电镜超薄切片铅污染问题的探讨

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【摘要】目的:探讨电镜超薄切片铅污染产生的原因及消除污染的对策。方法:严格按照透射电镜生物样品的制备要点进行操作。结果:消除了污染,保证了超薄切片的质量,电镜下拍出高质量的照片。结论:只要工作中精益求精,基本上可以避免切片污染。

【关键词】透射电镜;超薄切片;铅污染

【中图分类号】R444 【文献标识码】B 【文章编号】1006-1959(2009)10-0288-01

组成生物组织的C、H、O、N等元素原子序数较低,散射电子的能力较弱,未经染色的超薄切片在透射电子显微镜下很难看清超微结构。因此常规超薄切片后要经过醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色[1],来增加组织的反差,清晰显示组织细胞的超微结构,从而拍出满意的照片。然而,在超薄切片染色过程中,铅污染问题是每个电镜室普遍存在的棘手问题,它严重影响电镜的观察质量,最终影响到实验的结果。为此,我们总结了多年的实践经验,就铅污染问题进行分析。

1 铅污染产生的原因

柠檬酸铅染液极易与空气中的CO2 结合形成碳酸铅沉淀,在切片上形成不规则、随处可见的高电子密度的颗粒。

2 操作过程中应注意的几个问题

2.1 配制时:配制柠檬酸铅染色液要用新蒸制的双蒸水,染液应放置容量瓶中,盖紧盖子后再用封口膜封好,置于4 ℃冰箱中保存,静置24h后方可使用。当容量瓶壁与染液接触处出现白色沉淀时,染液应废弃。一般不应超过3个月。

2.2 染色时:在培养皿内蜡片周围先放几片NaOH,以吸收培养皿内的CO2,减少污染的机会;吸取染液时,应用干净吸管轻轻吸取液面下中层部分,所需要的染色液最好一次吸出,然后用滤纸过滤,滴到蜡片上,立即盖上盖;在半揭开的状态下,迅速将载网有切片的面向下漂浮在液滴上,操作者不要正对染色液呼吸,一次染片不宜太多;载网从染色液中取出后,应迅速用新蒸制双蒸水充分清洗,一般用三个小烧杯依次溅洗,每个烧杯溅洗50～70次,然后用滤纸片伸到镊子的夹缝中吸去多余的水分,防止切片表面残留的铅染色液与空气中的CO2 结合;镊子夹持载网时要夹持边缘部位,动作要迅速。

2.3 染色器皿清洁干净:染色用镊子、培养皿、小烧杯等所有器皿应保持清洁干净。

3 讨论

透射电镜样品制备技术周期长、过程复杂,铅染色是最后一个环节,又是极易出问题的一个环节。针对铅污染产生的原因,每步操作都应减少与空气的接触时间。实际工作中我们的几点体会是:①超薄切片的质量一定要高,有刀痕、震颤等缺欠的切片极易产生污染;②染色时最好在晴天进行,因为阴雨天气气压低,空气中的CO2 含量高;③以往蜡片反复使用,增加了污染的机会。近一年来我们实验室用封口膜代替蜡片,一次性使用,非常方便,大大减少了污染的机会。

参考文献

[1] 洪 涛. 生物医学超微结构与电子显微镜技术[M]. 北京: 科学出版社, 1984.111-112

[2] 杨勇骥. 实用生物医学电子显微镜技术[M]. 上海: 第二军医大学出版,2003.75-76

[3] 凌诒萍,俞 彰. 细胞超微结构与电镜技术-分子细胞生物学基础[M]. 第2版.上海: 复旦大学出版社, 2004. 124-125

作者单位:116044 辽宁大连医科大学 辽宁省医学细胞分子生物学重点实验室