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[摘要] 目的：研究葛根素通过分子伴侣自吞噬途径保护MPP+损伤的sh-sy5y细胞。方法：以1 mmol・L-1 MPP+损伤SH-SY5Y细胞建立帕金森病细胞模型。采用CCK-8染色检测不同浓度的葛根素对MPP+损伤的SH-SY5Y细胞存活率的影响；透射电镜、AO染色观察自噬体的形成及检测溶酶体活性的变化；RT-PCR检测Lamp2a，Hsc70 mRNA表达的变化，Western blotting法检测细胞内Lamp2a，Hsc70，α-synuclein蛋白的表达。结果：在12.5～50.0 μmol・L-1，预先30 min加入葛根素可以保护SH-SY5Y细胞抵抗MPP+诱导的损伤，并呈一定的量效关系；AO染色和电子显微镜检测25.0，50.0 μmol・L-1葛根素作用于1 mmol・L-1MPP+损伤的SH-SY5Y细胞，细胞内出现自噬体，并且随着葛根素剂量的增加，胞质中形成的自噬体增多；流式细胞术检测结果显示50.0 μmol・L-1葛根素可以拮抗1 mmol・L-1 MPP+诱导的SH-SY5Y细胞内ROS水平的增加，阻止氧化损伤的发生；RT-PCR和Western blotting结果表明在12.5～50.0 μmol・L-1葛根素通过上调细胞内Hsc70，Lamp2a mRNA和蛋白水平保护MPP+造成的SH-SY5Y细胞损伤并抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞α-synuclein蛋白的积聚。结论：葛根素可以拮抗MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤，其保护机制可能与干预分子伴侣自吞噬途径有关。
[关键词] 葛根素；伴侣自吞噬；MPP+；SH-SY5Y细胞；ROS
[收稿日期] 2013-09-05
[基金项目] 国家自然科学基金项目（30973894）；安徽省高校自然科学研究项目（KJ2013Z179）；安徽省自然科学基金项目（1208085QH139）
[通信作者] *李庆林，博士，教授，Tel：（0551）65169051，Fax：（0551）65169371，E-mail：
[作者简介] 王训翠，硕士，高级实验师，Tel：（0551）65169051， E-mail：
帕金森病（Parkinson disease，PD）是一种常见的神经系统变性疾病，其神经病理学特征为黑质致密部多巴胺能神经元进行性变性和缺失，细胞内路易小体的形成。其病因和发病机制至今尚不清楚，近年来，蛋白质的降解障碍被认为是帕金森病发病过程中的重要因素。自噬溶酶体途径和泛素蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）是细胞内2种重要的蛋白降解系统，均参与了路易小体的主要成分即α-synuclein蛋白的降解，尤其是α-synuclein蛋白的积聚物主要依赖于自噬溶酶体通路来清除，与PD的致病机制密切相关[1-3]。自噬是细胞降解细胞器、蛋白聚集物和某些蛋白的一种重要机制，主要有3种形式：大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）。分子伴侣自吞噬途径是通过溶酶体膜的受体将细胞质内的蛋白质转运入溶酶体，然后被溶酶体酶降解。其主要负责细胞内可溶性蛋白的降解，对细胞的新陈代谢以及稳定具有重要的作用。泛素蛋白酶体系统功能失调与帕金森病发病的联系已有大量报道，然而分子伴侣自吞噬途径在多巴胺能神经元退行中扮演的角色特别是中药活性成分通过分子伴侣自吞噬途径干预帕金森病的研究报道尚不多见。本实验室前期对于葛根素通过调控泛素蛋白酶体系统功能干预帕金森病的研究已经发表了多篇的相关研究成果[4-8]，而葛根素是否也可以通过调控分子伴侣自吞噬途径影响帕金森病的发生发展尚未开展深入探讨。本课题鉴于此思路，对此进行研究。
1 材料
1.1 药物与试剂 葛根素（纯度>80%，美国Sigma公司，批号039K0256V）。DMEM高糖培养基和胰蛋白酶（美国Gibco BRL公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；ROS荧光测定试剂盒（上海杰美基因公司）；Lamp2a，Hsc70和β-actin引物（上海生工生物工程公司）；Trizol（美国Invitrogen公司）；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit和PCR Master Mix（Fermentas公司）；Lamp2a一抗（Abcam公司），Hsc70（Santa Cruz Biotechnology公司）和α-synuclein一抗（Bioworld Technology公司）；细胞裂解液（碧云天生物技术研究所）；苯甲基磺酰氟（PMSF，美国 Promega公司）；ECL增强型化学发光试剂盒（美国Thermo Scientific公司）；其他主要试剂均购自美国Sigma公司。
1.2 细胞株 人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所。
1.3 仪器 CO2培养箱、-86 ℃冰箱（日本SANYO公司）；DBI6000倒置荧光显微镜（Leica公司）；CK2型倒置显微镜（日本Olympus公司）；Spectramax M2e多功能酶标仪（美国MD公司）；FACScan流式细胞仪（Becton Dickinson公司）；Gel DOC XR凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）；电泳及转印系统（瑞典Amersham公司）；JEM-1230型透射电子显微镜（日本电子公司）。
图4 葛根素对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞Lamp2a 和Hcs70 mRNA表达的影响（n=3）
Fig.4 Effect of puerarin on the expression of Lamp2a and Hsc70 mRNA in SH-SY5Y cells treated with MPP+（n=3）
3.5 葛根素保护MPP+损伤的SH-SY5Y细胞Lamp2a和Hsc70蛋白的影响 12.5，25.0，50.0 μmol・L-1的葛根素分别处理MPP+损伤的SH-SY5Y细胞，作用24 h后，Western blotting法分析Lamp2a和Hsc70蛋白表达。与模型组比较，葛根素组明显上调了Lamp2a 和Hsc70蛋白的表达（P
图5 葛根素对MPP+损伤的SH-SY5Y细胞Lamp2a和Hsc70 蛋白表达的影响（n=3）
Fig.5 Effect of puerarin on the expression of Lamp2a and Hsc70 in SH-SY5Y cells treated with MPP+（n=3）
3.6 葛根素对SH-SY5Y细胞内α-synuclein蛋白表达的影响 不同浓度的葛根素分别处理MPP+损伤的SH-SY5Y细胞，作用24 h后，Western blotting法分析细胞内α-synuclein的表达。MPP+显著诱导了路易小体主要成分α-synuclein蛋白的积聚，与MPP+组比较，葛根素显著下调了α-synuclein蛋白的表达（P
4 讨论
前期研究证实葛根素对MPP+损伤的SH-SY5Y细胞具有一定的保护作用[5-8]。本实验通过CCK-8法进一步验证了在12.5～50.0 μmol・ L-1，预先30 min加入葛根素可以保护SH-SY5Y细胞抵抗MPP+诱导的损伤，并呈一定的量效关系。
诸多研究已表明PD发病机制主要与神经细胞中α-synuclein蛋白的异常积聚及其降解通路的障碍有关，当易聚集的底物不能通过UPS途径有效清除时，自噬成为不可或缺的降解通路从而弥补了UPS的缺陷而起到对神经细胞的保护作用。在伴侣自吞噬途径降解的过程中，含特定KFERQ五肽模序的蛋白质首先可选择性地被以热休克同源蛋白70（Hsc70）为主的分子伴侣复合物识别，底物-热休克同源蛋白然后和溶酶体膜上的受体Lamp2a结合，去折叠，在lys-Hsc70蛋白的协助下被转运到溶酶体腔中降解。其中底物-热休克同源蛋白和Lamp2a的结合是最主要的限速过程。细胞内溶酶体上Lamp2a的水平是严格控制的，调控CMA的发生和活性[15-18]。大量研究表明，野生型α-synuclein蛋白的降解是通过CMA进行的，它含有CMA识别五肽模序，可被以Hsc70为主的分子伴侣复合物识别，与溶酶体上的受体Lamp2a结合并转运至溶酶体内；突变型的α-synuclein也可以和溶酶体膜上特异性受体结合，但不能被转运进溶酶体腔中被溶酶体降解从而影响了溶酶体对野生型α-synuclein甚至其他蛋白的降解，造成胞内蛋白的聚集和伴侣自吞噬活性的抑制。尽管分子伴侣自吞噬降解途径活性的下降可能会代偿性激活其他降解途径的增强，但最终很难弥补溶酶体途径降解的能力，引起突变型α-synuclein蛋白和其他蛋白的聚集破坏了胞内蛋白的动态平衡，造成了神经毒性作用[19-21]。本研究结果表明在12.5～50.0 μmol・L-1，葛根素通过增强伴侣自吞噬的活性，降低MPP+诱导的α-synuclein蛋白积聚，改善损伤的神经细胞的功能而发挥了保护作用；同时此剂量范围与葛根素其他方面神经保护作用的剂量相近，其体内效应与剂量尚有待进一步的研究。而且本实验的研究目前国内外尚未见相关报道，在本实验中未设阳性对照药组。
图6 葛根素对MPP+损伤的SH-SY5Y细胞α-synuclein蛋白表达的影响（n=3）
Fig.6 Effect of puerarin on the expression of α-synuclein in SH-SY5Y cells treated with MPP+（n=3）
葛根素是一种天然的黄酮类成分，而这类成分结构中存在的酚羟基，具有一定的抗氧化活性。实验结果也显示了MPP+损伤SH-SY5Y细胞可以导致细胞内的ROS释放增加，而葛根素能够明显抑制MPP+引起的ROS释放增加，使氧自由基生成减少，降低氧化应激导致的神经细胞损伤，具有明显的抗氧化活性，而氧化应激损伤是帕金森病发生发展的重要原因。有研究表明，CMA的活性与氧化应激有关，氧化性损伤可使CMA活性增强，溶酶体膜上Lamp2a和hsc70含量增加，而CMA功能障碍增加其对应激因子的易感性[22-23]。本实验结果显示预先加入葛根素可使MPP+损伤的SH-SY5Y细胞产生明显的自噬体；自噬体中的酸性小体也显著增加；ROS的释放显著下降；选择性蛋白Hsc70和Lamp2a的表达增加，减少α-synuclein蛋白的积聚发挥了抑制帕金森病的发展。这些结果提示葛根素可能是通过抑制氧化应激的始动作用，进而通过调控分子伴侣自吞噬方式启动了细胞内的蛋白降解途径，最终发挥其抗帕金森病的效应。结合前期的研究，作者认为葛根素的抗氧化活性是始动机制，在帕金森病的发展过程中葛根素可能通过调控UPS和CMA通路，降解MPP+损伤SH-SY5Y细胞内α-synuclein蛋白积聚，最后实现延缓帕金森病的进程。
采用抗氧化剂干预PD是目前治疗帕金森病的药物机制之一，作为中药活性成分的植物黄酮类成分是良好的天然抗氧化剂。这类中药活性成分是否可以作为将来治疗帕金森病的药物是目前值得深入研究的课题。本研究通过体外建立的帕金森病细胞模型研究葛根素对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的保护作用以及通过伴侣自吞噬途径调控的分子机制，可以为中药及天然药物干预帕金森病提供一些有益的借鉴。
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Effect of chaperone-mediated autophagy in MPP+-induced
SH-SY5Y cells and interventional effect of puerarin
WANG Xun-cui， WANG Xiu， LI Qing-lin
（Experiment Center for Scientific Research， Key Laboratory of Xin′an Medicine Under Ministry of
Education at the Provincial and Ministerial Level， Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230038， China）
[Abstract] Objective： To study the protective effect of puerarin on MPP+-induced SH-SY5Y cells by chaperone-mediated autophagy （CMA）. Method： The Parkinson′s disease cell model was established by injuring SH-SY5Y cells with 1 mmol・L-1 MPP+. The CCK-8 staining was adopted to detect the effect the puerarin of different concentrations on the survival rate of MPP+-induced SH-SY5Y cells. The autophagosome formation was observed under transmission electron microscope. The AO staining showed the changes in the lysosome activity. RT-PCR was used to detect the changes in Lamp2a and Hsc70 mRNA expressions. The western blotting was adopted to test the expressions of Lamp2a， Hsc70 and α-synuclein protein in cells. Result： Within the concentration range of 12.5-50.0 μmol・ L-1， the pretreatment with puerain for 30 minutes could protect the injury of MPP+ in SH-SY5Y cells， and showed a certain dose-effect relationship. The AO staining and electron microscope showed the effect of puerain within the concentration range of 12.5-50.0 μmol・L-1 on 1 mmol・L-1 MPP+-induced SH-SY5Y cells； autophagosomes emerged in cells， and increased along with the rise in the puerarin dose. The results of the flow cytometry revealed that 50.0 μmol・L-1 of puerarin could protect against the increase of the ROS level in 1 mmol・L-1 MPP+-induced SH-SY5Y cells and prevent the oxidative injury. The results of RT-PCR and western blotting indicated that puerain within the concentration range of 12.5-50.0 μmol・L-1 alleviated the MPP+-induced SH-SY5Y cell injury， and inhibited the accumulation of α-synuclein proteins in MPP+-induced SH-SY5Y cells by up-regulating Hsc70， Lamp2a mRNA and protein level. Conclusion： Puerarin could protect against the MPP+-induced cell injury， whose protective mechanism may be related to the chaperone-mediated autophagy pathway of interventional molecules.
[Key words] puerarin； chaperone-mediated autophagy； MPP+； SH-SY5Y cell； ROS
doi：10.4268/cjcmm20140121