柑橘溃疡病菌检测方法及防治技术研究进展

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摘要 从核酸杂交技术、DNA指纹图谱分析、PCR检测方法等方面对柑橘溃疡病菌检测方法及柑橘溃疡病的防治技术进行综述，并对柑橘溃疡病菌今后的研究方向进行展望，以供参考。

关键词 柑橘溃疡病菌；检测方法；防治技术

中图分类号 S436.661 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）22-0112-03

柑橘溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis pv. citri）属于国内外重要的检疫性有害生物，其病原菌为地毯草黄单胞柑橘致病变种。柑橘溃疡病在我国柑橘产区均有发生，在湖南、浙江、福建、云南、江西、广西、广东、贵州等南方柑橘种植省份（区）发生较为普遍，在四川、重庆、湖北等省份（市）有局部零星分布。柑橘感染溃疡病后，在叶、枝、果实上形成火山口状的病斑，后期可造成落叶、落果，严重影响柑橘果实的产量和品质。该文对柑橘溃疡病菌检测鉴定技术及防治措施进行了综述，并对今后柑橘溃疡病研究进行了展望，以为柑橘溃疡病的检测及防治提供参考依据和理论支持。

1 柑橘溃疡病菌检测鉴定方法研究

柑橘溃疡病菌的检测方法包括生物学检测法和现代分子检测技术。生物学检测法主要是按照“柯赫氏法则”来确定溃疡病病原物；而现代分子检测技术主要是通过现代分子生物学的技术手段，通过对病原物的基因进行检测分析。20世纪90年代以来，随着分子生物学的迅速发展，DNA杂交诊断、DNA指纹图谱分析、PCR检测等技术广泛应用，与植物致病性相关的基因不断地被鉴定和克隆出来，许多重大植物病害的检测鉴定已逐步进入分子水平。分子水平的检测具有快速、准确、灵敏的特点，可以满足国内外对植物检疫的要求，已成为当今植物病原物最重要的检测鉴定手段之一。

1.1 核酸杂交技术

核酸杂交技术是一种分子生物学的标准技术，用于检测DNA或RNA分子的特定序列。核酸杂交技术用于溃疡病的检测原理是假设柑橘溃疡病菌基因组中有一系列随机的克隆DN段，因而可以根据其能与感病植物的DNA杂交而不与健康植物的DNA杂交进行筛选。因此，柑橘溃疡病菌特异性的DNA序列可进行标记用作DNA-DNA杂交分析中的探针。国外学者Hartung根据柑橘溃疡病A菌系质粒DNA的BamHI片断以及此片段内部的EcoR I片断，设计了2个探针，首次用核酸杂交技术对柑橘溃疡病菌进行了分子检测研究[1]。研究结果表明，这2个探针同柑橘溃疡病A菌系的杂交率为100%，同柑橘溃疡病B、C菌系的杂交率分别为86.7％和73.3％，同柑橘溃疡病其他菌系也均有较高的特异性（这2个探针不能检测柑橘溃疡病的E菌系）。核酸杂交技术相对于传统的接种检测技术，最大的优势在于缩短了检测时间，但是采用核酸杂交技术检测柑橘溃疡病菌整个过程比较繁琐，费时费事。因此，需要探索其他更加准确、快速、灵敏的检测技术来进行溃疡病菌的早期检测。

1.2 DNA指纹图谱分析

由于生物的不同个体、不同种群在DNA结构上存在明显的差异，因而可以通过限制性内切酶酶切片段长度多态性分析（RFLP）、随机扩增多态性分析（RAPD）、串联重复序列分析（short tandem repeat，PCR-STR）等多种检测手段，进行DNA多态性的检测，构建DNA指纹图谱分析。在柑橘溃疡病菌菌种鉴定中，可以通过DNA指纹图谱分析法进行菌系的划分。目前已有学者用RFLP进行柑橘溃疡病菌菌系研究的报道。DNA指纹图谱分析柑橘溃疡病运用较多的是RFLP分析，其方法是：分别提取标准柑橘溃疡病菌和待测菌株的基因组DNA（质粒DNA），用限制性内切酶水解，经聚丙烯酰胺凝胶电泳和染色照相，最后将待测菌株与溃疡病菌的DNA指纹图谱进行比较分析，即可确定待测菌株的菌系类型。Hartung et al[2]对柑橘溃疡病各菌系的基因组DNA进行RFLP分析，很容易将柑橘溃疡病菌的A菌系和其他的B/C/D以及E 2种菌系区分开来。Pruvost et al对溃疡病菌的质粒DNA进行RFLP分析，也可以将溃疡病各菌系区别开来。

由于DNA 指纹图谱具有高变异性、多位点性、简单而稳定的遗传性，所获得的谱带具有简单、易于分析，不受菌株是否纯培养的限制，同时还具有效率高、特异性强的特点，广泛用于植物病原微生物的发现、分类鉴定、遗传多样性的分析等。

1.3 PCR检测方法

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），是一种模拟生物DNA体内复制过程的体外DNA扩增技术，其过程主要分为3个部分：DNA变性、退火、延伸。20世纪80年代以来，PCR技术发展十分迅速。除常规的PCR技术外，目前用于植物病原菌检测的还有联合PCR（Co-operational PCR）、免疫捕获PCR（Immuno capture PCR，IC-PCR）、巢式PCR（Nested PCR）、竞争PCR（competitive PCR）以及实时荧光PCR技术等。这几种PCR检测技术各有其优点和缺点，在研究工作中要根据实际情况具体选择。PCR检测技术与DNA杂交技术相比，具有更快速、更灵敏的优点。1996年，Hartung从4.2 kb大小的 BamH I片段中得到了一段572 bp的亚克隆片段，根据这段序列设计了一对引物用于柑橘溃疡病菌的PCR检测。此后，Hartung et al[3]又将巢式PCR技术以及免疫捕获PCR技术结合起来，通过对柑橘溃疡病菌的2次PCR检测以及特异性的捕获PCR技术的应用，克服了常规PCR检测微量病原菌样品的假阴性，提高了检测的灵敏度。王中康等[4]根据溃疡病菌全基因组序列的保守区域，设计并筛选出了一对特异性引物JYF5/JYR5用于溃疡病菌的PCR检测，结果表明PCR检测具有较好的检测特异性、稳定性和灵敏度。同时，比较了PCR与斑点免疫结合技术（DIA）及传统的生物学致病性测定法在检测稳定性、灵敏度及样品检出率各方面的差异。结果表明，PCR检测技术无论是检测稳定性还是检测的灵敏度均优于斑点免疫结合技术及传统的生物学致病性测定法，PCR检测尤其在无症带菌样品的检测方面更具优势。董 欢等[5]通过优化PCR反应条件，建立了一种特异、快速、准确的柑桔溃疡病检测方法，将溃疡病菌的浓度检测下限提升到60 cfu/mL，较常规的生物学鉴定具有更加省时和快速的优点。等[6]根据柑橘溃疡病菌的大质粒和pthA基因序列设计了一对特异性引物，通过long-PCR方法，得到包括pthA完整编码区及两端部分非编码区在内的大约4.1 kp的DN段，为进一步研究pthA基因在柑橘中的表达情况，探究pthA的作用机理，以及柑橘溃疡病的抗病分子育种研究提供了参考依据。

实时荧光PCR技术较常规PCR技术相比，具有更加迅速、灵敏、方便的特点。实时荧光PCR最大的优点是可以对植物病原菌进行定量分析，缺点是成本较高。殷幼平等根据溃疡病Xac306菌株独有的蛋白基因序列设计了特异性引物对和探针，建立并优化SYBR Green I荧光染料和Taq-Man探针实时荧光定量PCR检测技术体系。结果表明实时荧光PCR技术对Xac病菌的检测灵敏度达到1~5个细菌/反应，较常规PCR灵敏度提高2~3个数量级，特别适用于柑桔早期无症带菌样品的检测。

2 柑橘溃疡病防治技术研究

2.1 选择溃疡病抗性较强的品种

柑橘溃疡病对柑橘属植物的相对致病性是不同的，具体见表1。因此，品种选择需依据当地柑橘溃疡病菌的株系，选择对溃疡病菌抗性较强的品种。我国分布的溃疡病菌系基本都属于致病性较强的A菌系，葡萄柚、墨西哥柠檬以及几个早、中熟的甜橙容易受到柑橘溃疡病A菌系的侵染，所以上述品种不推荐大规模种植，除非有精细的防治措施进行控制。

研究证明，柑橘不同品种对溃疡病感病性的差异主要与柑橘表皮的组织结构有关。柑橘溃疡病病菌主要通过植株的气孔和机械伤口进入组织而导致患病，因此柑橘叶片气孔的数目、结构和运动影响病菌的侵染情况。橙类叶片的气孔最多，而且中隙也最大，容易受到溃疡病菌的侵染，最宜感病；宽皮柑橘一般气孔较少，且中隙也较小，比较抗病；柚类的气孔数量和大小处于橙类和宽皮柑橘之间，为中度感病；金柑的气孔数量最少，且中隙最小，抗病性最强[7]。因此，在选择同类别的柑橘品种时，在品质相当的前提下，可选择叶片气孔少、叶片较厚的品种，可有效地提高抵抗溃疡病的能力。

2.2 严格实施植物检疫，加强栽培管理

2.2.1 严格执行植物检疫措施，杜绝外来溃疡菌源传入。柑橘溃疡病属于国内外重要的检疫性病害，禁止从病区、疫区调入柑橘苗木、砧木、接穗、种子、果实等。无病区和新区对外来的柑橘苗木等繁殖材料要经过严格的植物检疫，确认无溃疡病菌后才可种植，查出带有溃疡病斑的一律烧毁。防控溃疡病比较好的一项措施就是建立无病苗圃，培育无病苗木。通过建立无病菌母本园，就地提供无溃疡病接穗，大大降低溃疡病扩散的速度。砧木及接穗等繁殖材料均需经过消毒才能进入无病苗圃。在柑橘育苗过程中，发现带病植株应及时销毁，并对附近的健康幼苗作喷药保护处理，出圃的柑橘幼苗要经过严格的植物检疫，确认是健康的无病苗木，方可出圃[8]。

2.2.2 加强栽培管理措施。研究证明，柑橘的抗病性和栽培管理措施存在相关性。精细管理的橘树，其树势好，抗各种侵染性病害的能力大大增强。在柑橘栽植过程中，根据不同品种自身的生物学特性，制定并实施合理的肥水管理方案，合理施肥，多施用农家肥代替化肥，可以有效抵抗各种病虫害的侵染。同时，在橘园提倡生草栽培，少用或不用除草剂，不仅可以涵养水源，保持橘园的湿度，利于橘树的生长；而且生草环境可为各种病虫害的天敌提供栖息生活的场所，减少溃疡病的发生程度。对特殊地形的橘园要注意采取适当的管理措施，比如河滩低洼的果园要做好挖沟排渍工作，而山地和平地要实行起垄栽培。此外，控制夏梢的生长，促使枝梢和果实健壮，增强树的长势，增强植株抵抗溃疡病的能力。

2.3 药剂防治

国内外学者对柑橘溃疡病的药剂防治做了较多的研究工作，进行了大量的药效试验，为溃疡病的化学药剂防治提供了参考依据。胡小三[9]对永州地区柑橘溃疡病的发生及防治进行了研究，发现农用链霉素是防治柑桔溃疡病较为理想的药剂，并且当其浓度为300~1 100 IU/mL时，对橘树的春、夏、秋梢以及幼果具有较好的防治效果。此外还发现，50%代森铵500倍液的护叶效果比1∶2∶100波尔多液要好，甲基托布津的护叶效果最差。孙惠敏等[10]用抑菌圈法测定了5种含铜药剂和17种非铜药剂对柑桔溃疡病的毒力及田间防治效果，结果表明30％金核霉素可湿性粉剂500 mg/L对柑橘溃疡病的防效最高，达76.34%，其次是72％农用链霉素可湿性粉剂200 mg/L，处理防效为74.94％，这2种药剂的防效显著优于其他药剂处理。此外，80％代森锰锌、50％福美双和50％福美双·溴菌腈处理对柑橘溃疡病的防效分别为70.36％、66.55％和69.37％。而大蒜素和叶青双对柑橘溃疡病防效较差，显著低于对照含铜药剂20％噻菌铜的处理。李克才等[11]研究表明，龙克菌乳油用于脐橙溃疡病防治时与1 000万IU农用硫酸链霉素300 g/hm2具有相当的防治效果。傅志华等[12]研究表明，77%可杀得可湿性粉剂500倍液、60%百菌清可湿性粉剂400倍液和400 mg/kg新植霉素对柑橘溃疡病的防治效果较好，防效分别为94.00%、86.90%和80.43%；而14%胶氨铜水剂200倍液和20%叶青双可湿性粉剂500倍液的防治效果分别为63.39%和30.03%，均明显低于前3种药剂。

对柑橘溃疡病的药剂防治要注意施药时间。一般来说，在夏梢和秋梢新芽萌动，芽长大2 cm左右，以及花谢后10、30 d喷药的防治效果较好。同时，应掌握喷药的最佳时期是在溃疡病害快要发生的前夕开始喷药效果最好。防治柑橘溃疡病的化学药剂较多，不少新药剂也显示出较好的防效，各地可按其成本与效果灵活选择。同时，还要注意农药的轮换使用，以防产生抗药性。

3 问题与展望

综上所述，作为一种检疫性病害，柑橘溃疡病的检测及防治技术还比较薄弱，进展比较缓慢。截至目前，仍无法找到一种较好的办法根治柑橘溃疡病，对溃疡病的大面积防控主要还是采取植物检疫措施，控制溃疡病不断蔓延的趋势。现代分子技术的应用，为溃疡病菌的早期诊断，尤其是无症带菌苗木的快速检测开辟了新的途径。PCR检测以其快速、准确、灵敏成为重要的一项检测技术，值得推广应用。但值得注意的是，对柑桔溃疡病菌的最终鉴定，必须以其在人工接种的感病寄主上产生典型症状的致病性试验结果为依据。自从中国加入WTO组织后，随着柑橘国际贸易的频繁发生，柑橘溃疡病严重制约了我国柑橘种苗、果品的出口，国际贸易对柑橘溃疡病的快速检测提出了更高的要求，我国需尽快开发溃疡病检测的新型试剂盒，以满足进出口岸的检疫要求。

现代化学药剂不仅具有杀菌或抑菌的活性，而且可以调节植物病原菌的生理机能。由于植物病原菌极其容易对化学药剂产生一定的抗药性，特别如2-氨基一嘧啶类、苯酰胺类这些具有单个作用位点的杀菌药剂，一般在使用2年后即可产生抗药性。因此，在溃疡病防治过程中需加强药剂选择，尽量避免长期使用同一种农药。同时，对柑橘溃疡病不能过分地依赖于化学药剂防治，也需从其他途径加深对溃疡病的防控技术研究，如生物防治及抗溃疡病育种技术。

4 参考文献

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[12] 傅志华，徐展华，许渭根.柑橘橘溃疡病田间消长规律及药剂防治技术[J].植保技术与推广，2000，20（6）：34-35.