微生物甲壳质脱乙酰酶的研究进展
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摘要：本文综述了国内外研究甲壳质脱乙酰酶（CDA）的概况，包括酶的微生物来源、性质、底物特性、生物学功能及分子生物学等，以及CDA潜在的应用价值。
中图分类号：Q555+.3文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)07-0038-04
Progress on Chitin Deacetylase
ZHAO Xiang-ying, LIU Li-ping, LIU Jian-jun
(1. Shandong Food Ferment Industry Research & Design Institute, Jinan 250013, China; 2. Shandong Key Laboratory of Food & Fermentation Engineering, 250013 China)
Abstract：This paper reviews the progress on chitin deacetylase(CDA)at home and abroad, such as the microbial source, property, substrate specificity, biological function, molecular biology and so on. The potential application value of CDA is also discussed.
Key words：chitin; chitosan; chitin deacetylase
1甲壳质、壳聚糖与甲壳质脱乙酰酶
甲壳质（chitin）又称甲壳素，是由N-乙酰-D-葡糖胺（GlcNAc）单体通过β-1,4糖苷键连接而成的直链高分子化合物。甲壳质是自然界中最丰富的天然有机化合物之一，其数量仅次于纤维素[1]。甲壳质呈晶体状态，几乎不溶于水和一般有机溶剂，这在很大程度上限制了其应用[2]。
壳聚糖（chitosan）是甲壳质的N-脱乙酰基形式，因其分子中有大量游离氨基，具有良好的生物相容性和生物可降解性，广泛用于食品、医药、轻工、印染、环保和农业等领域[3]。目前多以甲壳质为原料，采用浓碱热化学法生产壳聚糖，污染严重，且脱乙酰程度不易控制[4]。
甲壳质脱乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）能脱除甲壳质分子中的乙酰基，生成壳聚糖。研究表明[5]，用CDA作用于经预处理的甲壳质，脱乙酰度可达97％以上。酶法脱乙酰生产条件温和，专一性强，污染小，有重要的研究开发价值。目前国内外对CDA的研究较少，主要集中于几种真菌。
2CDA的研究概况
最早是1973年Araki等[6]从接合菌纲（Zygomycetes）的双相型真菌Mucor rouxii中发现了CDA，并推测CDA可能与菌体细胞壁中壳聚糖的合成有关。继而研究了M.rouxii产CDA的发酵条件，发现此酶主要存在于胞内[7]。1982年Kauss等[8]从一种植物病真菌Colletotrichum lindemuthianum中提取出CDA并将其部分纯化。这是从非结合菌中发现CDA的最早报道。与M. rouxii不同的是，C.lindemuthianum产生的CDA可以分泌到细胞外，发酵液中的酶活比细胞抽提物中高6～25倍。此后，希腊研究人员深入研究了M. rouxii来源的CDA，包括酶的分离纯化及酶学性质[9]，酶基因克隆以及与其他序列比对[10]和酶对各种底物的作用模式等[11,12]。日本研究人员分离纯化了C.lindemuthianum（ATCC56676）所产的CDA[13]并研究了其作用方式[14]。其他研究者陆续从其他菌株中分离出CDA，如Gao等[15]从1株Absidia coerulea分离纯化出CDA，其酶学性质与M.rouxii CDA的性质有许多相似之处；Alfonso等[16]从Aspergillus nidulans的菌株自溶培养基中分离得到CDA；Mishra等[17]从Saccharomyces cerevisiae分离克隆出CDA基因。最近几年研究者又从多株根霉和担子菌等菌株中分离出CDA，并对其基因进行了克隆测序[18-20]。最近国内也有研究CDA的报道。蔡俊等[21]考察了42株真菌，其中26株具有CDA活性，并初步研究了其中2株高产酶活性菌株的优化产酶条件和酶学性质。蒋霞云等[22]比较了几种霉菌（毛霉、根霉、曲霉和青霉）在对数生长末期和稳定期末期胞内和胞外CDA的活性，并克隆测序[23]了1株总状毛霉（Mucor racemosus）的CDA基因（cDNA）。作者等[24]建立了一种简易脱乙酰基酶的测定方法，用此方法从土壤中筛选到2株产CDA的红球菌，并研究了其产酶条件和粗酶性质，发现此酶最适作用的pH范围宽，在碱性条件下（pH 10～12）表现出较高的酶活性，具有工业开发应用价值（数据整理中，待发表）。文献报道的产CDA微生物见表1。
3CDA的性质
迄今发现的真菌CDA都是糖蛋白，且有良好的热稳定性。但不同来源CDA的存在位置、最适pH值、碳水化合物含量、相对分子质量及离子影响等有较大的差异，见表2。
已报道的来源于微生物的CDA中，C.lindemuthianum和A.nidulans所产的CDA酶活性不受产生乙酸的影响，热稳定性好，并且是胞外酶，易于分离纯化，具有潜在的应用优势。
4CDA的分子生物学
研究表明，CDA氨基酸序列具有同源性，而且都有一个保守片段，此片段与根瘤菌的NodB蛋白、乙酰木聚糖酯酶、木聚糖酶的编码基因中几个开放式阅读框（openreading frames，ORFs）称为“NodB”同源域，是CDA的催化区域[9]。蒋霞云等[23]比较了总状毛霉（Mucor racemosus）与其他从GenBank中收录的CDA基因序列的相似性，它与米根霉（Rhizopus oryzae）（AY225513）、卷柄根霉（Rhizopus circinans）的CDA1（AY861444）和CDA2（AY861445）、鲁氏毛霉（Mucor rouxii）（Z19109）、卵形孢球托霉（Gongronella butler）（AF411810）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）（AY779045）、布拉克须霉（Phycomyces blakesleeanus）（AB046690）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的CDA1（AY557948）和CDA2（AY557951）的基因序列同源性分别为：75 %， 58 %，56 %，56 %，48 %，39 %，39 %，17 %和16 %，相应的氨基酸序列的同源性分别为：69 %，57 %，59 %，55 %，47 %，30 %，32 %，18 %和21 %。分析不同真菌CDA基因系统的发生，表明米根霉、卷柄根霉的CDA1和CDA2、鲁氏毛霉、卵形孢球托霉、匍枝根霉和布拉克须霉之间核苷酸和氨基酸序列有较高的同源性，而与酿酒酵母CDA1和CDA2氨基酸序列的同源性相对较低，约为20%，表明CDA基因在不同的真菌中有着不同的亲缘关系。
5CDA的生物学功能
研究表明，真菌来源CDA的生物学功能主要是参与菌体细胞壁的形成和植物病原体侵染。以M. rouxii为例，甲壳质合成酶（chitin synthetase）通过聚合作用将尿嘌呤二磷酸N-乙酰氨基葡糖（UDP-GlcNAc）中的GlcNAc聚合成甲壳质，CDA随后脱去新生甲壳质链的乙酰基生成壳聚糖[34]。研究表明，从酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中分离到的2种CDA（CDA1p，CDA2p）与其子囊孢子壁形成有关[17]；CDA可将源于菌体细胞壁的甲壳质低聚物脱乙酰，从而降低宿主甲壳质酶降解菌体的可能性，使菌丝穿透植物组织时免于植物甲壳质酶的降解[7]，比如当Colletorichum lagenarium侵染黄瓜叶时，黄瓜叶就会在菌体几丁质诱导下分泌CDA降解菌体顶端细胞中新生的甲壳质，从而达到自我防御的目的。如果菌体细胞中的甲壳质预先被C. lagenarium分泌的CDA脱乙酰，就不会再诱导黄瓜叶分泌CDA，因而抵抗了植物的防御机制。此外，真菌CDA还可能参与细胞壁的降解，菌体自溶时，甲壳质内切酶（endochintinase）将甲壳质水解成为甲壳寡糖，再由CDA与N-乙酰氨基葡糖酶一起进一步降解寡糖 [16]。
6CDA的潜在应用价值
6.1酶法生产壳聚糖
目前，生产壳聚糖主要用强碱法脱乙酰，耗能大、污染严重，并且生产的壳聚糖相对分子质量及脱乙酰度不均一。壳聚糖的脱乙酰度和乙酰基的分布对其物理化学性质和生物活性均有较大的影响[35]。天然存在的甲壳质是不溶性结晶，CDA直接作用效果较差。研究表明，将甲壳质预处理后，再用CDA作用，脱乙酰度能达到97％[5]。如果实现酶法脱乙酰，将给壳聚糖的生产带来一次革命，但因为酶的制备困难，目前这方面的研究还较少。
6.2生物法直接合成壳聚糖
在一些接合菌纲的真菌中，细胞壁中含有高脱乙酰度的壳聚糖，这是细胞中的甲壳质合成酶和CDA一起合成的。如在M. rouxii细胞壁中甲壳质和壳聚糖的比为1:3，A. coerulae中壳聚糖含量占细胞干重的10.4 %，脱乙酰度高达95 %[27]，因此，可通过大规模发酵，获得大量菌体生产壳聚糖。
7展望
迄今报道的CDA基本都来源于真菌，仅1例来源于细菌的专利报道[31]，国内有1例枯草芽孢杆菌产CDA的报道，但作者采用的酶活性测定方法不正确[36]。真菌来源的CDA主要作用是自身细胞壁的合成，最适底物一般为甲壳寡糖，对甲壳质的活性较低，不适合用酶法脱乙酰生产壳聚糖。从环境中筛选性能优良的产酶菌仍是开拓CDA工业应用的重要方向。每年自然界都产生上亿吨的甲壳质，又以同样的速度消耗，所以，自然环境中一定存在丰富的产CDA的微生物资源。但目前所研究的菌株多为已知保藏菌株，从自然环境中直接筛选的很少，主要原因是CDA酶活性检测困难、费用高，阻碍了从自然环境中筛选产酶菌株工作的开展，造成CDA来源单一。作者等[24]建立了一种简易脱乙酰基酶测定方法，适合从自然环境中筛选产酶微生物，对CDA的多元化的研究具有重要意义。
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