寒痹康汤对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞NF―κB表达的影响

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【摘 要】目的：观察寒痹康汤对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞核转录因子-κB表达的影响，初步揭示寒痹康汤治疗类风湿关节炎的机理。方法：采用牛Ⅱ型胶原蛋白和弗氏不完全佐剂诱导关节炎大鼠模型，以甲氨蝶呤为对照组，观察寒痹康汤对各组大鼠滑膜细胞核转录因子-κB表达的影响。结果：寒痹康汤能降低胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞核转录因子-κB的表达，作用与甲氨蝶呤相当。结论：寒痹康汤影响胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞核转录因子-κB的表达，是其治疗类风湿关节炎的机理之一。

【关键词】 关节炎，胶原诱导性；寒痹康汤；核转录因子-κB

Influence of Hanbikang Decoction on the Expression of NF-κB in Synovial Cells of Collagen-Induced Rats with Rheumatoid Arthritis

Pang Xue-feng，Wang Qian，Wu Yan-hong，Tang Li-ping，Huang Chan-juan，Peng Zhong-yi，Liu Huan，Long Chao-yang，Pan Yan，Li Yu-ling

【ABSTRACT】 Objective：To observe the effect of hanbikang decoction on the expression of NF-κB in synovial cells of collagen-induced rats with rheumatoid arthritis to probe the mechanism of it in the treatment of rheumatoid arthritis.Methods：Bovine collagen type II and freund's incomplete adjuvant were used to induce rat model with arthritis to observe the expression of NF-κB in synovial cells of collagen-induced rats with rheumatoid arthritis with methotrexate as the control group.Results：Hanbikang decoction could reduce the expression of NF-κB in synovial cells of collagen-induced rats with rheumatoid arthritis，with almost the same function as methotrexate.Conclusion：Hanbikang decoction could influence the expression of NF-κB in synovial cells of collagen-induced rats with rheumatoid arthritis，being one of the mechanisms in the treatment of rheumatoid arthritis.

【Key words】 arthritis，collagen-induced；hanbikang decoction；NF-κB

类风湿关节炎（rheumatiod arthritis，RA）主要是机体对自身滑膜发生免疫反应的疾病，在RA的病理机制中，核转录因子-κB（NF-κB）的异常活化与滑膜组织炎性增生及其对关节局部组织的侵蚀密切相关。本研究采用牛Ⅱ型胶原蛋白（CⅡ）和弗氏不完全佐剂诱导大鼠关节炎模型（CIA），观察寒痹康汤对滑膜细胞NF-κB表达的影响，探讨寒痹康汤治疗RA的机理。

1 实验材料

1.1 实验动物 60只Wistar大鼠，雌性，体质量（100±10） g，购于广西中医药大学实验动物中心。

1.2 实验试剂 牛II型胶原蛋白、弗氏不完全佐剂购于Chondrex（美国）公司；NF-κBp65兔抗体、SP-9000/9001/9002 HistosainTM-Plus Kits免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒及ABC复合物试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 实验药品 寒痹康汤（组方：秦艽、防风、黄芪、附子、麻黄、当归、淫羊藿、狗脊、青风藤）由广西中医药大学附属瑞康医院新药研发中心制备提供。甲氨蝶呤由上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂生产（生产批号20070121）。

2 方 法

2.1 造模及分组 60只大鼠适应性喂养7 d后，从中随机取10只为正常对照组，其余大鼠参照文献资料[1]方法造模：在无菌条件下，用0.1 mol・L-1冰醋酸充分溶解牛II型胶原蛋白，浓度为4 mg・L-1，

置4 ℃冰箱过夜后，再与等体积弗氏不完全佐剂

（1 mg・mL-1）混合、震荡至充分乳化，制成CII乳剂，置4 ℃冰箱保存备用。实验时分别在每只大鼠颈、背部进行多点皮内注射0.25 mLCII乳剂致炎，14 d后再次按上述方法和剂量进行免疫。免疫成功后（评分4分以上）随机分为模型组、甲氨蝶呤组、寒痹康汤高剂量组、寒痹康汤中剂量组、寒痹康汤低剂量组5组，每组10只。

2.2 给 药 正常对照组自由饮食，模型组以生理盐水2 mL・（100g）-1灌胃，每日1次；甲氨蝶呤组灌服甲氨蝶呤药液2.7 mg・kg-1（为70 kg成人临床用药3倍），每只灌服约0.405 mg，每周灌服1次；寒痹康汤高、中、低剂量组，分别以寒痹康汤（含生药16 g・kg-1、8 g・kg-1、4 g・kg-1）

2 mL・（100g）-1，每日分2次进行灌胃。

2.3 检测项目

2.3.1 关节肿胀指数 参照文献资料[2]采用0～4级关节评分法进行评分。0分：无关节炎；1分：小趾关节轻度肿胀；2分：小趾关节和足跖肿胀；3分：踝关节以下的足爪肿胀；4分：包括踝关节在内全部关节肿胀。关节指数积分越高，关节症状越严重。评分4分以上为造模成功。

2.3.2 标本采集 正常对照组、模型组及各实验组大鼠灌胃治疗36 d后，腹腔内注射2%戊巴比妥钠注射液进行麻醉，逐层分离膝关节各层组织，采集滑膜组织，用甲醛固定，石蜡包埋切片，切片厚度5 μm。

2.3.3 NF-κB的检测 石蜡切片常规脱蜡至水。PBS冲洗3次，每次3 min。滴加3% H2O2去离子水，37 ℃温箱孵育10 min。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。滴加试剂A，37 ℃温箱孵育15 min，倾去，勿洗。滴加1∶200的NF-κB兔抗体，4℃孵育过夜。PBS冲洗3次，每次3 min，滴加试剂B，37 ℃温箱孵育15 min。PBS冲洗3次，每次3 min，

滴加试剂C，37℃温箱孵育15 min。PBS冲洗3次，每次3 min，DAB显色剂显色。自来水充分冲洗，脱水、透明、中性树胶封片。用图像分析仪进行图像分析，测定其平均灰度值。

2.4 统计学方法 采用SPSS15.0软件进行统计分析，计量资料用表示，组间差异采用方差分析及t检验，以P < 0.05 为差异有统计学意义。

3 结 果

实验结果显示，模型组大鼠关节滑膜的NF-KBp65的阳性染色强度明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。经过甲氨蝶呤、寒痹康汤治疗36 d后，各治疗组的NF-κBp65的表达均下调，接近于正常水平，与正常对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。寒痹康汤组与甲氨蝶呤组比较，疗效相当，差异无统计学意义

（P > 0.05），见表1。

表1 各组大鼠滑膜NF-κBp65表达的平均吸光度值比较 组别 动物数（只） NF-κBp65表达

正常对照组 10 92±8

模型组 10 163±11）

甲氨蝶呤组 10 90±72）

寒痹康汤低剂量组 10 89±72）3）

寒痹康汤中剂量组 10 85±62）3）

寒痹康汤高剂量组 10 83±52）3）

注 与正常对照组比较，1）P < 0.05，2）P > 0.05；3）与甲氨蝶呤组比较，P > 0.05

4 讨 论

RA主要是机体对自身滑膜发生免疫反应的疾病，其病理改变主要为滑膜组织的增生、炎性细胞浸润、血管翳形成以及骨和软骨进行性不可逆性破坏，其中血管翳的形成为一重要的中间环节。滑膜巨噬细胞、淋巴细胞凋亡受抑制是RA滑膜增生的重要因素，TNF-α的作用在此过程至为关键，它通过与TNFR结合使NF-κB信号通路过度活化而启动抗凋亡信号，导致了多种抗凋亡分子的转录，进而抵抗由死亡受体或线粒体依赖途径引发的凋亡。

NF-κB是普遍存在的真核细胞转录因子，在机体免疫反应和细胞增殖等方面发挥中心调节作用。近年来的研究证明，许多疾病的发生和发展均与NF-κB过度激活有关。Yoshida S[3]等的研究表明NF-κB可能对血管形成具有核心的调节作用，并发现血管生成因子中TGF-β、TNF-α、IL-1α、IL-8等含有NF-κB的特异性结合位点，其表达受NF-κB的调控。Han等[4]的研究显示，在II型胶原诱导的大鼠关节炎，NF-κB的活化于免疫后20 d明显增高，在临床症状出现前1～2周，滑膜胶原酶MMP-13及备解素MMP-3基因的表达至第35天才逐步升高。还有研究表明，在大鼠的胶原性关节炎及佐剂性关节炎中均证明NF-κB的表达先于临床症状出现[5]。Benito等[6]采用免疫组织化学及凝胶电泳迁移率改变分析法（EMSA）对早期RA患者关节组织的配对研究显示，在软骨与血管翳交界部位（CPJ），NF-κB阳性细胞绝对值显著高于关节内其他非CPJ部位，提示NF-κB与血管翳生成、关节软骨侵蚀密切相关。因此，NF-κB已成为RA治疗颇有吸引力的靶点和研究热点。

寒痹康汤是笔者治疗活动期RA的经验方，具有补益肝肾、益气温经、祛风除湿止痛之功效。应用秦艽汤及寒痹康冲剂治疗不同证型的RA患者，能明显改善患者症状，并可明显下调RA患者升高的TNF-α及IL-1β的水平[7-8]。动物实验亦表明，寒痹康汤能改善大鼠关节肿胀指数，诱导实验性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡[9]。

本研究表明，寒痹康汤能下调胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞NF-κB的表达，作用与甲氨蝶呤相当，进一步阐明了寒痹康汤治疗RA的作用机理。

5 参考文献

[1] 邓安梅，仲人前，陈孙孝，等.关节炎中B7：CD28/CTLA-4共刺激途径的实验研究[J].中国免疫学杂志，2000，16（8）：412-414.

[2] Larson P，Kleinau S，Holmdahl R，et，al. Homologous Type II collagen induced arthritis in rats[J].Arthritis Rheum， 1990，33（5）： 693-701.

[3] Yoshida S，Ono M，Shono T，et al.Involvement of interleukin-8 vaseular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in tumor necrosis factor alpha-dependent angiogenensis[J].MoI Cell Biol，1997，17（7）：4015-4023.

[4] Han Z，Boyle DL，Manning AM，et al.AP-1 and NF-kappaB regulation in rheumatoid arthritis and murine collagen-induced arthritis[J].Autoimmunity，1998，28（4）：197-208.

[5] Tsao PW，Suzuki T，Totsuka R，et al.the effect of dexam ethasone on the expression of activated NF-kappaB in adjuvant arthritis[J].Clin Immunol Immunopathol，1997，83（2）：173-178.

[6] Benito MJ，Murphy E，Murphy EP，et al.Increased synovial tissue NF-kappaB1 expression at sites adjacent to the cartilage-pannus junction in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum，2004，50（6）：1781.

[7] 庞学丰.秦艽汤加减治疗类风湿性关节炎疗效观察[J].广西中医药，2002，25（1）：11-13.

[8] 庞学丰，刘欢，高立珍，等.寒痹康冲剂对类风湿关节炎细胞因子的影响[J].时珍国医国药，2010，21（11）：2777-2778.

[9] 庞学丰，吴燕红，姚平，等.寒痹康汤对实验性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡的影响[J].风湿病与关节炎，2012，1（1）：42-45.