全丝胶蚕品种丝胶蛋白酶的抗氧化能力
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇全丝胶蚕品种丝胶蛋白酶的抗氧化能力范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
摘要：本文比较了全丝胶品种蚕茧热水溶解的全天然丝胶蛋白质与其他非全丝胶品种蚕茧的丝胶蛋白质及其丝胶蛋白酶的抗氧能力。结果表明，丝胶蛋白本身没有抗氧化能力，不同品种的丝胶蛋白酶的抗氧化能力则各不相同，去除羟基自由基和去超氧自由基的能力，全天然黄绿丝＞全天然白丝＞菁松皓月＞远缘杂交黄丝＞远缘杂交白丝。
关键词：全丝胶蚕品种 丝胶蛋白酶 抗氧化能力
前言：
人类生存的环境中充斥着不计其数的自由基，我们无时无刻不暴露在自由基的包围和攻击中。炒菜油烟产生大量自由基，吸烟能最直接产生自由基。汽车尾气、工业生产废气等环境污染产生的大量废气产生大量自由基。另外，人体自身新陈代谢过程中由于氧化反应也会产生自由基。
自由基对人体攻击的途径是多方面的，既有来自体内的，也有来自外界的，自由基对人体的攻击，既在最深层引起突变，又在最表层留下痕迹。自由基引发氧化作用，人体体外发生氧化，光和空气容易产生活性氧化酶和促进酪氨酸活性化活性，使皮肤发皱、产生斑点、变黑老化、引发皮肤癌变的可能。人体皮肤体内发生氧化，由于活性氧化酶作用，会引起精神紧张、心累、苦痛、寒冷、感染等极其普遍的刺激，而产生生体机能的变化，与癌、动脉硬化、糖尿病等具有密切关系。人类的食品发生氧化，人体本身是产生活性氧化酶和促进酪氨酸活性化活性的好适环境，食品的氧化是酶的褐变和黑色素的积累过程，使食品变质，营养破坏，导致一系列的食品制造、安全保鲜、营养吸收等恶劣后果。各种自由基所引发的氧化作用，是导致身体中各组织和器官损伤、病变的重要原因之一。人的衰老、动脉硬化、心脏病、肿瘤、肾病、肝病、糖尿病、白内障等近百种疾病的发生和发展均与自由基所引发氧化有关。
蛋白质抗氧化能力的大小在于去除自由基的能力。因此，降低自由基危害极为重要。降低自由基危害的途径也有两条：一是利用内源性自由基清除系统清除体内多余自由基；二是发掘外源性抗氧化剂――自由基清除剂，阻断自由基对人体的入侵。
不同分子量范围的丝胶蛋白酶具有较强的自由基清除清除作用，非常适合于化妆品护肤品、医药保健品等领域的应用。然而，现行利用的丝胶基本上都是从生丝加工时排出的精炼液中回收的，或是从茧壳中用碱水和热水溶出。回收提取的丝胶蛋白容易变性，而且易混入分解物，透析、精制的工艺复杂，生产成本高。
日本在世界上首次育成了家蚕丝胶品种，丝胶含量达到98.5％。是直接用于各种丝胶高级化妆、保健等产品的优良材料。本研究组利用日本引进的丝胶品种资源和自主创新品种资源，采用远缘杂交、基因导入、定向选育等方法，育成“绿s”和“白s”两个丝胶特殊蚕品种，全天然丝胶蛋白含量达97％以上。本文在利用丝胶特殊蚕品种大量生产优质的全天然纯丝胶蛋白质的基础上，探讨丝胶品种生产的全天然丝胶蛋白质及其丝胶蛋白酶的抗氧化能力。
一、材料与方法
1 材料
1.1 蚕茧品种
绿S 全天然黄绿色丝胶品种
白S 全天然白丝胶品种
YZ01 远缘杂交黄绿色普通品种
YZ02 远缘杂交白色普通品种
JS 菁松皓月现行普通品种
均由安徽省农业科学院蚕桑研究所提供。
2 实验方法
2.1 丝胶溶解
称量供试品种蚕茧各5g，用温水洗涤去掉赃物，剪成碎片，加入用氢氧化钠调PH至10.5的溶液250ml，浸泡一小时，加入10g碳酸钠/100ml，放入灭菌锅在125℃煮2.5h，用纱布过滤，生丝用温水洗涤三遍，合并蚕丝脱胶液和洗涤液，然后滤纸抽滤，获得丝胶溶液。
2.2 丝胶溶液浓缩
丝胶溶液在80℃旋转蒸发至约200ml，浓缩液加入400m195％的乙醇，摇匀，在6000r/min分离心10min，弃去上清，留下沉淀。
2.3 冷冻真空干燥
分别在试管中加入20ml丝胶浓缩液置于离心管中，往其中慢慢滴入0.1mol/l的盐酸溶液，至溶液中有浑浊，放入在冷冻真空干燥仪在样品温度-33℃，压强1帕斯卡条件下干燥。
3 丝胶蛋白酶解物的抗氧化性
3.1 抗氧化性实验原理
清除羟基自由基：双氧水在亚铁离子的催化下会反应生成羟基自由基，生成羟基自由基过程中，536nm和510nm处有光吸收的中间产物，当加入超氧自由基清除剂时，能迅速与超氧自由基反应，阻止中间产物的积累，致使溶液在320nm处吸收减弱，以水杨酸乙醇溶液作为捕捉剂，生成紫色，在波长510nm和536nm检测吸光度来评价清除剂对羟基自由基的清除作用。
清除超氧自由基(-O2-)：采用邻苯三酚自氧化法产生超氧自由基，邻苯三酚在pH＞7.9后迅速自氧化。自氧化过程中形成一系列320nm处有光吸收的中间产物，当加入超氧自由基清除剂时，能迅速与超氧自由基反应，阻止中间产物的积累，致使溶液在320nm处吸收减弱。通过测定吸光度值加值来评价清除剂对超氧自由基的清除作用。
3.2 试剂的配制
0.05mol/l Tris-HCl缓冲液(pH8.2)：准确称量Tris：6.057g，加入990mL蒸馏水，混匀，使得Tris溶解，用1mol/1HCI调PH到8.2.
水杨酸乙醇溶液：准确称量水杨酸0.143g，用无水乙醇定容到100ml，摇匀。
3.3 去除羟基自由基的实验方法
用FeSO4+H2O2产生-OH，以-OH氧化水杨酸钠所得产物的吸光值表示OH的多少，吸光值越大，-OH越多。反应试管中加入0.5ml，9mmol/1FeSO4、0.5m19mmol/l水杨酸一乙醇及1ml不同浓度的样品，最后加9mmol/1H2O20.5m1启动反应，37℃温浴1h，取约0.1g丝胶蛋白溶于水作为样品溶液，以0.5mL蒸馏水作空白代替待测液作空白试验，于536nm处测吸光值。
清除率(％)=[A3-(A1-A2)]/A3×1400
式中：A1为对照不加样品；
A2为某浓度时的吸光值；
A3为无显色剂时的该浓度的本底值。
3.4 清除超氧自由基的能力
取0.05mol/l Tris-HCl缓冲液(pH=8.2)4ml，置于25℃水浴中预热20min，分别加入待测液0.5ml和25mmol/l邻苯三酚溶液0.5ml，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入8％的HCl0.2ml终止反应，在320nm处测吸光度，取约0.1g丝胶蛋白溶于水作为样品溶液，以0.5ml蒸馏水作空白代替待测液作空白试验，于536nm处测吸光值。
清除率(％)=[A3-(A1-A2)]/A3×100
式中：A1对照不加样品；
A2底物浓度时的吸光值；
A3无显色剂时的该浓度的本底值。
3.5 丝胶蛋白酶解物的抗氧化能力
丝胶蛋白酶解在试管中加入0.1g/ml风味酶2ul、0.1g/l丝胶溶液、PH7.0、液温50℃的条件下进行酶解反应2h后，100℃水煮10min对酶的灭活后对其样品溶液进行吸光值测定，并计算去除自由基能力。
二、结果与分析
1 丝胶蛋白本身的去除羟基自由基能力
制备1g/1未经过酶解的丝胶蛋白溶液，设置3个重复区，在波长536nm处进行检测吸光度，按照3.4的方法计算去除羟基自由基能力如表1。
从表1可以看出，丝胶蛋白本身的去除羟基自由基的能力很差，几乎没有底物浓度的差别，最高的仅为2.469％，几乎可以认为丝胶蛋白本身没有抗氧化能力。
2 不同蚕茧提取的丝胶蛋白的去除羟基自由基的能力
取供试的5种丝胶蛋白，分别制备1g/1经过风味酶解的丝胶酶解物0.1g/1，设置0.02-0.10％的5个不同底物浓度，各3个重复区，在波长536nm处进行检测去除羟基自由基吸光度，按照3.4的方法计算去除羟基自由基能力，丝胶蛋白浓度作为横坐标，去除羟基自由基的能力作为纵坐标，得到图1及图2。
图1、图2显示同样的趋势，各种丝胶的去除超氧自由基的能力不同，基本上是全天然黄绿丝＞全天然白丝＞远缘杂交黄丝＞远缘杂交白丝＞菁松皓月，随着蛋白浓度在增加，去除超氧自由基的能力也随之增加，绿s的去除超氧自由基能力最高可达到25％以上，白S的去除超氧自由基能力也可达到20％以上。菁松皓月仅在7％左右。
3 不同品种丝胶蛋白酶解物的去除超氧自由基的能力
取供试的5种丝胶蛋白，分别制备1g/1经过风味酶解的丝胶酶解物，设置0.02-0.10％的5个不同底物浓度，各3个重复区，在波长320nm处进行检测去除超氧自由基的吸光度，并且计算去除羟基自由基能力，丝胶蛋白浓度作为横坐标，去除羟基自由基的能力作为纵坐标，得到图3。
和图1、图2实验结果相近，各种丝胶的去除超氧自由基的能力不同，基本上是全天然黄绿丝＞全天然白丝＞远缘杂交黄丝＞远缘杂交白丝＞菁松皓月，随着蛋白浓度在增加，去除超氧自由基的能力也随之增加，绿S的去除超氧自由基能力最高可达到40％以上，白S的去除超氧自由基能力也可达到25％以上。菁松皓月仅在7％左右。
三、讨论
1 丝胶蛋白本身没有抗氧化能力，但经过酶解后的丝胶多肽具有较强的抗氧化性能力。
而“绿S”蛋白质的酶解物消除自由基的能力远比其他品种丝胶强，其主要原因是“绿S”丝胶蛋白质中的含有较多具有抗氧化、消除自由基的能力黄酮素。
2 随着丝胶蛋白的增加。也就是底物浓度的增加，在酶的催化下水解，产生的具有去除超氧自由基的多肽的量就比较多，所表现的去除超氧自由基的能力就比较强，如果底物浓度再提高，相信去除自由基的效果会更明显，但需要试验结果加以证实。
3 丝胶蛋白只有在酶解成多肽过程中才具有去除自由基的能力的结果，验证了山崎等丝胶蛋白本身几乎不具有抗氧化作用的结论，验证了加藤的丝胶水解物具有较强抗氧化作用的结论，使两位学者的观点得到统一。
4 利用品种生产全天然纯丝胶蛋白质是研究和开发天然抗氧化剂在化妆品、保健食品、生物领域的应用具有重要意义。