胚胎工程
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胚胎工程范文第1篇
[关键词]】组织工程；皮肤；无斑痕愈合；胚胎；成纤维细胞
[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）04-0605-04
Investigation on feasibility of constructing engineered skin substitutes with human embryonic fibroblasts
LIU Liu1,LI Wu-de1,CAI Guo-bin2
（1.Cleft lip and Palate Treatment Center,China Meitan General Hospital,Beijing 100028,China;2.Scar Integrated Treatment Centre,Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College,Beijing 100041,China）
Abstract:ObjectiveTo assess the biological and functional properties oftissue-engineered three-dimensional (3D) composites seeded with human embryonic fibroblasts （HEF）.MethodsFibroblast cultures were developed from biopsies of human fetus and children. To determine the differences between fetal andfibroblasts, the cell shape, ultrastructure, growth cycle were observed. In addition, mixed lymphocyte culture was examined to evaluate the antigenicity. Three-dimensional skin constructs were obtained by seeding cultured cells in rat tail collagen scaffold. The content of IL-6 and TGF-β1 in the dermis culturing supernatant was measured by ELISA method.ResultsIn monolayer culture, HEF displayed more typical pattern and faster growing rate. HEF was poor stimulators of lymphocyte proliferation. In 3D culture, fetal constructs appeared more developed based on gross examination with significantly higher level secretion of IL-6 and lower of TGF-β than adults'(P
Key words: tissue engineering; skin; scarless wound healing; fetal fibroblast
寻找理想的种子细胞一直是组织工程皮肤领域的热点和难点，由于种子细胞增殖能力有限、抗原性、与基质相容性差等问题，存在着皮肤产量低，移植后排斥反应等缺陷。前2/3妊娠期的胚胎在受到创伤后具有无瘢痕愈合的能力，而这种愈合能力完全是由胎儿自身组织细胞的内在特性决定的[1]。我们取材于人胎儿皮肤、儿童正常皮肤进行成纤维细胞培养，比较其生长特性、形态学、生长动力学以及免疫原性差异，并复合鼠尾胶原构建人工真皮，观察种子细胞在三维构建中的增殖和功能,以探讨人胚胎成纤维细胞（human embryonic fibroblasts，HEF）作为组织工程皮肤种子细胞的可行性和优越性,为组织工程种子细胞的选择及将细胞移植用于临床提供实验依据。
1材料和方法
1.1主要仪器和试剂：MCO-15A型C02培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，台式高速离心机，恒温水浴箱，常规医用手术器械，日本H-600透射电镜；全自动蒸汽消毒器，针式滤器；培养基（DMEM:F12为1:1，含10%胎牛血清），中性蛋白酶。
1.2 二维培养以及相关实验
1.2.1 成纤维细胞取材：①实验组：5例，取人孕中期（20～28周）引产胎儿，性别不限；②对照组：12例，取自12岁以下瘢痕患者手术改形时修剪下的正常皮肤。
1.2.2 成纤维细胞的培养和传代：采用组织块法培养：将标本消毒后无菌条件下取中厚皮，切成1～1.5mm3的小块，将组织块贴到培养瓶内，加入培养基孵育，待成纤维细胞达60%～70%左右，传代培养。取两组第三代细胞进行光镜、透射电镜观察，绘制细胞生长曲线。
1.2.3 淋巴细胞体外增殖实验，参考文献[2]中毕建军等的方法，计量数据用均数士标准差(x±s)表示。P
1.3 三维培养以及相关实验
1.3.1 制作三维构建：取第三代HEFs和普通FBs，制成1×106个/cm3细胞悬液。迅速与鼠尾胶原液、重组缓冲液（2.756g碳酸钠、4.766gHEPES、0.35gNaOH溶于100ml蒸馏水中）以1200:4200:300的比例加入6孔培养板中，在孵箱内孵育30min后即形成胶原凝胶。加入DMEM:F12为1:1的含10%胎牛血清的培养基在孵箱内继续培养。
1.3.2 测定构建培养液中TGF-β1和IL-6含量：分别在1天、3天、5天、7天、9天、11天、14天每天收集两组各6个孔培养液，每次换液两组加液量均为5ml，用人IL-6、TGF-β1 ELISA试剂盒检测细胞因子含量。
2结果
2.1 二维培养阶段
2.1.1光镜下观察：同等培养条件和时间，HEF贴壁覆盖面积大于普通FB，HEF呈梭形、多边形或不规则形，边缘不整齐，极性排列不规则。细胞折光性强。普通细胞更容易呈束状排列（图1.1,图1.2）。
2.1.2 透射电镜下观察：HEF（第三代）功能活跃，表现为细胞体积大，胞浆丰富，胞核及核仁增大，胞膜与核膜折皱加深，胞浆内微丝粗大，沿细胞长轴平行排列，未见细胞连接（图2.1，图2.2）。细胞质内含有丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体。
2.1.3 同代(P3)HEF和普通FB细胞生长曲线：在细胞生长前3天，两组细胞增殖速度相似，其后均进入对数生长期，HEF增殖速度超过普通FB，更早进入平台期，而后HEF仍保持着较高的生长密度（图3）。
2.1.4 淋巴细胞增殖实验：普通FB：与对照组相比原代～V代均有明显差异。组间比较：P0、P1与其它各代差异明显(P0.05)，P2与P4,P5仍有明显差异(P0.05)。
HEF：与对照组相比原代有明显差异（P
2.2 三维培养阶段：两组培养液中TGF-β1和IL-6含量的比较：各组成纤维细胞培养后的第一天，即可检测到一定水平的TGF-β1和IL-6。两组细胞IL-6随着培养时间的延长分泌量增多，到第9天到达稳定高值水平，至第11天于第7天含量比较无统计学意义（P>0.05）；胎儿组IL-6含量在各时间点都高于成人组（P
3讨论
3.1 HEF是构建组织工程皮肤的理想种子细胞，长期以来动物来源的胚胎成纤维细胞被广泛深入研究，发现其在胶原沉积、细胞分泌，细胞信号传导等方面存在一定的自主性[3]，在分子水平，胚胎皮肤创伤后其WNT信号通路途径，细胞对WNT3a基因调控的应答都与普通FBs有本质区别[4]。2005年，Hohlfeld[5]等利用HEF与马胶原覆盖深度烧伤，发现烧伤创面愈合速度与质量都有明显改善,大大推进了HEF组织工程皮肤的发展。但针对扩增后HEF的基础实验研究并不多见，本研究为填补这一薄弱环节，对HEF的二维、三维培养进行较全面观察，再次验证了胎儿无瘢痕愈合与细胞本身特性密切相关，也为组织工程皮肤种子细胞选择和皮肤构建方法奠定了基础。
3.2 二维培养中，与普通成体FB相比，HEF呈现出更加良好的细胞状态，呈典型的纺锤状，贴壁面积更大，生长更旺盛,细胞寿命更长。透射电镜下HEF胞膜与核膜折皱加深，胞浆内微丝粗大，细胞质内含有丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，说明细胞的功能活跃。HEF约3天传代一次，可传25代而保持细胞基本形态。HEF细胞生长曲线近似“S”形，具有生长速度快，分裂指数高，代谢迅速和分泌功能旺盛的特点。以相同的初始接种密度培养，两组细胞均具有密度依赖性抑制，但HEF比后者具有更大的最大生长密度，这可能是由于胎儿细胞体积小，容积相同时，数量较多，也可能是由于单位细胞消耗营养物质较少所致。
3.3 HEF与淋巴细胞混合培养几乎可以不刺激其增殖，说明其低抗原性。HEF原代培养与对照组和其他代间均存在着显著差异（P
3.4 以往对种子细胞的研究很多是由二维培养结果对三维构建特性进行推断，这并不科学，因为细胞贴附的化学物理性质，细胞周围培养基血清含量，接种密度等条件都不同。本实验用鼠尾胶原作为支架构建三维培养，发现HEF比普通FB增殖更好，细胞功能更好，对支架的吸附性更好，体现了它良好的适应能力，验证了以往文献[6]。随着培养时间的延长，两组构建都表现出程度不同的收缩，并与细胞增殖具有时相性关系，即在细胞刚刚种植时，凝胶并未出现明显的收缩，在细胞增殖最旺盛时，凝胶收缩最剧烈。胶原的收缩是由成纤维细胞伸出突起对胶原纤维施加牵拉张力，使胶原纤维重新排列所致[7]。本实验中HEF增殖快，分泌旺盛，其三维构建表现出了更强的机械力学特性，收缩更加剧烈。
3.5 对三维构建培养液中细胞因子动态观察，其目的在于观察细胞的分泌特性，并间接了解种子细胞在鼠尾胶原中的存活和功能。IL-6是表皮细胞的一种丝裂原，可加速创面表皮化[8]。本实验发现与普通FBs相比，HEF的IL-6分泌更加旺盛，两组三维培养的IL-6含量上升趋势与各组FBs数量增殖趋势基本平行。TGF－β1参与创面愈合的全过程[9]，对细胞分化、免疫功能、细胞增殖、炎症过程具有双相调节作用，可促进胶原合成与成熟[10-11]，能够刺激血管生成和上皮化，刺激FBs的增殖、分化，促进肉芽组织形成，导致瘢痕的产生[12]。本实验发现HEFs的TGF-β1分泌量在各时相均少于普通成纤维细胞，且随时间增加的幅度并不大，说明HEFs的TGF-β1一直处于低分泌水平，并不随细胞数增加呈几何倍数增长。
我们的研究表明HEF具有旺盛的繁殖能力和低免疫原性，在鼠尾胶原凝胶中保持着活跃的生物学特性，是理想的组织工程种子细胞。但创面愈合是一个复杂的过程，涉及到各种细胞间的相互作用、细胞与基质间的作用以及多种炎症因子和细胞因子的作用，如何利用动物实验进一步探索HEF组织工程皮肤的有效性和安全性以及其治疗流程和机制，并建立HEF细胞库，将其广泛应用于临床，是一个有深远意义的研究课题。
[参考文献]
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[3]冯永强.胚胎成纤维细胞的生物学特点[J].中国美容医学,2008,17(7):1095-1097.
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胚胎工程范文第2篇
通过胚胎工程实现，优良品种的快速大量繁殖、改良当地落后品种、节省大量引进的资金等。人工合成牛胚胎的方法：获取目的基因主要方法从基因文库中直接获取目的基因和人工合成目的基因（利用PCR技术扩增）。在构建基因表达载体时，目的基因和质粒要有互补的黏性末端，才能连接，所以要用同一种限制酶去切割。将目的基因导入牛的受精卵，受体细胞是动物细胞，要用显微注射法。，导入的受体细胞是细菌，要用CaCl2溶液处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞。
为了使受体母牛超数排卵应注射适量的促性腺激素。把细胞培养至桑椹胚或囊胚期，进行胚胎移植，这是胚胎工程的最后一道工序。经过基因工程和胚胎移植等技术目的是要获得能分泌含人胰岛素牛奶的母牛，这是符合要求的个体。
（来源：文章屋网 ）
胚胎工程范文第3篇
【关键词】小鼠；胚胎；体外培养
0.前言
在迈入新世纪以后，我国的科学技术发展十分迅猛，尤其是我国的生物科技得到了广泛的推广与使用，从而加快了人类社会的发展。胚胎工程是指主要针对胚胎哺乳类动物的胚胎所进行的工程技术操作，之后再将胚胎继续发育，从而使人们获得所需的成体动物的一种全新技术。当前，胚胎工程在蓄牧种繁殖预遗传资源保护、利用方面得到了广泛推广和使用，并且在人类疾病真毒、药物研发等研究方面蕴含巨大应用价值，因此，受到人们高度的关注。
1.材料预方法
1.1实验所需的材料
实验所需的动物：清洁过的雌性预雄性小鼠，所选用的雌性小鼠年龄约在28—35日的日龄范围内，共约250只，而选用的雄性小鼠日龄在56天以上，共有32只。选用的实际预药品主要有，丙酮酸钠、青霉素钠、链霉素、探索氢钠、氯化镁、牛磺酸等。而所选用的仪器主要有倒置显微镜与实体显微镜，离心机、PH仪、显微图像管理系统等。小鼠胚胎培养液主要有三种，即HTF、CZB、KSOM溶液。在配制每一种溶液时都要进行过滤，以便除菌，并且还要放在4摄氏度的环境下进行保存。
1.2小鼠超数排卵
从中选用体重超过25g雌性小鼠，要在小鼠腹腔中注射PMSG20IU，待48小时之后再在腹腔中注射Hcg10IU。雄性小鼠要选用体重超过30g的，严格按照雌性鼠预雄性鼠比例为2：1的比例放在同一个笼中混合养殖，在第二天早晨要检查小鼠的阴道栓，将具有阴道栓的雌性小鼠在20—23小时范围内提取卵母细胞预卵丘细胞的复合体。
1.3采集小鼠的原核胚
在注射hCG后的22小时后，采用颈椎脱臼方法将小鼠处死，在用酒精消毒之后，剪开腹腔，在沿着小鼠卵巢端剪取输卵管，将输卵管放在生理盐水的35mm培养器皿中，然后将培养器皿放进实验室，将小鼠的输卵管放入到洗卵液培养器皿中浸泡一段时间。与此同时，要求实验人员在体视显微镜下准确找到输卵管膨大位置，再使用专门的注射器将其划破，然后轻轻挤压小鼠输卵管端部，从而大量溢出小鼠卵母细胞复合体。
1.4培养小鼠原核胚
首先，要制作一胚胎培养碟，然后将小鼠原核胚放入其中，并且在上部覆盖一层石蜡油，将其放置在碳培养箱中，调节至37度环境下预热四个小时。把细胞复合体取出放在500uLHTF溶液中，利用移液枪吹打几次，并将卵丘细胞原核胚抽取出。多次反复进行此操作，待卵细胞全部脱落后，再将其移动到胚胎培养碟中培养。在移入时标记为0小时，在24小时以后，便开始观察小鼠卵细胞的分裂情况，而在48小时之后便开始观察小鼠细胞分裂情况，在72小时后观察小鼠桑椹胚分裂，在96小时后观察小鼠囊胚分裂轻，而在120小时之后，便开始观察小鼠囊胚孵化情况。
1.5实验设计方案
实验1不同培养基培养小鼠原核胚体，将正常受精之后的小鼠原核胚分为3小组，并且分别放入到三种不同培养基中，即HTF、CZB、KSOM中，共培养约120小时。并且要不断观察小鼠原核胚发育状况，对三组胚胎发育率加以统计，此次实验要进行多次。
实验2置于不同浓度的EGF或者是bFGF的KSOM溶液培养小鼠原核胚体将受精后的正常原核胚分成7组，分别在含有EGF以及bFGF的KOSM溶液中培养120小时。并且要不断观察小鼠的原核胚发育状况，再将各组培养基中小鼠胚胎发育率加以统计。此实验重复进行几次。
实验3利用WOW法培养小鼠原核胚，在受精后的原核胚分成2组，利用WOW法以及成组培养法培养小鼠原核胚胎。在培养约120小时左右，观察其原核胚发育情况，统计各组胚胎发育率，此实验重复进行多次。
实验4将小鼠原核胚体放在不同培养气相中培养，将受精后的原核胚分成3组，分别放在不同的混合气体中培养约120小时。观察小鼠原核胚体发育状况，统计各组胚胎发育率。此实验重复进行多次。
2.结果分析
2.1三组溶液对小鼠原核胚体发育产生的影响
通过实验我们得出：在这三组溶液中，其卵裂率、囊胚率、囊胚细胞并没有较大差异。其中，在KOMS溶液中的卵裂率是最大的，而CZB溶液中囊胚率比其它两种溶液要高，然而，HTF囊胚细胞数是最多的。
2.2 KSOM中EGF或者bFGF含量不同对小鼠原核胚体发育产生的影响
在培养基中，加入不同溶度的EGF或者是BFGF，并不会对小鼠原核胚发育产生较大的影响。
2.3 WOW对小鼠原核胚体发生产生的影响
实验结果表明：从卵裂率方面来分析，WOW要高于对照组，但是，效果不是十分明显；从小鼠受精细胞的囊胚率、囊细胞数角度分析，利用WOW法分裂能力要明显高于对照组。因此，便得出培养小鼠原核胚应该最好利用WOW法，其培养效果较好。
2.4培育气相不同对小鼠原核胚胎发育产生的影响
通过实验证明，在氧气浓度为5%的KSOM培养液与在肺气组CZB溶液中的的培养效果最好。
3.讨论
3.1不同溶液对小鼠原核胚体发育影响
对于哺乳类动物胚体的发育来说，是受很多因素影响的，但是，最主要的影响因素是培养基。然而，当前，哺乳类动物胚体体外发育往往会选用集中溶液包含HTF、CZB、KSOM等。虽然其它类型的胚胎培养液也可以支持哺乳动物胚胎的体外发育。然而，在体外培育胚胎过程中，常表现出一定程度的发育阻滞。在通过大量实验证明，HTF培养效果最好。
3.2不同浓度EGF或者是BFGF对小鼠胚体发育带来的影响
通过实验证明，小鼠的早期胚胎在体外发育过程中，因小鼠胚体原性生长因素在胚体发育中有较强的分泌调控能力，能够快速使胚体发育至囊胚时期。然而，只依靠内源性生长因素，会导致胚胎发育非常缓慢，并且囊胚的发育率偏低，最终导致囊胚细胞较少。因此，胚胎发育需要来自怒踢生殖管道分泌的生长因子的共同参与。但是，如果不具有外源性生长因素，那么会严重阻碍小鼠胚胎发育。
3.3培养方法不同对小鼠胚体发育产生的影响
在体外培养胚胎时，采用微滴方式可以促进胚胎的发育，但是，在选用WOW法培养胚胎时，因胚胎间相互隔离，能够使胚胎分泌的因子不被稀释，通过自分泌的方式作用在胚胎上，与此同时，又可以阻碍有毒物质作用在胚胎上，阻碍其发育率。
3.4培养气相不同对小鼠胚体发育产生的影响
通过上述实验证明，在氧气浓度为5%的条件下，KOSM培养溶液效果要高度其它几组，但是，其它两组培养效果没有较大差异。虽然小鼠胚体能够在高浓度的氧气环境中生长预发育，然而，在低浓度氧气环境下，能够提高胚胎的存活率，更会促进胚胎的发育。
【参考文献】
[1]刘洋，马兰，周红林.胰岛素对不同时期ICR小鼠胚胎体外发育的影响[J].昆明医学院学报，2009（11）.
[2]钱怀剑，丁彪.小鼠胚胎体外发育培养基中氨基酸含量变化[J].动物学杂志，2010（1）.
胚胎工程范文第4篇
[关键词]生物技术 现代畜牧业 影响 应用情况
现代生物技术作为高新技术，已广泛渗透到现代畜牧业的各个领域，为解决现代畜牧业生产领域所面临的许多重大问题开辟了新的途径。为优秀畜禽品种资源的保护与利用，良种的快速繁育，动物营养与饲料资源的开发利用，疾病的预防和诊断治疗，以及生物药品的开发提供了更加广阔的途径，促进了优质高效现代畜牧业的发展。
一、生物技术在畜禽品种方面的应用
以生物技术保存畜禽品种资源主要有2种途径。一是利用胚胎和生殖细胞的冷冻技术，这是静态保种技术，早在20世纪70年代就有一些国家以冷冻配子（、卵子）和胚胎进行畜禽遗传资源保存的研究。这种方法保存的优点是基因和基因型频率的变化降到了最低水平，抽样误差小，容易控制疫病，保存时间长，保种经费少，解冻后种群恢复快。育种中冷冻配子和活体保种相结合，可以减轻自然选择、近交和遗传漂变对基因、基因型频率带来的影响。二是利用分子生物技术建立畜群、禽群的基因文库。基因文库的建立就是利用DNA重组技术将决定畜禽重要经济性状的主基因或全部基因整合到某些特殊的基因载体上，然后用这些载体感染宿主细胞，通过宿主细胞的大量增殖构建各基因DN段的无性繁殖系（克隆），制备的克隆总体就是该畜禽品种的基因文库，保存该基因文库就等于保存了该畜禽品种，通过生物技术保存了畜禽优良品种的性状，保护濒临灭绝的动物。目前，许多发达国家已建有家畜冷冻库和胚胎库，低温冷冻保存家畜的研究和应用在50多年中有很快进展。
利用生物技术可简化良种引进方法，胚胎移植与胚胎冷冻技术相结合，良种的引进可简化为冷冻胚胎的引进，不仅运输方便、检疫程序简单、成本低廉，而且后代对引种地生态环境适应性和抗病力增强。目前，牛羊胚胎移植与冷冻技术已成为国际、地区间良种遗传资源交流廉价而简便的方式。
二、生物技术在动物遗传育种方面的应用
1.利用基因导入技术育种
哺乳动物转基因技术（transgenic technique）是基因工程与胚胎工程结合的一门新兴生物技术。科学家利用基因工程通过一定方法把人工重组的外源DNA导入性细胞或胚胎细胞受体动物的基因组中，或把受体基因组中的一段DNA切除，从而使受体动物的遗传信息发生人为改变，生产出带有外源DN段的动物，并且这种改变能遗传给后代。它打破种的界限使育种工作可以充分利用所有遗传变异，有目的、有计划和有预见地改变动物遗传物质的组成，生产出优良品种的动物。体细胞核移植（somatic cell nuclear transplantation）技术又称体细胞克隆，它是利用分化程度较高的体细胞移入去核卵子中，构建新合子的生物技术。在畜牧生产中，运用核移植技术可以从一枚优良胚胎出发，将其培养到多细胞时，通过酶使其分成许多单细胞卵裂球，再把每一个卵裂球的细胞核作为核供体，再将它们移植到去核的受体卵细胞中，使其发育成一个胚胎，由于所有胚胎的细胞核来自同一枚优良胚胎，他们都具有优良的潜质。通过核移植，可生产许多同质胚胎，实现优良家畜的无限扩增，最大限度地利用优秀母畜的遗传潜力。
2.提高动物产品的生产性能和质量
近年来，各国对家畜生产性能的改良目的是提高家畜肉、奶、毛及其它产品综合遗传力。在畜牧业中，利用转基因手段可以达到改善动物生产性能的目的。在namlner等获得转基因猪以后，转基因技术已取得了很大成果。把生长激素或促生长因子基因导入家畜基因组中，加速生长速度，提高饲料报酬。1985年，科学家第1次将人的生长激素基因导入猪的受精卵获得成功，转基因猪与同窝非转基因猪比较，生长速度和饲料利用率显著提高，胴体脂肪率也明显降低。表达牛生长激素的转基因猪生长速度比对照组快10-15％，饲料报酬提高16-18％，胴体中脂肪下降80％。
3.培育抗病品种
家畜疾病，尤其是传染性疾病是畜牧生产的大敌，由疾病造成的经济损失约占畜牧业产值的12％-15％。抗病性能是当前畜禽育种的重要目标性状，抗病育种的目标是培育出整体免疫力高的品种。目前，已发现的与免疫相关的综合抗病力候选基因为数不多，主要有MHC和NRAMPl，其中NRAMPl蛋白可抵抗分枝杆菌、沙门氏菌等多种胞内寄生病原菌的侵染而发挥重要免疫功能，对畜禽机体抗病力影响较大，目前已克隆了多种生物的NRAMPl基因。猪瘟是危害养猪业最严重的疾病之一，如果能培育出抗猪瘟病毒的新品种，将对养猪业做出巨大的贡献。谢庆阁等设计合成了阻断猪瘟病毒复制的核酸基因，研究了其抗病毒感染的功能，认为该途径是可行的。此外，对一些种属特异性的疾病，如果可以从抗该病的动物体中克隆出有关的基因，并将其转移给易感动物品种，就有希望培育出抗该病的品系。而在对畜禽类病原体基因组结构进行深入研究的基础上，将病原体致病基因的反义基因导入畜禽细胞，使侵入畜禽机体的病原体所产生的mRNA不能表达，从而起到抗病作用。
三、生物技术在动物繁殖方面的应用
1.人工授精技术
自20世纪40年代以来，人工授精技术蓬勃发展，已成为家畜品种改良的重要手段。人工授精在奶牛业的发展最快，目前多数国家已普及了对奶牛的冷冻人工授精，把人工授精技术作为家畜育种和扩繁的有力手段。法国经过后裔测定，优良种公牛遗传力的改进每年进展达20％。人工授精与胚胎移植相配合，提高了奶牛的产奶量，减少了饲养头数，人工授精大大提高了优秀种公畜的利用价值。绵羊人工授精仅次于牛、猪的人工授精，近20年来在很多国家也受到了重视。
胚胎工程范文第5篇
该课的教学内容及要求为：
（1）简述哺乳动物的和卵细胞的发生及受精过程。
（2）了解哺乳动物受精过程中的获能、顶体反应、透明带反应、卵黄膜封闭作用的概念和生理功能。
（3）简述哺乳动物的胚胎发育过程及其特点。
基于以上教学要求，在本节教学中要强调如下必记和必理解的知识点：
（一）胚胎工程的概念：是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。
（二）和卵子的发生
1.的发生
（1）场所：的发生是在内完成的。
（2）从初情期开始直到生殖机能衰退。
（3）过程：发生的过程大体可分三个阶段。
第一阶段：初级精母细胞的形成：精原细胞经过有丝分裂产生多个初级精母细胞
第二阶段：次级精母细胞的形成：初级精母细胞经减数分裂形成含有减半染色体的细胞
第三阶段：变形：细胞核形成线粒体鞘膜，其他物质浓缩成原生质
2.卵子的发生
（1）场所：卵子的发生是在卵巢内完成的。
（2）过程：雌性胎儿卵巢内卵原细胞，通过有丝分裂增加数量，演变为初级卵母细胞，被卵泡细胞包围形成卵泡。初级卵母细胞经过减数分裂变成成熟的卵子。减数第一次分裂时间是在雌性动物排卵前后完成的，结果是产生一个次级卵母细胞和第一个极体。减数第二次分裂时间是在和卵子结合的过程中，结果是产生1个成熟的卵子和第二极体。
（三）受精
1.卵子受精的标志：在卵黄膜和透明带的间隙可以观察到两个极体时。
2.场所：受精是在输卵管内完成的。
3.过程：包括受精前准备阶段和受精阶段。
准备阶段一：获能，即必须在雌性动物生殖道内发生相应生理变化后，才能获得受精能力的现象。准备阶段二：卵子的准备，即卵子在输卵管内达到减数第二次分裂中期时，才具备受精能力。受精阶段：包括穿越放射冠和透明带，进入卵黄膜，原核形成和配子结合。
（四）动物胚胎发育的基本过程
（1）受精场所是母亲的输卵管上段。
（2）卵裂期：特点：细胞有丝分裂，细胞数量不断增加，但胚胎的总体体积并不增加，或略有减小。
（3）桑椹胚：特点：胚胎细胞数目达到32个左右时，胚胎形成致密的细胞团，形似桑葚。是全能细胞。
（4）囊胚：特点：细胞开始出现分化（该时期细胞的全能性仍比较高）。聚集在胚胎一端个体较大的细胞称为内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织。中间的空腔称为囊胚腔。
（5）原肠胚：特点：有了三胚层的分化，具有囊胚腔和原肠腔。
强调必须掌握的解题关键为：
1．和卵子发生上的辨析
相同：两者都是在生殖器官内经过减数分裂而形成的。
区别：（1）卵泡的形成和卵巢的贮备，是出生前完成的，这是两者在发生上的重要区别，但不是唯一区别。
（2）的发生减数分裂的两次分裂是连续的，在曲细精管内进行的，场所是唯一的。卵子发生减数分裂的两次分裂是不连续的，第一次是在卵巢内完成的，形成的刺激卵母细胞和第一极体进入输卵管，与的结合过程中完成第二次分裂。因此，场所在卵巢和输卵管两处，不是唯一的。
（3）减数分裂中细胞质分配、形成成熟生殖细胞的数目、是否需要变形，都是两者在发生上的区别。
胚胎工程范文第6篇
论文摘要:从农村牧区养殖业的生产实际出发，系统论述了敏盖内蒙古白绒山羊在生产性胚胎移植中的技术程序。主要包括:提前的准备工作：选择适宜的供、受体羊，并加强饲养管理；胚胎移植条件的准备：在适宜的季节，用宁波激素厂促卵泡素（宁波三生激素厂），以减量法进行供体超排；供、受体比例为1:8～12;用阴道栓配合促性腺激素，或用氯前列烯醇(PG)进行受体同期处理；从供体输卵管手术回收的胚胎，移植于受体羊输卵管；完整的记录体系。
胚胎移植是现代生物工程高新技术，能充分发挥优良母畜的繁殖潜力，迅速扩大优良畜群和纯种规模，加速杂交改良速度，缩短改良周期和育种进程，增加双胎率，防止不育，尽快培育出我国优良绒山羊新品种。是一项投资少、见效快、利润丰，具有事半功倍的良种扩繁和现代育种技术。[1]
内蒙古鄂尔多斯伊金霍洛旗苏布尔嘠镇先后引入辽宁绒山羊品种与当地白绒山羊育种形成了敏盖内蒙古白绒山羊品种进行养殖，收益较大，一些农牧民积极购买此绒山羊搞起了养殖，而且其他地区的人也常在这里购买此羊（如通辽的三高肉羊培育责任有限公司等）回去将把这些羊作为供体羊进行胚胎移植，使得此品种在市场上处于供不应求的状态，为满足需求和帮助农牧民脱贫致富，政府投大量资金进行胚胎移植来提高繁殖率，同时也加快了山羊胚胎移植技术在农村牧区的迅速发展与推广。
1 关于开展农村牧区零散养殖胚胎移植的建议
在广大农村牧区每户养殖数很少，而开展胚胎移植工作又需要进行集中处理，所以根据这一特点，提出以下建议，供参考：
1.1 分户饲养与集体饲养相结合
要在同期处理的第15天将所要接受移植的个体全部结合到一块进行集中饲养，集中饲养时间为8-10天。
1.2胚胎移植受体羊只的统计
在胚胎移植前3个月进行村内移植受体羊统计，具体数量根据现有供体羊的数量进行确定，供受体参考比例为1：10。
1.3胚胎移植处理时间确定
鄂尔多斯地区一般在每年8月下旬至11月上旬进行同期处理较为合适。
1.4 受体羊的选择及饲养管理
1.4.1受体选择：
受体羊健康状况良好， 膘情适中，选择繁殖机能正常，无传染性疾病、无生殖器官疾病，年龄在2～6岁之间的经产的羔羊断奶一月以上的母羊。[2]
而且在移植前2个月进行定期驱虫，以利于个体抓膘，提高同期及受胎率。
1.4.2公母分群
所要进行移植的羊只一定要进行公、母羊分群饲养，以防受体羊只提前怀孕而流产造成不必要的经济损失。
1.4.3饲养管理（短期优饲）
要求被处理个体在移植前加强饲养管理，使个体达到中等膘情，但也不能过肥或过瘦。
从同期放栓之日起要适当增加豆类饲料和萝卜等饲料的供应，进行短期优饲能提高同期及受胎率。
1.5供体羊的选择及饲养管理
1.5.1 供体选择
供体羊(敏盖内蒙古白绒山羊)为经产2-5胎的母羊，身体健康状况良好，生殖器官正常， 正常繁殖史，繁殖力较高， 遗传性稳定，生产性能优良，羔羊断奶1个月以上，未孕。[2]
1.5.2 供体的饲养管理
对供体羊进行常规传染病和寄生虫病的防治。饲养管理遵循一般繁殖羊群的原则。保持羊群体况适度，根据羊群营养状况适时调整日粮标准，即增加蛋白质、能量饲料补充料，并注意矿物质和维生素的供应。[8]
1.5.3 供体羊准备期的日粮配制
A、
优青草2公斤
B、
优质紫花苜蓿干草粉0.5-1公斤或鲜紫花苜蓿2-2.5公斤
C、
胡萝卜0.4公斤
D、
干玉米秸、胡萝卜秧等混合草粉0.5公斤
E、
精料0.5公斤，（精料配方：玉米面59斤，麸皮15斤，豆粕22斤，母羊专用预混料1斤，石粉或磷酸氢钙1斤，食盐1斤，微量元素添加剂1斤，合计100斤）[5]
2 准备工作
2.1 物品准备[3]
2.1.1 器材
高压灭菌锅、 20ml 注射器、 10ml 注射器、5ml 注射器、1ml 注射器、胚胎移植手术架、手术刀片、医用缝合线、体视显微镜、冲胚管、集卵皿、培养皿、消毒卫生纸、医用喷壶 、黑色记号笔、宫颈扩张器、移胚器、检胚皿、剪毛剪、外科剪、手术刀、止血钳、创巾钳、持针钳、手术镊、缝合针、创巾、止血纱布、脱脂棉、盆等。
2.1.2 药品
冲胚液、胚胎培养液、冰袋、生理盐水、新洁尔灭洗涤液、碘酊、酒精、青霉素、黄胺粉、FSH 、孕马血清、CIDR、阴道海绵栓、氯前列烯醇(PG)、黄体酮、麻醉剂（2％静松灵）、苏醒灵等。
2.2胚胎移植操室准备
50m2的以上房间，分隔为2个房间，胚胎移植手术室和胚胎操作室。并设置工作台及药械台等。室温保持在22℃-25℃，并用新洁尔灭进行室内消毒。[4]
3. 供、受体羊的同期及供体的超排
具体方案如下：
日 期
早8时，放置海绵栓
早8时，放置阴道海绵栓
早8时，取出海绵栓、放入一新的海绵栓
晚6时，肌注PMSG200iu
晚6时，肌注PMSG200iu
晚6时，肌注FSH28-30iu
早8时，肌注FSH28-30iu
晚6时，肌注FSH23-25iu
早8时，肌注FSH23-25iu
晚6时，a、肌注FSH18-20iu
b、肌注PG0.5ml
晚6时、肌注PG0.5ml
早8时，a、撤出海绵栓（青霉素冲阴道）
b、肌注FSH18-20iu
晚6时，a、开始试情
b、后立即静注LH130-140IU
c、后立即进行输精
早8时，撤出阴道海绵栓
晚6时，开始试情
进行手术输精(12小时)
早8时试情
输卵管冲胚（建议在下午开始较好）
输卵管移植
4 胚胎回收及胚胎检查
4.1 供体羊术前准备
胚胎回收手术前1天停止饲喂草料而只给少量饮水，否则由于腹压过大，会造成手术的困难和供体生殖器官的损伤。饲喂干草的母羊，停饲的时间不能少于24小时，饲喂青草或在草地上放牧的羊，停饲时间可减少至18个小时。在术前一天术部进行剪毛和剃毛，常有许多剃断的毛粘于皮肤，很难消除干净，手术中易带入创口造成污染，可采用干剪毛湿剃毛，剪毛完毕后用肥皂涂于要剃毛的部位，再用剃毛刀剃毛，然后用干毛刷将断毛刷除干净。第二天进行冲胚手术。
4.2 供体羊冲胚： 供体羊的冲胚手术在授精后68-72小时进行。（采用输卵管冲胚法可获2-8细胞期的胚胎及少量的16细胞期胚胎。用于鲜胚移植。）[6]
首先，对供体羊全身麻醉，术部消毒后，采取前低后高半仰姿势将其保定在手术台上。在腹底部偏右侧距乳房基部3-4cm处做一长4-5cm的纵向切口，逐层切开，切开腹膜后，将中指和食指伸入腹腔在骨盆腔前沿膀胱之下触摸子宫角，把子宫角牵引到切口之外，再把卵巢引出，检查黄体发育情况，如果黄体发育正常，即冲胚。冲胚时，在输卵管伞部前端插入一个带有胶管的回收圆针，并用手卡住，准备收集冲出的胚胎；再向输卵管的壶腹部处，插入装有冲胚液的进液针头，缓慢推入冲胚液，将胚胎冲入器皿中，冲胚液用量30-50ml。一侧冲洗结束时，除去器械，检查针孔，确认无出血现象，将输卵管送回腹腔内，然后按同一操作办法进行另一侧冲胚。两侧冲洗完毕后，将子宫送回腹腔并向腹腔内注入25℃～30℃生理盐水，最后逐层进行缝合。
4.3胚胎检查：
4.3.1检卵
将收集的冲卵液于37℃温箱内静置10-15分钟。胚胎沉底后，移去上层液。取底部少量液体移至平皿内，静置后，在视体显微镜下先在低倍(10-20倍)下检查胚胎数量，然后在较大倍数(50-100倍)下观察胚胎质量。
4.3.2吸胚
用移植器先吸一段1cm长的保存液，再吸一段0.5cm的空气，然后吸取胚胎。含胚胎的液柱不超过1.5cm。
吸胚是为了移取、清洗、处理胚胎，要求目标准确，速度快，带液量少，无丢失。吸胚可用1毫升的注射器装上特别的吸头进行，也可使用自制的吸卵管。
4.3.3胚胎质量鉴定
正常发育的胚胎，其中细胞(卵裂球)外形整齐，大小一致，分布均匀，外膜完整。无卵裂现象(未受精)和异常卵(外膜破裂、卵裂球破裂等)都不能用于移植。
处于二分体到四分体的胚胎
4.3.4胚胎保存：
用吸卵管吸取发育成熟的胚胎，放入PBS培养液中保存，在24-26℃下，保存时间不超过4-5小时。
5 受体羊胚胎移植(术前准备同供体)
首先，对受体羊注射麻醉剂，实行全身麻醉，术部消毒，采取前低后高半仰姿势将受体羊保定在手术台上，在腹底部偏右侧距乳房基部3-4cm处做一个长4-5cm的纵向切口，逐层切开，切开腹膜后，引出子宫、输卵管以及卵巢，检查黄体，无黄体或黄体过小的受体羊不能做胚胎移植；若有孕妊黄体，且生殖系统无炎症，即作为受体羊。将受体羊黄体一侧的输卵管伞部拔开，用装入胚胎的注射器从此处插入3-4㎝，将胚胎注入输卵管内。移植结束后，把子宫角送入腹腔，在创口洒上抗菌素，防止感染，按手术要求缝合好腹壁创口。
6 术后护理
6.1供体术后护理及配种繁殖
胚胎回收手术后注意伤口护理，注意观察，有问题及时处理。对季节性繁殖的品种，为了不影响其自然繁殖及次年羔羊管理，当年只进行一次超排，并在下次时配种，自然繁殖。[7]
6.2 受体术后护理与妊娠、分娩
完成受体胚胎移植后，应加强术后护理、观察，对妊娠受体适当增加日粮营养，以满足妊娠需要，妊娠后期更应加强管理，防止流产，并做好接产和羔羊护理工作。[9]
7 结果与存在的问题
7.1 总体移植情况
共处理供体63只，其中怀孕3只，未1只，未冲胚1只，可用胚493枚，未受精卵141枚，共处理受体（同期处理）500只，受体移植数量 431只。
7.2 存在的问题
（1）由于参加胚胎移植的人员中有几个是教师，所以移植只好安排于暑假期间，但是对于鄂尔多斯地区来说，最佳的移植时间一般是在8月下旬---11月上旬，略有些早，影响供体的超排效果。
（2）超排效果不够稳定，利用外源性促性腺激素刺激多排卵并不能每次都得到预期效果，不同的个体对超排处理的反应差异极大，排卵率很不稳定，有的个体甚至对超排处理毫无反应或排卵数很少，也有的个体经超排处理后卵巢上虽有大量卵泡发育，但无排卵发生。[10]
（3）当地农牧民意识比较差，不懂这方面的知识，在苏布尔嘎村时，有几家牧民在输精前一天的晚上偷着利用了种公羊与自家不进行胚胎移植的母羊配种，以至第二天所采品质下降，造成供体羊受精率降低。出现了很多未受精卵。
（4）胚胎回收率低，位于输卵管或子宫角内的胚胎并不能够全部回收，而且排卵数过多往往会降低胚胎的回收率，其原因可能是卵巢体积太大（超排处理的结果），排出的卵子未能进入输卵管伞而丢失。[11]
（5）考虑到农牧民工作忙等问题，在刚移植完就让其各自把羊拉回去或赶回去，我认为路程稍微远的应该过几天运输或赶。否则造成术部损伤不利于愈合或造成早期流产等。
8总结与展望
胚胎工程范文第7篇
基因工程，也称遗传工程。转基因，也就是通过人工方法，把某种生物的基因（外源基因），有目的地移植到另一种生物的胚胎细胞中，使两种生物的基因互相渗透，结合在一起。这种得到外源基因的生物，就是转基因生物。
转基因成果，最早出现在20世纪80年代。美国科学家把只发育了五六天的山羊和绵羊的胚胎取出来，然后将山羊的胚胎细胞注入到绵羊的胚胎细胞里面，让它在试管里发育一段时间，再移入绵羊的子宫里。结果，生育出来的是长着山羊胡子绵羊毛的“怪羊”，很难说它是山羊还是绵羊了。
转基因技术与植物、动物的“杂交”不同。杂交，都是在植物或动物的同一种属之间进行的，是能够进行杂交的；而转基因则可以将根本不能进行杂交的生物“结合”在一起。比如，将动物与植物“结合”在一起，这在过去会被认为是“天方夜谭”。然而，基因工程却可以做到这一点。
草莓是极不耐寒的植物，尤其是果实受冻以后味道很差。为了改变这种状况，俄罗斯的科学家将北极耐寒的比目鱼的御寒基因移植到草莓的细胞中，从而得到一种耐寒的草莓新种。
天蚕，是一种珍稀的野生蚕种。天蚕丝具有天然的葱绿色，非常鲜艳，并具有折光性，阳光一照，色彩缤纷，被人们誉为“丝中钻石”。可是全世界的天蚕丝每年的产量不到800千克。饲养野生的天蚕，难度极大。由于天蚕与家蚕的亲缘关系甚远，通过常规的有性杂交育种行不通。所以，只有通过遗传工程将天蚕优良丝质基因植入家蚕基因组织内。我国科技人员克服重重难关，终于培育出转基因的新蚕类“大别山天蚕1号”，从而获得具有天蚕丝质的家蚕新种，使天蚕丝的年产量得以提高。
胚胎工程范文第8篇
个人简介：
石德顺，男，1962年出生，广西兴安县人，博士，研究员，现任广西大学动物科技学院院长，博士生导师，兼任畜禽育种国家工程实验室技术委员会委员、国家转基因生物新品种培育重大专项执行专家组专家等职务。
多年来一直从事动物克隆及体外受精等技术的研究与开发工作。先后丰富和发展了牛卵母细胞体外成熟、体外受精和胚胎早期发生的理论，在国内建立了一套高效的牛体外受精程序，先后繁殖了试管牛犊230余头，且各项主要技术指标达到国际领先水平。研究成功获得了世界上首例受精卵冷冻保存的试管牛、体细胞克隆水牛、转基因克隆水牛、显微授精转基因水牛和慢病毒介导的转基因水牛，我国首例试管水牛和胚胎细胞克隆牛。
先后280余篇，参编专著两部，教材三部，获省级科技进步奖一、二、三等奖各一项，国家科技进步二等奖一项，申请国家发明专利12项（已获授权2项）。曾先后4次担任国家“863”计划课题、“973”计划课题和国家转基因生物新品种培育重大专项课题的评审专家，2次担任国家“973”课题的中期评估和验收专家，多次参与国家“863”计划战略研究规划、项目年报和国家转基因生物新品种培育重大专项实施方案的编制工作。先后获得国家有突出贡献的中青年专家、享受国务院政府特殊津贴专家、全国优秀教育工作者、国家“百千万”人才工程第一、二层次人选、中国科协西部开发突出贡献奖、全国“五一”劳动奖章等称号。
克隆原为英文“clone”或“cloning”的音译，而英文“clone”则起源于希腊文“Klone”，原意是指以幼苗或嫩枝插条，以无性繁殖的方式培育动植物，克隆技术又称为“生物放大技术”。自1965年生物学家童第周对鲤鱼、鲫鱼进行细胞核移植技术开始，我国的克隆技术也日臻成熟。1995年7月14日是一个值得纪念的日子，我国第一头胚胎细胞“克隆”牛犊在广西诞生，广西大学石德顺教授在科研探索的道路中书写了又一重大克隆技术的创举。本期，本刊记者邀您一起探访这位“克隆”技术金字塔上的人。
孜孜好学终圆求学梦
上世纪60年代末，石德顺踏入了学堂，学习成绩一直名列前茅。
70年代中期，初中毕业后，石德顺被推荐到公社“五·七”劳动学校学习。由于特殊情况，上学不到半年时间他就退学回家务农。14岁的他当过木工，修过水库、公路。艰辛的日子里，他的求学梦始终坚守在心中。1978年，石德顺再次走入校门，成为“五·七”劳动学校的一名插班生。尽管当时学校设备落后、师资不足，但是，石德顺凭着超人的毅力刻苦学习，1979年，当年该校只有他一人高考金榜题名，考入了广西农学院畜牧学专业。
石德顺上大学后，面对优良的学习资源，他如饥似渴地扑到书海里，课余时间他是图书馆的常客，他对生物技术类的知识产生了浓厚的兴趣，并产生了希望在这条道路上也成为一名攀登者的愿望。
毕业那年，石德顺报考南京农业大学的研究生，考试成绩优秀，却因为客观原因与南京农业大学失之交臂，最终被分配到广西兴安县畜牧水产局工作，成为一名基层干部。参加工作后的石德顺，仍然没有放弃自己的求学梦，他选择了继续考研之路，第二年考上了母校——广西农学院，并有幸师从我国著名畜牧学家王丕建教授，开始了他的研究生生涯，更明确坚定了自己的主攻方向。研究生毕业后，石德顺就职于广西科学院，不久，他调回广西农学院主攻试管牛研究工作，并于1989年受委派赴爱尔兰都柏林大学攻读博士学位。
在爱尔兰攻读博士期间，石德顺对牛胚胎体外技术中的卵细胞的体外成熟、体外受精及受精卵的体外培养等三方面进行了大量系统的研究，使牛胚胎体外生产技术的效率有了大幅度提高。卵母细胞的胚胎发育率由原来的20%-30%提高到40%-50%。此外，在卵母细胞的体外成熟、胚胎早期发生等方面理论上也有了一些全新的认识和突破。毕业之际，年轻的石德顺博士的出色表现，得到了导师Ian Gordon教授和答辩主考老师R·H·F·Hunter教授的高度评价。石德顺学成后，带着报效祖国的理想，毅然放弃了国外开出的优厚待遇，1991年8月，回到了培育他的这片壮乡热土 。
科研之路看我挥斥方遒
回国后，石德顺所在的动物繁殖研究室正承担国家“863”项目“牛体外受精技术的研究与开发”，由于国内实验条件的不足，该项目的研究一直未能取得明显的进展。石德顺充分利用在国外的学习所得，很快在国内条件下建立了一套高效的牛胚胎体外生产程序，受精分裂率由原来的35%提高到了70%，并于1992年9月获得了广西首例试管双犊，同时还提出了“牛体外受精的影响因素是多方面的，其效果是诸多因素综合效应的结果，环境条件的改变亦需对其程序作相应调整”的新论点。经过进一步系统的研究，牛卵母细胞的受精分裂率稳定在80%左右，囊胚发育率达50%-70%，胚胎冻后存活率达80%，鲜胚移植妊娠率达50%-60%，冻胚移植妊娠率亦达40%，一共繁殖试管牛犊230余头（约占国内试管牛总数的3/4），各项主要技术指标达到国际先进水平。此外，冻前部分脱水、超速冷冻牛体外受精胚胎的研究也已取得了新的突破，获得了世界首批用该方法冷冻保存繁殖的试管牛犊（6头），且发现全为公犊。这不仅简化了体外受精胚胎的冷冻方法，便于推广应用，还为牛的性别控制提供了一条新的途径。该项成果于2000年获国家科技进步二等奖。
在牛体外受精技术成功的基础上，石德顺还参与水牛体外受精技术的研究，为1993年9月我国首例试管水牛的成功作出了重要贡献。
受精卵和卵母细胞的冷冻保存一直是低温生物学的一个难题。石德顺采用玻璃毛细管作为冷冻容器，并对防冻剂和平衡方法进行了系统研究，终于建立了一套牛体外成熟卵母细胞和受精卵的玻璃化冷冻保存方法，于1999年4月获得世界首例受精卵冷冻保存的试管牛犊，各项技术指标达到国际先进水平。
动物克隆一直是胚胎生物技术研究的热点，石德顺于1993年就开始对这方面进行研究。经与华南师大谭丽玲开展合作攻关，很快就取得了胚胎细胞核移植技术的突破，于1995年7月14日研究成功获得我国首例胚胎细胞克隆牛，1996年2月17日又获得另一头胚胎细胞克隆牛（因未及时助产死亡），填补了我国在该领域的空白。