于ES细胞自身也可以分泌一些生长因子，影响诱导效果，而且细胞因子方法诱导产生的特定细胞数量较少，纯度亦不高，诱导特异性分化后还需要进行细胞筛选。转基因诱导方法研究应用时间较短，在ES细胞中过表达某一诱导分化的基因可以大大提高诱导分化的效率，得到纯度较高的分化细胞，然而目的基因的稳定转染却是摆在研究人员面前的一大障碍，而且转染基因容易发生突变从而影响了整个ES细胞基因组的稳定性。此外，诱导效率不高，寻找适合的共同培养条件较为困难，使得细胞共培养方法目前尚未得到广泛应用。还有特定分化细胞的扩增、ES细胞向有功能器官的分化、分化细胞应用于移植治疗的免疫排斥和安全性等问题仍未解决。但我们相信，随着新的发育相关基因的不断被发现，诱导ES细胞分化方法的不断成熟，稳定高效转染ES细胞方法的建立，ES细胞在组织工程等领域必将会有更广阔的应用前景。
总的来说，ES细胞的定向诱导分化研究是一项探索性很强，具有重大意义的研究课题。我们相信，随着这些关键性问题的解决，ES细胞定向分化的机理一定能够阐明。
参考文献
1 Cross MA， Enver T. The lineage commitment of haemopoietic progenitor cells. Curr Opin Genet Dev， 1997， 7: 609.
2 Niwa H， Miyazaki J， Smith AG. Quantitative expression of Oct23/ 4 defines differentiation， dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat Genet， 2000， 24: 372-376.
3 Nichols J， Zevnik B， Anastassiadis K，et al.Formation of pluripotent stem cells in t he mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct-4. Cell， 1998， 95: 379-391.
4 Michael G， Klun， Mark II， et al. Genatically selected cardiomyocytes from differentiatinn embryonic stem cells from stable intracardiac grafts. Clin Invest， 1996， 98: 216.
5 Schuldiner M， Yanuka O， Itskovitz-Eldor J， et al. Effects of eight growth factors on the differentiation of cells derived from Human embryonic stem cells. Proe. Nail. Acad. Sci. USA， 2000，97(21): 11307.
6 Strbing C， Ahnert-Hilger G， Shan J， et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise tomature inhibitoryan dexcitatory neurons. Mech. Dev， 1995， 53: 275-287.
7 Schuldiner M， Eiges P， Eden A， et al. Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Brain Res， 2001， 913: 201-205.
8 Streit A， Berliner AJ， Papanayotou C， et al. Initiation of neural induction by FGF signal ling before gastrulation. Nature， 2000， 406(6791): 74-78.
9 Wilson SI， Graziano E， Harland P， et al. An early requirement for FGF signal ling in the acquisition of neural cell fate in the chick embryo. Curr Biol， 2000， 10: 421-429.
10 Ying QI， Stavridis M， Griffiths D， et al. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat. Biotech， 2003， 21: 183-186.
11 Kramer J， Hegert C，Guan KM， et al. Embryonic stem cell derived chondrogenic differentiation in vitro activation by BMP-2 and BMP-4. Mech. Dev， 2000， 92(2): 193-205.
12 Li F， Lu SJ， Vida L， et al. Bone morphogenetic protein induces efficient hematopoietic differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in vitro. Blood， 2001， 98(2): 335-342.
13 Chadwick K， Wang LS， Li L， et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood， 2003， 102(3): 906-915.
14 Xu RH， Chen X， Li DS， et al. BMP-4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nat Biotech， 2002， 20(12): 1261-1264.
15 Delra P， Ronca P， Coco I， et al. Fibroblast growth factor receptor-lisessential for in vitro cardiomyocyte development. Circ. Res 2003， 93: 414-420.
16 Schuldine M， Yanuka O， Its kovitz-Eldor J， et al. Effects of eight growth factors on the differentiation of cells derived from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2000， 97(21): 11307-11312.
17 Sachinidis A， Kolossov E， Fleischmann BK， et al. Generation of cardiomyocytes from embryonic stem cells. Herz， 2002， 27: 589-597.
18 Ventura C， Maioli M. Opioid peptide gene expression primes cardiogenesis in embryonal pluripotient stem cells. Circ. Res， 2000， 87(3): 189-194.
19 Li HW， Roblin G， Liu H， et al. Generation of hair cells by step wise differentiation of embryonic stem cells. Proc. Nat. I Acad. Sci. USA， 2003， 100: 13495-13500.
20 Vicario I， Schimmang T. Transfer of FGF-2 via HSV-1-based amplicon vectors promotes efficient formation of neurons from embryonic stem cells. Neurosci Methods， 2003， 123: 55-60.
21 Prelle K， Wobus AM， Krebs O， et al. Over expression of insul in-like growth factor-Ⅱ in mouse embryonics stem cells promotesnyogenic differentiation. Biochem. Biophys Res. Commun， 2000， 277(3): 631-638.
22 Dinsmore J， Ratliff J， Deacon T， et al. Embryonic stem cells differentiated in vitro as a novel source of cells for transplantation. Cell Transplant， 1996， 5: 131-143.
23 Keller G， Wall C， Fong AZ， et al. Overexpression of Hox 11 leads to the immortalization of embryonic precursors with both primitive and definitive hematopoietic potential. Blood， 1998， 92(3): 877-887.
24 Vallier L， Mancip J， Markossian S， et al. An efficient system for conditional gene expression in embryonic stem cells and in their in vitro and in vivo differentiated derivatives. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2001， 98(5): 2467-2472.
25 Kaufman DS， Hanson ET， Lewis RI， et al. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Nat. Acad Sci. USA， 2001， 98: 10716-10721.
胚胎干细胞范文第3篇
【关键词】 消化液； 添加物； 牛胚胎干细胞； 克隆效率
胚胎干细胞（ES细胞）是具有全能性的哺乳动物早期胚胎细胞或原始细胞。胚胎干细胞在分化抑制的培养条件下，可以未分化状态无限增殖。近年来有关牛类ES细胞分离与克隆的研究已经取得较大进展[1-2]。笔者为探讨添加物和消化液对牛胚胎干细胞克隆效率的影响，通过从牛鲜胚内细胞团（ICM）中分离获得牛类ES细胞后进行克隆，在培养细胞中添加胰岛素生长因子和消化液，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 牛胚采集 在自然期，对健康经产黑白花奶牛母进行人工受精后68 d经非手术方法从牛子宫取胚胎。将待采集胚胎的母牛固定在床位上，在尾椎硬膜外腔注射 2% 盐酸利多卡因麻醉。按规定方法在冲洗两侧子宫角。冲出的胚胎要在立体显微镜下检查。在100倍实体解剖显微镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞的密度、与透明带的间隙以及变性情况等[3-4]。
1.2 溶液配制 细胞基础培养液：DMEM+0.1 mM 2-mercap-toethanol（在此基础上，添加不同浓度的血清及各种细胞因子）；细胞基础消化液：胰蛋白酶+EDTA（在此基础上，两者浓度有所调整）。
1.2.1 饲养层制备 选取新生健康黑白花牛犊制备成纤维细胞，取3代内对数生长期MEF， 终浓度10μg/ml 丝裂霉素C处理 3.5 h， D-PBS充分洗涤，消化细胞调整细胞浓度为1×105个/ml，种植在经 0.1%明胶包被的4孔培养板中，置37 ℃、5% CO2培养箱培养待用，用前更换成胚胎干细胞培养基。
1.2.2 胚胎处理和胚胎培养条件 基础培养液为DMEM培养基+15%NBS+0.1mmol/L 0.1 μmol/L Na2SeO3+β琉基乙醇。室温下培养牛胚胎及ES细胞。
1.2.3 ICM初次传代 将ICM细胞体外培养6～7 d后，当细胞繁殖到一定数目时，选择未分化的细胞进行传代。操作如下：用玻璃针剥离覆盖在ICM表面的滋养层细胞后挑出ICM，用PBS洗涤液清洗后，置入0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液中处理后，将细胞转入15%的血清培养液中，制备细胞团悬混液。培养条件同上。
1.2.4 牛ES细胞继代克隆 ICM细胞培养35 d后，饲养层表面可出现类似ES细胞的集落。弃去培养液，用PBS液洗涤集落，再用玻璃针剥脱隆起明显、排列紧密的ES细胞集落，再用毛细吸管将集落移入培养液中。
1.3 研究方法 在DMEM培养基中加入10 ng/ml的IGF（设为IGF组）观察牛ES细胞的克隆结果与未加IGF（设为对照组）时做比较，在离散ICM和ES集落时，分别用0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液（A组）和0.04%EDTA消化液+0.25%胰蛋白酶消化液（B组），作用时间控制为2 min，温度37 ℃。
1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行统计处理，计数资料采用 字2检验，以P
2 结果
不同条件对牛ES细胞克隆的影响情况，具体结果见表1。
3 讨论
胚胎干细胞具有全能性，能再体外条件下分化为各器官系统细胞，亦可在分化抑制的情况下进行未分化状态克隆，胚胎干细胞克隆技术广泛运用于转基因动物、嵌合体的制作和克隆动物的生产，目前有关牛胚胎克隆的研究取得了重大进展[4-5]。为探讨不同条件对牛ES细胞克隆的影响，笔者探讨了在不同浓度消化液及在胰岛素生长因子作用下，牛ES细胞克隆的变化。牛ES细胞在以上配置的培养液中培养形成ES细胞集落胚数/枚ES 2枚，细胞最大传代数2代。在培养液中加入10 ng/ml的IGF牛ES细胞集落胚数为3枚，细胞最大传代数4代，可见IGF对牛ES细胞克隆有促进作用。在ICM细胞与ES细胞分离时用0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液处理2 min，形成ES细胞集落胚数/枚ES 9枚细胞最大传代数4代。用0.04%EDTA消化液+0.25%胰蛋白酶消化液分离牛ES细胞集落胚数为8枚，细胞最大传代数4代。因此，在分离ICM细胞和ES细胞时注意，选择适当浓度的消化液，且作用时间不宜过长[6-8]。通过本实验可得出在进行牛ES细胞培养时，可利用一定的添加物促进ES细胞克隆，促进其繁殖，而对于分离ICM和ES细胞的消化液，须严控其浓度和作用时间。
参考文献
[1] 姜景岩，孔北华，刘星霞，等.人胚骨髓基质细胞饲养层对人胚胎生殖细胞生长的作用[J].生殖与避孕，2005，25（3）：131-135.
[2] Munoz M，Rodnguez A，Frutos C，et a1.Conventional pluripotency markers are unspecific for bovine embryonic-derived cell-lines[J].Theriojournal，2008，9（6）：1159-l164.
[3] 张守宝，柏学进，朱金香.不同饲养层对牛胚胎干细胞培养的影响[J].畜牧与兽医，2010，42（5）：45-46.
[4] 林芸秀，魏玉珍，柯丹如，等.新生小鼠原始卵泡成熟诱导[J].生殖与避孕，2008，28（3）：140-143.
[5] Mary F，Lyrme S.The potential for derivation of embryonic stem cells in Vertebrates[J].Molecular reproduction and development，2006，73（1）：123-131.
[6] 窦忠英，徐小明，华进联.牛胚胎干细胞建系研究进展及存在问题[J].农业生物技术学报，2003，11（5）：439-443.
[7] 李松，苗增民，宋文刚.牛胚胎干细胞分离克隆的研究[J].泰山医学院学报，2006，27（7）：607-608.
胚胎干细胞范文第4篇
让你变成“蜥蜴人”
干细胞是人类最原始的细胞，早在受精卵只有几天大小时，它们便已经存在，能分化成为所有种类的人体细胞。这种“特异功能”能够让受损的身体组织再生，让“罢工”的器官系统重启，甚至让残疾人像蜥蜴一样长出断肢。
医疗中的万能材料
通过改变干细胞的成长环境或者注入特定基因，科学家能在实验室中让它分化成为所需的特化细胞，如心脏肌肉细胞、血液细胞或者神经细胞，再将这些特化细胞移植到患者身上。例如，干细胞分化出的健康心脏细胞将被移植到心脏病患者的心脏肌肉中，并担负起修复受损心脏细胞的责任。相比器官移植，干细胞移植引起的排异反应要小得多，而且患者也无需长时间等待适合的器官。
“羊毛”出在“羊”身上
虽然干细胞可以在实验室中分化出各种各样的身体细胞，但是最初的干细胞从哪里来呢？胚胎、脐带血、成人身体中都存在干细胞。
胚胎干细胞
来源：胚胎干细胞是从一星期左右大的人类受精卵中分离出来的。在胚胎中，干细胞能分化成为各种细胞，最终形成一个完整的人体。
特点：胚胎干细胞在实验室中是“永生”的，而且能够制造包括从骨细胞到脑细胞的所有人体细胞。
弊端：分离时会损害受精卵。目前，大多数的胚胎干细胞来源于不孕不育治疗中剩余的人类胚胎，也有女性专门为干细胞研究捐献卵子。
链接：除了分化出所需的特化细胞，胚胎干细胞还可以让研究者深入了解受精卵发展成人的过程。有基因缺陷的胚胎干细胞有助于科学家研究先天疾病是如何形成的。胚胎干细胞还可用于新药物测试，让研究者直接看到人类机体而非动物对药物的反应。
脐带血干细胞
来源：脐带血是在婴儿娩出后立即从胎盘和脐带中收集的血液。
特点：获取脐带血干细胞不会对婴儿和母亲造成任何伤害，其多功能性介于胚胎干细胞和成人干细胞之间。
弊端：私人保存脐带血所需不菲，而且孩子将来用到脐带血的几率微乎其微。即使孩子未来真的需要自身脐带血干细胞，已被保存多年的干细胞可能已经不适用于医疗了。
链接：早在20世纪80年代，脐带血干细胞就被用于兄弟姐妹之间的干细胞移植。现在，世界各地都有公共脐带血干细胞库，但并不用于私人医疗，在那里保存脐带血相当于给科学研究捐献脐带血干细胞。
成人干细胞
来源：成年人的骨髓、血液、角膜、肠道、肝脏、肌肉、脂肪、神经系统、大脑、胰腺和皮肤当中也保留了一些干细胞。
特点：提取时不会破坏胚胎，而且不存在保存问题。
弊端：这些干细胞只能够分化出其所在部位的组织细胞。另外，环境中的毒素以及DNA复制时的错误可能使成人干细胞出现问题。
链接：成年人骨髓中的造血干细胞能够源源不断地补充各种血液细胞，让白血病患者受损的造血系统重新启动。骨髓中的另一种干细胞，间叶干细胞可分化成肌肉、脂肪、皮肤、软骨等细胞。刺激已有的成人干细胞，使其达到并且修复人体中受损的组织，是科学家们正在努力的方向。
链接：今年“两会”期间，辽宁省糖尿病治疗中心院长、政协委员冯世良认为我国的干细胞产业“鱼龙混杂”，并建议规范干细胞临床及应用监管模式。在我国干细胞产业的乱局中，科技部门“鼓励干”，卫生部门紧闭双眼“不让干”，药监部门眼盯美国“看着干”，学者专家崇尚信仰“大胆干”，医疗机构追名逐利“偷着干”，美容机构胡说八道“忽悠干”，而数万患者为了不被当做小白鼠“花钱干”，实在有必要了解干细胞这一最前沿的科学技术到底是什么。
干细胞新动向
什么让干细胞如此给力
德国Max Delbrück分子医学中心发现，干细胞的特殊能力来源于一种钙黏附蛋白。根据这一发现，研究者希望通过DNA重组，让普通的体细胞转化成为拥有钙黏附蛋白的多功能细胞，即诱导性多能干细胞。而该研究在小鼠实验中已经取得了初步成果。一旦技术成熟，人类的体细胞也可以在干细胞医疗中被用于治疗心脏病、阿兹海默症、帕金森和糖尿病。
胎儿的干细胞治疗母亲的
心脏病
美国纽约市西奈山医学院的研究人员先诱发了怀孕小鼠的心脏病，然后在两周后杀死它们。解剖结果发现，母小鼠受损的心脏组织中存在一些小鼠胎儿的干细胞，并且曾帮助修复受损组织。研究者解释，这可能是一种进化机制――胎儿为了提高自身的生存率而保护母亲的心脏。也许在未来，我们可以从胎盘中提取干细胞用于修复母亲受损的心脏，这些干细胞易于提取而且不易引起排异反应。
宝贵的母乳胚胎干细胞
西澳大利亚大学最近从母乳当中成功分离出了胚胎干细胞。胚胎干细胞可以分化成为任何人体细胞，具有极大的医疗价值。但是获取胚胎干细胞会损害能够发育成胎儿的受精卵，因而一直备受争议。从母乳中获取胚胎干细胞则避免了这一点。
寻找自我复制的开关
不分化的干细胞会不停地自我复制，这种复制与癌细胞的快速生长相似。美国明尼苏达州大学最近发现了一种可以决定干细胞是分化还是自我复制的蛋白质（Klf4），以及控制该蛋白质的两种酶。一旦科学家掌握了干细胞自我复制的开关，便可以在移植干细胞时，根据需要决定干细胞是分化还是自我复制。另外，该发现可能启发研究者找出抑制癌细胞生长的方法。
延长女性的生育能力
卵子是由卵母细胞发育而成的。以往我们认为，一位女性在出生时，她的卵母细胞数量便固定了（约200万个），并在一生中逐渐减少，能发育为成熟卵子排出的约400~500个。而美国麻省总医院的研究人员却发现，在卵母细胞总数减少的同时，也有新的卵母细胞生成。这让他们联想到了卵巢中可能存在干细胞，并最终通过一种卵细胞中独有的蛋白质，在卵巢组织中找出了卵巢干细胞。也许将来，中老年女性和卵巢早衰的女性能够通过刺激卵巢干细胞来重新排卵，生育能力得到延长和修复。
干细胞研究大事件
1968年――非亲属之间的骨髓移植中首次成功运用了干细胞技术
1998年――实验室中培育的人类胚胎干细胞可形成人类的任何身体组织
2001年――美国前总统乔治・W・布什颁布了多项关于联邦经费用于人类胚胎干细胞研究的禁令
2005年――成人干细胞用于治疗心脏病的最大规模临床研究失败
2006年――普通皮肤细胞被转化成为诱导性多能干细胞，据称，其功能与人类胚胎干细胞一样
2008年――诱导性多功能干细胞分化出能分泌胰岛素的胰岛细胞
2008年――首次在气管移植手术中成功运用了患者自身的干细胞
2009年――美国总统奥巴马解除了前总统布什关于干细胞研究的禁令
2010年――治疗脊椎受伤患者时首次使用了人类胚胎干细胞
胚胎干细胞范文第5篇
在我们的血管中，鲜红的血液在流淌，在维持着生命的运转。血红细胞在大大小小的血管中运动着，把氧气输送到身体的每个部分，然后把废物带走。血红细胞的工作非常重要，但是它们却是短命的，平均寿命只有4个月左右。因为这些扁平的细胞要经常从微小的血管中改变体型，然后艰难地挤过去，这个过程让血红细胞损伤很大。
如何及时补充损失的血红细胞呢？在人体内，细胞靠分裂来补充死去的老细胞。但血红细胞却不是靠分裂来补充，它需要细胞世界里的“全能战士”——干细胞出马来完成这项任务。
造血干细胞本领有限
首先需要介绍一下干细胞：普通细胞在分裂的时候，新细胞不论是外观还是行为都和它们的母细胞完全一致。比如说，新皮肤细胞的功能与其他皮肤细胞完全相同。小肠或肝脏的细胞也是如此。但是干细胞却可以变成各种不同类型的细胞。一个干细胞有可能转变成在脑、皮肤、肌肉和其他器官中的某种细胞，当然也包括血红细胞，干细胞转化的细胞能够替换受损的普通细胞。
目前，生物学家把干细胞分为两种，即造血干细胞和胚胎干细胞。
顾名思义，造血干细胞是能够制造血细胞的干细胞，它们就生活在我们的骨头里面，全名叫“骨髓造血干细胞”。在骨头里，它们持续地分裂，一些新产生的细胞会保持干细胞的状态，而另外的一些有的形成了血红细胞，有的则转化成了可以对抗细菌感染的白细胞。虽然造血干细胞能够变成各种类型的血细胞，但是它们却不能变成肌肉、神经或其他类型的细胞。它们的使命已经非常固定化了，无法转变成身体其他组织的细胞。
难以获取的胚胎干细胞
而胚胎干细胞就不同了，它能够转变成人体中的任何类型的细胞，所以科学家称其为“多能干细胞”。
卵子受精后，先是一分为二，然后2个细胞再次分裂，成为4个细胞，然后持续分裂。在胚胎发育的最初几天，它的每一个细胞都是功能相同的，都属于干细胞，每个干细胞都有潜力转变成任何特定的细胞类型。
当人类的胚胎长到三到五天的时候，干细胞开始了不同方向的分化，有些转化成肌肉细胞或成骨细胞，还有的会形成肺细胞，或胃内壁的细胞。一旦胚胎干细胞变成了特定的细胞，它们的“多能”性就不存在了，不能再变成其他种类的细胞了。
出生后，婴儿几乎所有的细胞都将特化。每种细胞类型都有自己特定的形状和功能。比如说，肌肉细胞很长，能够伸长或收缩；血红细胞很小，而且是扁平的形状，所以它们能够从血管之中穿梭而过。
胚胎干细胞本领很大，但是也很难获取，只能从胚胎中获取，因此，收集胚胎干细胞遭到了许多社会人士的反对，因为这种行为会破坏胚胎，等于是“谋杀”了一个尚未出世的生命，社会伦理不允许这么做。
难道干细胞这些“全能战士”真的无法为医学所用、给人类造福吗？
“变身术”造就
“全能战士”
2006年，日本科学家山中伸弥发现，一些人体的普通细胞能够发生“反转”，变回干细胞。他把一些特殊的基因插入到成熟的皮肤细胞的内部，成功地获得了干细胞。这类干细胞从功能上看很像胚胎干细胞，能够转化成各种普通细胞。人们把这种新的干细胞叫“诱导多能干细胞”，简称诱导干细胞。
诱导干细胞的出现，是细胞研究的一次巨大的飞跃，它有胚胎干细胞和成体干细胞无法比拟的优点。首先，诱导多能干细胞能够转化成任何类型的细胞，就像胚胎干细胞那样。其次，它们能够从任何细胞类型通过诱导而产生，所以科学家可以很容易得到这种干细胞，又不需要冒伦理风险。第三，未来医生们能够利用患者自己的身体细胞来获得干细胞，治疗疾病，这样的干细胞会与患者身体完全匹配，不会出现免疫系统排异的现象，免疫系统会把这种干细胞当成“自己人”。
而且诱导干细胞技术并不复杂，世界各地的科学家很快就学会了这个技术，他们开始制造自己的诱导干细胞，然后尝试着治疗各种疾病。
让盲人重见光明
伊克巴尔·艾哈迈德是美国奥马哈的一所大学的科学家，他正在利用干细胞，研究如何让盲人恢复视力。
我们知道，视网膜位于眼球后部，能够把入射到眼睛里的光转化成电信号，然后传送到大脑。如果眼睛的视网膜神经细胞死亡，会导致严重的眼病，甚至让人失明。
艾哈迈德希望利用诱导多能干细胞制造出新的视网膜细胞，更换患者死掉的视网膜细胞。他从角膜中提取了一些普通细胞，然后把它们放到培养皿的一侧，而另一侧则放入一些胚胎干细胞。两类细胞之间用特殊的薄膜隔开，不能混合在一起。不过，两类细胞却可以“交流”，因为细胞总是会释放一些化学信号给其他细胞，当胚胎干细胞“发言”的时候，角膜细胞就“倾听”到了。结果。胚胎干细胞的化学信号让角膜细胞转化成了干细胞，这种干细胞能够转化成其他类型的细胞，包括神经细胞。
当艾哈迈德把从干细胞转化来的神经细胞植入实验室内的老鼠的眼睛中时，这些神经细胞附着在视网膜上，替代了由于眼疾而死亡的那些神经细胞。虽然这只是让老鼠的视力得到了一定程度的改善，但是相信有朝一日，一些盲人的视网膜也能因干细胞技术而得到恢复。
治疗骨髓疾病
皮尔逊综合征是一种罕见的遗传性疾病，症状之一是骨髓里的干细胞不能制造正常的血红细胞。这种病很容易置人死地。
美国哈佛大学的科学家安妮·雪莉尝试着用干细胞技术治疗疾病。有一位患病的女孩，她自身无法制造血红细胞，所以只能定期输血维持生命，但输血本身存在一定的风险，尤其对于有这种古怪疾病的人来说。于是雪莉从女孩身上提取了皮肤细胞，然后通过把基因插入到皮肤细胞中的技术，得到了诱导干细胞，并让这些细胞在37℃的培养皿中存活着。
随后，雪莉把得到的诱导干细胞注入到女孩的骨髓里，让女孩能够靠自身的力量造血，而不再需要输血。目前治疗取得了一定的效果。女孩的免疫系统把造血干细胞认定为“自己人”，不会杀死它们。也许很快女孩就可以自己造血，不需要输血了。
科学家正在率领着干细胞“全能战士”向各种疑难病症发动进攻，一场医学界的真正革命已经到来了。
超级链接
鼻细胞的大用途
干细胞的本领确实很大，但在某些情况下，一些高度特化的细胞同样具有非凡的治疗能力。
2008年，英国剑桥大学的神经学家尼克·杰弗里从人的鼻子里取得细胞，但却不是用于产生干细胞，而是用这些鼻细胞修复受损的脊髓连接部分。脊髓是一束神经细胞，能够与大脑和身体其他部分交换信号。脊髓受伤会导致瘫痪，或者失去感觉、肌肉移动无力。
干细胞移植主要是用于替换损坏或丢失的细胞类型。而在脊髓损伤中，神经细胞其实并没有消失，它们只是被切断了联系。神经细胞包含了长长的、线状的轴突，它是把信号传递给下一个细胞的通道。当脊髓受伤时，这些轴突可能会被切断。切断轴突就像是剪断电缆一样，都是让信号停止传递。
如何恢复神经信号的传递呢？杰弗里用脊髓受伤的狗来做实验。他从鼻腔中取下一些普通细胞。这种鼻细胞能够在鼻子里刺激神经细胞长出新的轴突，从而帮助狗保持健康、敏锐的嗅觉。
胚胎干细胞范文第6篇
关键词：支原体；干细胞；PCR检测
【中图分类号】
R249 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）07-0029-01
近些年，干细胞对治疗如糖尿病、神经退行性疾病及骨关节疾病等疾病均有良好的应用评价，并且很多研究人员和普通人希望干细胞能在更多的疾病治疗领域发挥更为广阔的应用价值。人胚胎干细胞（hESCs， human embryonic stem cells）因其具有无限增殖能力和多向分化潜能而被作为研究干细胞的常用细胞类型[1，2]。细胞出现支原体污染是实验室中比较常见的现象，感染率一般为5-30%[3]。有研究人员的研究结果显示，支原体污染概率与细胞传代次数呈现正相关性。本研究对干细胞感染支原体的情况进行PCR检测，并使用支原体检测试剂盒进行对比检测。
1 材料与方法
1.1 所需试剂：
PCR 预混料（购买自上海生工）；DL2000 DNAMarker（购买自北京天根生物）；琼脂糖为BD公司；支原体检测试剂盒（美国Lonza公司）；琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物（购买自美国Promega公司）；其他试剂均为分析纯。
1.2 主要仪器：
PCR扩增仪（购买自美国Biometra公司）；超低温冰箱、恒温CO2培养箱、高速低温离心机（购买自德国Thermo公司）；电子分析天平（购买自上海分析仪器厂）；超纯水仪（购买自美国Millipore公司）；DYY-6C型琼脂糖凝胶电泳仪（购买自北京六一仪器厂）；凝胶成像分析系统（购买自美国Bio-RAD公司）；超净工作台（购买自苏州净化设备公司）。
1.3 引物设计：
根据GenBank 收录的支原体 Ala-PG8株、Ora-CH19299 株、Mho- BTS7株、Arg-G230 株、Fer-PG18株的序列，使用Primer5.0软件设计引物，设计出的引物是可以扩增出以上5株支原体序列的通用引物。引物序列如下：
上游引物5’-CCAGCAGCCGCGGTATACATA- 3’
下游引物5’-GTGGACTACTAGGGTATCTAAT- 3’
1.4 干细胞的培养
1.4.1 Feeder的培养：
将本实验室培养后冻存的人成纤维细胞进行复苏，然后在培养皿中放置在CO2培养箱中培养，培养12h后在培养液中加入浓度为10ug/ml的丝裂霉素C，共同培养2.5h。然后使用胰酶消化人成纤维细胞加入到6孔板中，这样就形成了Feeder。
1.4.2 干细胞的培养：
将本实验室培养后冻存的人胚胎干细胞进行复苏，共分7次复苏，每次2份细胞，并且在培养24、48、72、144小时之后取细胞样品进行PCR检测，共计复苏56次不同冻存批次和代数的人胚胎干细胞。将Feeder中的培养基换为人胚胎干细胞培养基，复苏之后将细胞加入到Feeder之上，放置在4个不同的CO2培养箱中的不同位置进行培养。
1.4.3 PCR检测：
在培养24、48、72、144小时之后取细胞样品进行PCR检测，首先使用移液器将培养人胚胎干细胞的6孔板中的培养基吸除，使用PBS溶液清洗一次，使用胰酶将人胚胎干细胞消化下来，使用移液器将收集的人胚胎干细胞以2500rpm离心10min，然后使用500ul 的PBS溶液重悬细胞。放置在100水浴锅中煮沸10min，以细胞悬液10ul为模板，进行PCR扩增，扩增体系和条件见表1和表2。
PCR扩增之后，对扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳之后在凝胶成像仪下观察并保存结果。扩增出条带大小符合支原体DNA的为支原体污染样品，如果没有符合的条带，则视为没有支原体污染。
1.4.4 支原体试剂盒检测： 取出1管Lonza支原体检测瓶，在无菌超净台内将培养好的干细胞培养液加入到支原体检测瓶中，盖好检测瓶的盖子，放入37℃水浴锅中1h，观察检测结果。
1.5 数据统计： 将所有获得的结果使用SPSS19.0软件进行统计，两组之间比较采用卡方检验，当p
2 结果
2.1 支原体检测结果： 使用两种方法对干细胞中支原体污染的情况进行检测，每组均检测56例，PCR检测阳性例数为21例，试剂盒检测阳性例数为12例，而阳性率分别为37.5%和21.4%。两组间阳性例数和阳性率比较结果差异显著（p
2.2 不同培养时间支原体检测结果： 对复苏后培养24、48、72和144小时的干细胞进行支原体检测，结果显示，复苏的干细胞连续培养144小时之后，无论是PCR检测还是试剂盒检测，支原体的阳性例数和阳性率均高于72小时、48小时和24小时。而且在培养144小时之后，PCR检测和试剂盒检测干细胞支原体污染的阳性例数和阳性率情况比较结果差异显著（p
3 讨论
一般在细胞培养的过程中，支原体污染的情况不容易被发现，因为支原体不像细菌污染一样可以在显微镜下或肉眼进行观察。但是支原体污染后会对细胞的生长，以及细胞内的基因表达及蛋白合成等反面均造成一定影响，这样就会对科研研究结果造成一定影响[4]。以前常用的方法是采用琼脂培养检测支原体，通过观察支原体的生长特征来判断细胞在培养过程中是否出现支原体污染的情况[5]。但是这种经典的方法所需的时间较长。对细胞培养过程中支原体污染检测的方法还有使用电镜检测、荧光染色、双酶分析法等，但这些方法的灵敏性较低，并且操作比较复杂，检测需要较高的费用。而PCR检测支原体方法是近几年得到应用的新检测方法，PCR检测操作简单，所需时间较短，并且具有很高的灵敏性。
本研究中，使用PCR检测干细胞中支原体污染情况比实验试剂盒检测的灵敏度高。并且检测结果显示，培养的时间越长，支原体污染的几率越大。所以在干细胞培养过程中，应该对长期培养的干细胞进行相应的处理，以防支原体污染。PCR方法可以很好的检测干细胞中支原体的存在情况。
对出现支原体污染的细胞的处理方法方法并不是很多，并不像临床上治疗支原体的方法丰富多样[6，7]。所以在细胞培养过程中应该时刻注意支原体污染的情况。如果胚胎干细胞出现支原体污染的情况，使用抗支原体的药物对胚胎干细胞处理之后，对支原体的生长短时间内具有很好的控制作用，但是并不能将胚胎干细胞中支原体完全清除。并且出现支原体污染的胚胎干细胞会对细胞培养室内其他细胞株造成交叉感染，如果没有更好的处理办法，建议将出现支原体污染的胚胎干细胞进行妥善处理或者直接丢弃。
参考文献
[1] Lin HT， Otsu M， Nakauchi H. Stem cell therapy： an exercise in patience and prudence [J]. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci， 2013， 368（1609）：1-6.
[2] Mengarelli I， Barberi T. Derivation of multiple cranial tissues and isolation of lens epithelium-like cells from human embryonic stem cells [J]. Stem Cells Transl Med， 2013， 2（2）：94-106.
[3] Uphoff CC， Denkmann SA， Drexler HG. Treatment of mycoplasma contamination in cell cultures with Plasmocin [J]. J Biomed Biotechnol， 2012， 2012：1-8.
[4] Markoullis K， Bulian D， Holzlwimmer G， et al. Mycoplasma contamination of murine embryonic stem cells affects cell parameters， germline transmission and chimeric progeny [J]. Transgenic Res， 2009， 18（1）： 71- 87.
[5] 孙雪荣，王卫鸿，陈嘉等. Plasmocin对人胚胎干细胞支原体污染的杀灭效果[J]. 中国热带医学，2013，13（7）：783- 785.
胚胎干细胞范文第7篇
【关键词】 microRNA；干细胞；自我更新；分化；诱导多能干细胞
MicroRNAs(miRNAs)是一些长度为21-25个核苷酸，在转录后水平调控基因表达的非编码的小RNAs。miRNAs最早的两个成员是在研究C.elegans的发育调控时发现的。自此，在几乎所有的后生动物如涡虫，果蝇，植物，哺乳动物的基因组中都发现了miRNAs[1]。它们主要作用于miRNA，使其发发生特异性地降解或者阻止其翻译，从而调控动植物的发育和生理过程。
干细胞是一类能够自我更新并具有多向分化潜能的早期未分化细胞， 不仅是器官发生过程中早期分子活动的研究工具， 且已成为多种退行性疾病组织修复和再生的种子细胞。由于干细胞具有广泛的应用前景， 相关的发育分化模型的建立、干细胞发育分化的基因调控及微环境的影响， 已成为近年来医学和生物学领域研究的热点。miRNAs作为一个广泛存在的可对基因表达进行调控的分子， 在动植物的发育和生理活动中起着非常重要的作用，包括抵御病毒，在发育中调控基因的表达，控制发育的阶段，维持干细胞的稳定等等。miRNAs在干细胞中的特异性地表达，尤其在胚胎干细胞和造血干细胞中相关miRNAs的发现、功能的研究， 揭示了miRNAs 可能在干细胞的自我更新和多项分化中发挥重要作用。
1miRNA和干细胞的研究
miRNA是一类～22 nt具有调控功能的非编码RNA ，它们主要参与基因转录后水平的调控。这些miRNA 基因首先在细胞核内转录成前体转录本(primary transcripts miRNA， primiRNA) ，在Drosha酶的作用下剪切形成～60-70nt的miRNA前体（或者称为premiRNA），然后RAN–GTP和exportin 5将premiRNA转运到细胞质，随后，另一个核酸酶Dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的miRNA:miRNA*双链。这种双链很快被引导进入RNA诱导沉默复合体(RISC)中，其中一条单链miRNA被降解，另一条成熟的单链miRNA分子，通过与靶基因的3′ UTR区互补配对，对靶基因miRNA进行切割或者翻译抑制[2]。miRNA具有如下特点[3-5]：①细胞特异性：不同组织不同细胞，miRNA的表达谱及序列特征不同，这可以作为某些组织或细胞的特异性分子标志； ②“时空”特异性：细胞在不同发育阶段，miRNA 组成不同，在特定细胞的特定阶段“出现”特定的miRNA ，决定细胞的分化方向和分化时相，是细胞定时、定向分化的开关； ③保守性：不同种属、不同组织器官以及不同细胞之间相同或相似的miRNA分子具有相似的调控功能；④miRNA作用靶点：多为呈“时空”特异性表达的转录调控基因以及凋亡调控基因，通过调控细胞增殖和细胞凋亡，从而调控细胞功能和结构的特化。
干细胞具有多向分化潜能，它如何从一个充满各种可能性的通用细胞类型演变成从事特定工作的“专业”细胞，是干细胞研究的谜题。 近年来，miRNA 在干细胞定向分化和自我更新功能维持中的作用，逐渐被科学家们发现，目前已经掀起miRNA在干细胞研究中的热潮。
目前发现胚胎干细胞和多种成体干细胞中均存在各自特异的miRNA。Houbavity等[6]在小鼠胚胎干细胞中克隆了15个miRNA ，Suh等[7]则在人胚胎干细胞中找到了36个miRNA基因，这些miRNAs多数在胚胎发育过程中逐渐减少，少数持续表达甚或表达升高。随着细胞的分化，miRNAs的表达也发生了明显的改变。miRNAs和miRNAs的相互作用对于维持干细胞的多能性及其分化非常重要。因此许多试验希望可以通过分析人胚胎干细胞中的miRNAs的表达来描述人的胚胎干细胞。
2 miRNA对干细胞生物学行为的调控
2.1 miRNA调控了干细胞的自我更新
自我更新是干细胞的一个重要特征，从这个层面来说，干细胞与肿瘤细胞一样都可以持续分裂。 因此，如何调节恰当的细胞分裂，使其不会因为太少导致组织发生缺陷，又不至于过分增殖恶化为肿瘤，是干细胞生物学研究的一个攸关问题。
在多能胚胎干细胞中，有特殊miRNA的簇集表达，这些miRNA明显区别于分化之后的胚胎和成体[7]，暗示这些miRNA对于干细胞的自我更新具有一定作用。决定细胞继续增殖还是停止分裂或分化，在G1期由周期依赖性蛋白激酶抑制子p21所调控[8] 。
有研究者通过使用果蝇胚胎作为模型系统，证明了miRNA1有助于早期胚胎阶段的心脏祖细胞（即干细胞）的决定。miRNA1有助于维护末期胚胎阶段中的心脏前体，可以调节心脏细胞的分化机制。这都说明miRNAs调控了干细胞的自我更新。
另外，Dicer酶对于胚胎的发育和干细胞的维持是必不可少的。Dicer敲除的突变体在发育早期胚胎是致死的，在Dicernull的胚胎中，根本检测不到ES细胞系[9]；Dicer缺陷的“escaper”和Dicerflox/null 细胞相比，细胞周期发生了改变，G1期和G0期的细胞有了轻微的增加，相应地，G2期和M期的细胞减少。这种现象可能是由于本应该在ES细胞中表达的抑制细胞周期抑制子的miRNAs的缺失导致的。基因组的组成和结构也受到了影响从而激发了细胞周期检验点的反应，阻止了细胞的进一步增值[10]。
miRNAs对于果蝇的GSCs的分化的控制是必不可少的。果蝇基因组中有两种Dicer异构酶：Dicer1和Dicer2[9]。Dicer1对于干细胞的加工是必需的，而Dicer2是形成siRNA所必需的。Dicer1(Dcr1)的缺失完全破坏了miRNA途径，但对siRNA途径的影响是非常微弱的。分析GSCs的Dcr1突变体发现，生殖细胞孢囊的产量明显下降。GSCs的Dcr1的突变体看起来是正常的，但是在细胞周期控制方面存在明显的缺陷。根据细胞周期标记物和一些遗传的相互作用的研究发现，GSCs的Dcr突变体推迟了G1到S期的转换。干细胞对外界的信号非常敏感，比如营养依赖的胰岛素受体活化可以使干细胞停滞在G1/S 期。胚胎干细胞是通过miRNA通路来调节p21/p27/Dacapo 对CDK的抑制作用从而使自身停滞在G1/S期。当外界环境不利于干细胞分裂时，关键的miRNA被下调，p21/p27/Dacapo的水平上升，从而导致干细胞停滞在G1/S 期[11]。但是，参与此过程的具体miRNA是哪些，至今仍未有报道，更深入的机制仍需研究。对于成体哺乳动物干细胞是否有类似的miRNAp21调节机制以及是否依赖于环境因素，也还需要更多的实验证实。
2.2 miRNA参与神经干细胞的分化调控过程
神经系统是一个高度分化的器官，在已经鉴定的miRNAs中，约有70％可以在哺乳动物的脑中检测到，说明了这些miRNAs在神经发生中可能的作用[12]。对哺乳动物脑发育过程中高度表达的miRNAs的研究表明，在发育起始的miRNAs和特异性分化后表达的miRNAs有显著的不同[13]。前体细胞顺序表达一系列miRNAs，在分化过程中发生了特异性的表达。例如小鼠胚胎干细胞中的miRNA124a 和miRNA9特异性地决定神经干细胞的发育形成， 并且初步推测可能是通过作用于STAT信号转导通路发挥作用[14]，miRNA23，miRNA26和miRNA29的上调表达导致分化形成神经胶质，而miRNA9和miRNA125在神经元和神经胶质细胞中均有表达。let7家族成员也高度存在于神经系统中。在斑马鱼的神经组织和老鼠的发育过程中[41]，let7家族成员都是高度表达的。在神经分化过程中，通过转录激活和增强前体物的加工活性可以显著诱导let7家族成员的成熟，这表明了let7在神经特异分化中的作用[15]。
预测还发现，在成年的哺乳动物中，含量最为丰富的是miRNA124，有1100多个基因的结合位点。将miRNA124导入Hela细胞中，可以下调100多种基因的表达[16]，并且促进了神经样miRNA的表达。最近，在鸡的神经管中发现层粘连蛋白gammal和整合素betal1也是miRNA124的作用位点。而且，miRNA124可以和小的C端结构域磷酸酶1（SCP1）的3’UTR结合，这种磷酸酶在神经发育过程中起着重要作用。识别神经系统中miRNA的靶序列对于我们更好地了解神经干细胞的自我更新和分化是非常重要的。
2.3 miRNA调控造血干细胞的发育
造血干细胞定向分化潜能受miRNA调控，在各系祖细胞中高表达miRNA可能起着定向分化调控作用。Chen等[17]在小鼠的骨髓造血细胞中克隆了100个特异的miRNA ，并已确定一些miRNA在造血组织中优先表达， 如miRNA142在B淋巴细胞和髓系粒细胞中表达增高，miRNA181在B淋巴细胞中选择性表达上调，其中，miRNA181在骨髓祖细胞阴性谱系中高水平表达并只在B淋巴细胞中上调，在体内和体外miRNA181的过表达可提高B细胞的数量，表明miRNA181可能是B细胞分化中的一个正调节因子，参与造血干细胞向B细胞谱系的分化。
Felli 等[18]发现，在脐血CD34 +造血祖细胞向红系发育过程中，miRNA221和222表达逐渐下降。这2个miRNA作用于kit基因的3′UTR，在CD34 +细胞中转染miRNA221和222的寡核苷酸或者慢病毒表达载体，可导致红系增殖和分化障碍，伴随kit蛋白水平下降。NODSCID小鼠体内实验表明，转染后CD34+细胞的增殖能力和干细胞功能受损；反之，阻断miRNA221和222表达，则促进早期红系增殖。实验表明，miRNA221和222的表达下降可促进红系发育。
最近发现，miRNA还调控了造血干细胞自我更新[19] 。造血干细胞能够制造对分化成血细胞至关重要的蛋白质，但是这些蛋白被1套miRNA阻断，将造血干细胞维持在原始状态。利用非增殖病毒载体将miRNA转染入造血干细胞，检测造血干细胞的自我更新能力。第1个进行检测的是miRNA155，已经被证实能够终止干细胞发育成红血球和白血球，没有转染的干细胞可以发育成熟，而转染了miRNA155的干细胞则很少能发育成熟为红血球和白细胞。
3 miRNA决定了干细胞的命运
3.1 miRNA操纵胚胎干细胞的命运
研究表明两种依赖于血清应答因子（serum response factor，SRF）的肌特异miRNA1和miRNA133，能促进胚胎干细胞的中胚层形成，同时在心肌祖细胞的进一步分化过程中有着不同的作用：miRNA1能促进小鼠和人类胚胎干细胞向心脏细胞的分化过程，而miRNA133则阻止肌浆蛋白祖细胞的分化，miRNA1和miRNA133在发育的肌细胞中是同时表达的。miRNA1和miRNA133是一种强有力的非肌性基因表达的抑制因子，并且能抑制小鼠以及人类胚胎干细胞分化过程中的细胞命运。两种miRNA都增加了胚胎干细胞的中胚层特异性，并且抑制它们向内胚层及神经外胚层的分化。
其中，miRNA1的作用部分通过Notch ligand Deltalike 1（Dll1）的翻译阻遏实现，miRNA1的表达导致Dll1的翻译阻遏，并利用shRNA降低干细胞中Dll1的表达。此外，miRNA1和miRNA133能强有力的抑制内胚层以及神经外胚层的基因表达，这表明两者之间或许有着很多共同作用目标。对于胚胎干细胞的基因表达分析表明，miRNA1和miRNA133调节多个相同通路。可见肌特异性miRNA能增强非肌性基因的抑制，并且miRNA能用于多能胚胎干细胞的细胞命运调节[21]。
3.2 miRNA提高了iPS的转化效率
自iPS出现以来，转化效率一直是横跨在iPS技术面前的障碍。有研究表明，将头发里的角质细胞进行重组诱导iPS细胞，发现转化效率可提高100倍。最近发现将两种因子p53 siRNA和UTF1和四个诱导基因（OCT4，SOX2，KLF4和cMYC)一起转染到人成纤维细胞中，iPS的诱导效率也可提高100倍，而且，剔除cMYC（具有致癌性基因）同样可以成功诱导iPS[22]。
4 展望
不同的干细胞类型表达的miRNAs不同，在干细胞的不同发育阶段也存在着特异性的miRNAs的表达，我们有理由相信，miRNAs在调控干细胞的分化和自我更新方面具有非常重要的作用。miRNA作为一种新的调控基因表达的小分子RNA，对干细胞的研究提供了一种新的途径。
随着干细胞复杂的分化调控的研究，我们将更好地了解miRNAs和一些转录因子的相互作用，从而弄清整个细胞内的调控网络。目前关于miRNAs对于干细胞生物学行为调控的研究还很少，miRNAs在干细胞中究竟是如何起作用的？它的作用靶位有哪些？关于其调控分化的模型在哺乳动物也成立么？这些问题都有待进一步地探讨。基于多分化潜能和功能谱系不同的干细胞是由遗传和表观遗传共同决定的，作为组织工程的“种子细胞”，弄清它内部的miRNAs的作用通路，有助于揭示干细胞发育过程的基因调控。我们的终极目标是希望将miRNAs调控干细胞的分化作为一种潜在的治疗手段，以便更好地了解一些特异性的细胞通路中的miRNAs，治疗癌症等疾病。
参考文献
1 Lin He and Gregory J Hannon.MicroRNAs:small RNAs with a big role in gene regulation[J].Nature，2004(5)：522531.
2 David P.Bartel.MicroRNAs:Genomics，Biogenesis，Mechanism，and Function[J].Cell，2004，116(36)：281297.
3 Lagos Quintana M，Rauhut R，Meyer J，et al .New microRNAs from mouse and human[J].RNA，2003，9(2):175179.
4 Rhoades MW，Reinhart BJ，Lim LP，et al.Prediction of plant microRNA targets[J].Cell，2002，110(4):513520.
5 Lewis BP，Shih I H，JonesRhoades MW，et al.Prediction of mammalian microRNA targets[J].Cell，2003，115(7):787798.
6 Houbavity HB，Murray MF，Sharp P A.Embryonic stem cell specific MicroRNAs[J].Dev Cell，2003，5(2):351353.
7 Suh MR，Lee Y，Kim JY，et al.Human embryonic stem cells express a unique set of microRNAs[J].Dev Biol，2004，270(2):488498.
8 Cheng T. Cell cycle inhibitors in normal and tumor stem cells[J].Oncogene，2004，23(43):72567266.
9 Lee，Y.S.Distinct roles for Drosophila Dicer1 and Dicer2 in the siRNA/ miRNA silencing pathways[J].Cell.2004，117(1):6981.
10 Murchison EP，Partridge JF，Tam OH，et al.Characterization of Dicerdeficient murine embryonic stem cells[J].Proc Natl Acad Sci USA.2005，102(34):1213512140.
11 Shcherbata HR，Hatfield S，Ward EJ，et al.The MicroRNA pathway plays a regulatory role in stem cell pision[J].Cell Cycle，2006，5(2):172175.
12 Miska EA，AlvarezSaavedra E，Townsend M， et al.Microarray analysis of microRNA expression in the developing mammalian brain[J].Genome Biol 2004;5(9):R68.
13 Smirnova L，Grafe A，Seiler A， et al.Regulation of miRNAexpression during neural cell specification[J].Eur J Neurosci 2005;21(6):14691477.
14 Krichevsky AM，Sonntag KC，Isacson O，et al.Specific microRNAs modulate embryonic stem cellderived neurogenesis[J].Stem Cells，2006，24(4):857864.
15 Wulczyn FG，Smirnova L，Rybak A，et al.Posttranscriptional regulation of the let7 microRNA during neural cell specification[J].FASEB J.2007;21(2):415426.
16 Lim LP， Lau NC， GarrettEngele P， et al.Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs[J]. Nature 2005;433(7027):769773.
17 Chen CZ， Li L， Lodish HF， et al.MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation[J].Science，2004，303(5654):8386.
18 Felli N， Fontana L，Pelosi E，et al.MicroRNAs221 and 222 inhibit normal erythropoiesis and erythroleukemic cell growth via kit receptor downmodulation[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(50):1808118086.
19 Georgantas RW，Hildreth R，Morisot S，et al.CD34+ hematopoietic stemprogenitor cell microRNA expression and function: a circuit diagram of differentiation control[J].Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(8):27502755.
20 Fengyan Yu，Herui Yao， Pengcheng Zhu，et al.Let7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells[J].Cell，2007，131(6):11091123.
胚胎干细胞范文第8篇
研究论文主执笔人、奥地利科学院尤尔根-科诺布里奇表示，利用干细胞培育的迷你大脑并不是功能正常的大脑，就像是一辆发动机放在车顶或者车轮放在引擎罩上的汽车，无法驾驶。不过，这仍旧是一项重大科研成就。
科学家将他们培育的人造器官称之为“大脑类器官”。这些只有豌豆大小的器官构成了人类大脑组织。通过对大脑类器官进行研究，科学家能够解答与大脑发育以及最初发育阶段出现的紊乱有关的一系列重大疑问。研究发现刊登在《自然》杂志上。
研究论文主执笔人、奥地利科学家、分析生物科技研究所研究员玛德丽娜-兰卡斯特在27日举行的新闻会上指出，这些类器官的构成与一个9周或者10周大的胚胎的大脑类似。研究中，兰卡斯特和同事共培育了数百个类器官。在发育初期，人类大脑的一些主要区域以及类似中脑和后脑等区域已经拥有可辨认的特征，包括背侧皮层、腹侧前脑以及产生脑脊髓液的脉络丛。兰卡斯特和同事指出他们在所培育的迷你大脑的同样区域也发现了这些特征。
不过，这些区域无法像一个正常大脑一样被自然而然地“植入”干细胞模型。兰卡斯特说：“在正在发育的胚胎中，你会看到这些不同区域并非以同样的方式组织。”类器官缺少9周大人类胚胎大脑的一些确定特征，例如与运动有关的小脑。此外，在这种类似大脑的结构中，科学家也极少发现对记忆至关重要的海马状突起。
研究人员利用人类胚胎干细胞和诱导性多功能干细胞进行这种研究。这两种干细胞都有能力发育成身体的任何部位。不过，使用胚胎干细胞进行研究引发巨大争议，原因在获取干细胞的方式。从4天或5天大的胚胎上提取干细胞后，胚胎便被毁掉。使用诱导性多功能干细胞则没有这种争议，因为科学家通常利用皮肤细胞进行培育，采用一种“化学浴”将其转化成类似一个发育中胚胎的状态。
科诺布里奇指出利用胚胎干细胞和诱导性多功能干细胞培育的类器官并没有明显差异。研究人员发现他们培育的类器官具有可变性，一些他们希望研究的大脑区域并未在类器官中出现。兰卡斯特通过使用生长因子（刺激细胞增殖的物质）的方式引导一些类器官内的区域发育。在尝试让迷你大脑生长出更多背侧皮层时，她吃惊地发现人为干预下生长出的背侧皮层数量不及自然发育。兰卡斯特说：“我们认为不同区域之间的‘交流’――类器官不同大脑区域之间的通讯――对每一个个体区域的发育都至关重要。”
研究人员利用类器官这个模型对神经发育疾病小头畸形进行研究。他们最感兴趣的大脑区域是背侧皮层，这一区域最容易受这种疾病影响。研究人员利用一名患有遗传性小头畸形的患者身上提取的细胞培育一些类器官，而后将其与利用健康参与者的细胞培育的迷你大脑进行比较。在利用小头畸形患者细胞培育的类器官中，转化成神经细胞的干细胞――这一过程被称之为“分化”――数量超过利用健康参与者细胞培育的迷你大脑。波恩大学生命与大脑研究中心的奥利弗-布鲁斯特指出这说明小头畸形患者的神经细胞过早分化，可能就是这种疾病背后的机制。
奥地利科学家进行的此项研究建立在其他研究基础之上，其他研究尝试对干细胞培育的大脑组织进行建模。2008年进行的一项研究指出，老鼠胚胎干细胞可以转化成“神经细胞波”。2012年进行的一项研究发现，能够利用老鼠和人类的胚胎干细胞培育原始眼结构和成层视网膜。研究论文作者指出他们并没有培育完整尺寸人类大脑的计划。科诺布里奇表示：“很明显，我们的系统并不适于培育完整大脑。此外，这也不是我们的研究目标。利用干细胞培育具有意识的大脑结构可能不具有可能性，同时也不是我们想要的。”