葛根素对溶血磷脂酰胆碱诱导血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶-9表达的影响

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[摘要] 目的:观察葛根素对血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响,探讨葛根素抗动脉粥样硬化(AS)的作用机制。方法:用不同浓度(1.0~10.0 mg/L)的溶血磷脂酰胆碱(LPC)孵育体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞24 h,观察培养上清液中MMP-9含量的变化。不同浓度(10-6~10-4 mol/L)的葛根素预先孵育平滑肌细胞4 h,然后加入LPC(5.0 mg/L)作用24 h,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清液中MMP-9含量,实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测平滑肌细胞MMP-9 mRNA的表达,蛋白印迹法(Western blot)检测NF-κB p65蛋白的表达。结果:LPC能明显增加上清液中MMP-9的含量,而预先应用不同浓度的葛根素干预后,MMP-9含量、mRNA表达以及NF-κB p65蛋白的表达水平均明显降低,并且具有剂量依赖性。结论:LPC通过激活NF-κB p65而使平滑肌细胞MMP-9表达增强,而葛根素对上述效应具有抑制作用。

[关键词] 葛根素;溶血磷脂酰胆碱;动脉粥样硬化;基质金属蛋白酶-9;平滑肌细胞

[中图分类号] R285.5[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)04(b)-015-03

Effect of Puerarin on the expression of matrix metalloproteinase-9 induced by lysophosphatidylcholine in vascular smooth muscle cells

CAI Zhichun1, WANG Songqing1, FANG Yunxiang2

(1.Changde Vocational Technical College, Changde 415000, China; 2.Department of Pharmacology, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410078, China)

[Abstract] Objective: To observe the effect of Puerarin on the expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) induced by lysophosphatidylcholine (LPC) and investigate the anti-atherosclerosis mechanism of Puerarin. Methods: The vascular smooth muscle cells (VSMCs) were incubated with different concentrations of LPC (1.0-10.0 mg/L) for 24 h to detect the level of MMP-9 in supernatants. The VSMCs were treated with LPC (5.0 mg/L) for 24 h following pretreatment with various concentrations of Puerarin(10-6-10-4 mol/L) for 4 h. The level and mRNA expression of MMP-9 were determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (real-time RT-PCR) respectively. Western blot analysis was used to investigate the activity of nuclear factor kappa B p65 (NF-κB p65). Results: LPC significantly increased the level of MMP-9. The increased level and mRNA expression of MMP-9, and the activity of NF-κB p65 were markedly inhibited by different concentrations of Puerarin in a dose-dependent manner. Conclusion: LPC enhances the expression of MMP-9 by activating NF-κB p65 in VSMCs, while Puerarin is able to inhibit these effects.

[Key words] Puerarin; Lysophosphatidylcholine; Atherosclerosis; Matrix metalloproteinase-9; Smooth muscle cells

在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的形成过程中,氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)是重要的损伤因素[1],除可通过促进内皮细胞(endothelial cell,EC)凋亡和平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)增殖外[2-3],还能诱导基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)的产生而参与AS的发生及发展[4]。研究表明,溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LPC)是ox-LDL的主要脂质成分,能模拟ox-LDL的主要作用[5],其在AS发病中的作用也越来越受到重视。

葛根素是从中药葛根中提取的有效成分之一,具有调节血管活性物质、改善微循环、减轻钙超载等作用,已广泛应用于各型心血管疾病的治疗。研究发现,葛根素通过调节糖尿病肾病大鼠肾组织MMPs的表达而具有改善肾功能的作用[6],但是其在SMCs中的作用的研究较少。因此,本实验用LPC处理体外培养的SMCs,观察葛根素对MMP-9表达的影响,并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、仪器及药物

胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶、Trizol Reagent均购自Gibco公司;LPC和PDTC(NF-κB特异性阻断剂)购自Sigma公司;MMP-9 ELISA试剂盒和SYBR Green Ⅰ RT-PCR试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司;NF-κB p65单克隆抗体购自武汉博士德公司;葛根素注射液(东药欣舒)由山东方明药业股份有限公司生产;其余试剂均为国产分析纯。主要仪器有5% CO2恒温培养箱(SANYO,日本),细胞超净工作台(北京昌平长城空气净化工程公司),倒置显微镜(Olympus,日本),7500型实时荧光定量PCR仪及分析软件SDS(Applied Biosystems,美国)。

1.2 SMCs的原代培养

原代培养采用组织贴块法,培养液为20%胎牛血清加DMEM培养液。取大鼠胸主动脉,中间剪开,放入D-Hank液中冲洗,剥净外膜后用弯头吸管轻轻刮除内膜,撕取内2/3层中膜组织,剪成约1 mm2的小组织块接种于培养瓶内。培养瓶至于37℃、5% CO2培养箱内,待SMCs贴壁4 h后加培养液1 ml,然后置于37℃、5% CO2培养箱内培养24 h后补液至5 ml,以后每隔3~5 d换液,倒置显微镜下动态观察细胞生长情况。细胞生长融合出现“峰与谷”后,用含0.125%胰蛋白酶和0.01% EDTA的混合消化液传代培养。第三代细胞用抗α-actin肌动蛋白免疫组化进行鉴定。实验用第3~7代细胞,按5×105个/ml接种于6孔板中培养。待细胞融合后,换用无血清的DMEM培养液培养24 h,使细胞同步化,然后即可进行分组实验。

1.3 实验分组

实验共分为四组,正常对照组:SMCs中不加任何试剂;LPC处理组:不同浓度(1.0~10.0 mg/L)的LPC孵育SMCs 24 h;葛根素组:根据葛根素浓度(10-6~10-4 mol/L)的不同分为三个亚组,在每个亚组中先加入葛根素预处理4 h,然后加入5.0 mg/L的LPC孵育24 h;PDTC组:PDTC预先孵育SMCs 2 h,然后加入5.0 mg/L的LPC作用24 h。

1.4 实时荧光定量PCR检测MMP-9 mRNA的表达

细胞完成相应处理后,用Trizol提取各处理组细胞总RNA,逆转录合成cDNA第一链,取cDNA进行PCR扩增。MMP-9引物序列,上游:5’-CTT CGA GGG CCA CTC CTA CT-3’,下游:5’-CAG TGA CGT CGG CTC GAG T-3’(129 bp);GAPDH引物序列,上游:5’-CCT CAA GAT TGT CAG CAA T-3’,下游:5’-CCA TCC ACA GTC TTC TGA GT-3’(141 bp)。

1.5 Western blot 检测核提取物NF-κB p65蛋白的表达

细胞处理完毕后,用胰酶消化收集细胞,PBS冲洗、离心,将沉淀重悬于500 μl低渗液中,冰浴15 min,加入25 μl 10% NF-40溶液,振荡、离心,沉淀重悬于100 μl裂解液中,再次振荡、离心,取上清即为白,分装并保存于-70℃冰箱中备用。取核提取物与等体积的2× 电泳加样缓冲液混合后煮沸。配制10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶,每一泳道上加40 μl进行凝胶电泳分离蛋白,然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上过夜。将转印蛋白质后的硝酸纤维素膜置于非特异性血清封闭液中,室温封闭1 h,继之将膜与用封闭液稀释的NF-κB p65单克隆抗体(1∶100)4℃过夜,漂洗后与1∶500稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG室温反应1 h。化学发光法显色,X线片曝光。将X线片用扫描仪采集图像,用Geipro软件系统分析平均灰度值,以同一标本β-actin的产物灰度值作为内参,并计算相对值。

1.6 ELISA法检测培养上清液中MMP-9的含量

操作严格按照说明书进行。

1.7 统计学分析

采用SPSS 11.0软件进行统计学处理,数据以均数±标准差(x±s)表示,多组间差异比较用方差分析,组间比较用q检验,P

2 结果

2.1 不同浓度LPC对SMCs培养上清液中MMP-9含量的影响

正常情况下,SMCs分泌的MMP-9水平极低。不同浓度(1.0~10.0 mg/L)的LPC作用24 h后,MMP-9明显升高,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P

表1不同浓度的LPC对SMCs分泌MMP-9的影响(x±s)

与正常对照组比较,*P

2.2 葛根素对上清液中MMP-9含量、SMCs MMP-9 mRNA和NF-κB p65蛋白表达的影响

由于LPC在5.0 mg/L时对SMCs分泌MMP-9具有最强的诱导作用,因此本实验选择LPC 5.0 mg/L这一浓度来观察葛根素对LPC诱导SMCs MMP-9含量、mRNA和NF-κB p65蛋白表达的影响。结果显示,正常对照组细胞MMP-9含量、mRNA和NF-κB p65蛋白表达水平均较低,LPC(5.0 mg/L)作用24 h后,MMP-9含量、mRNA和NF-κB p65蛋白的表达明显升高(P

表2葛根素对上清液中MMP-9含量、SMCs MMP-9 mRNA

和NF-κB p65蛋白表达的影响(x±s)

与正常对照组比较,**P

图1 Western blot检测SMCs核提取物NF-κB p65蛋白的表达

[1:正常对照组;2:LPC组;3:葛根素(10-6 mol/L)组;4:葛根素(10-5 mol/L)组;5:葛根素(10-4 mol/L)组;6:PDTC组]

3 讨论

MMPs是一组同源的以无活性酶原形式分泌的Zn2+依赖性肽链内切酶,能分解细胞外基质(extracellular matrix,ECM),并参与胚胎正常发育及组织重塑。激活后的MMPs参与多种病理过程,如炎症反应、肿瘤转移和脑血管疾病等。另外,大量研究证实,激活后的MMPs在AS的发生和发展中起着重要的作用[7-8]。MMP-9即明胶酶B,是MMPs家族成员之一。研究证实,MMP-9可加剧炎症反应,从而促进AS的形成[9]。MMP-9的高表达可降解细胞外基质,促进血管平滑肌细胞的增殖和移行。另外,过度分泌的MMP-9也可通过降解纤维帽内的胶原,促进动脉粥样硬化斑块的破裂[10],从而增加恶性心血管病事件的危险[11]。临床研究表明,冠状动脉内径狭窄程度与MMP-9呈正相关,冠心病患者血清MMP-9水平高于正常人[12],提示MMP-9与AS的发生、发展、斑块破裂、冠状动脉血管闭塞以及急性心血管事件的发生有着密切的关系。因此,如能抑制MMP-9的过度合成,将有可能延缓AS的形成和降低急性心血管事件的发生。

葛根素是豆科属植物葛根中异黄酮的主要有效成分,其化学名为4,7-二羟基-8-β-D-葡萄糖基异黄酮。研究发现,葛根素具有抗心律失常、降血压、扩张冠状动脉、减轻缺血-再灌注损伤、影响血流动力学等作用,因而在心血管系统疾病中广泛应用。

本实验观察到,LPC能够增加SMCs MMP-9 mRNA表达和培养上清液中的MMP-9含量,而预先应用不同浓度的葛根素处理后,SMCs MMP-9 mRNA表达和上清液中的MMP-9含量均明显降低,并且随着葛根素浓度的升高,上述抑制效应也逐渐增强,即具有剂量依赖性。由于NF-κB是调节基因转录的关键因子之一,参与许多基因特别是与机体防御功能及炎症反应有关的基因的表达调控,因此推测,本实验中MMP-9表达的变化可能与NF-κB活性变化有关。笔者用Western blot检测了SMCs核提取物中NF-κB p65蛋白的表达水平,以此来反映NF-κB的活性。结果显示,LPC能明显增加NF-κB p65蛋白的表达,而预先应用不同浓度的葛根素干预后,在显著降低NF-κB活性的同时,SMCs MMP-9 mRNA表达和上清液中MMP-9含量也明显减少,这与预先应用NF-κB特异性阻断剂PDTC得到的结果一致。以上结果说明,葛根素可能通过抑制NF-κB的活性而抑制MMP-9的过度合成,进而延缓AS的形成和降低急性心血管事件的发生。

[参考文献]

[1]Tsimikas S. Oxidized low-density lipoprotein biomarkers in atherosclerosis [J]. Currrent Atherosclerosis Reports,2006,8(1):55-61.

[2]Choi JS, Chui YJ, Shin SY, et al. Dietary flavonoids differentially reduce oxidized LDL-induced apoptosis in human endothelial cells: role of MAPK- and JAK/STAT-signaling [J]. J Nutr,2008,138(6):983-990.

[3]Zhao GF, Seng JJ, Zhang H, et al. Effects of oxidized low density lipoprotein on the growth of human artery smooth muscle cells [J]. Chin Med J (Engl),2005,118(23):1973-1978.

[4]Akiba S, Kumazawa S, Yamaguchi H, et al. Acceleration of matrix metalloproteinase-1 production and activation of platelet-derived growth factor receptor beta in human coronary smooth muscle cells by oxidized LDL and 4-hydroxynonenal [J]. Biochim Biophys Acta,2006,1763(8):797-804.

[5]Matsumoto T, Kobayashi T, Kamata K. Role of lysophosphatidycholine (LPC) in atherosclerosis [J]. Curr Med Chem,2007,14(30):3209-3220.

[6]Duan HJ, Liu SX, Zhang YJ, et al. Effects of puerarin on renal function, expressions of MMP-2 and TIMP-2 in diabetic rats [J]. Yao Xue Xue Bao,2004,39(7):481-485.

[7]Liu P, Sun M, Sader S. Matrix metalloproteinases in cardiovascular disease [J]. Can J Cardiol,2006,22(Suppl B):25B-30B.

[8]Beaudeux JL, Giral P, Bruckert E, et al. Matrix metalloproteinases, inflammation and atherosclerosis: therapeutic perspectives [J]. Clin Chem Lab Med,2004,42(2):121-131.

[9]Schonbeck V, Mach F, Libby P. Generation of biologically active IL-1β by matrix metalloproteinase: a novel caspase-1-independent pathway of IL-1β processing [J]. J Immunol,1998,161(7):3340-3346.

[10]Lofus IM, Naylor AR, Goodall S, et al. Increased matrix metalloproteinase-9 activity in unstable carotid plaques. A potential role in acute plaque disruption [J]. Stroke,2000,31(1):40-47.

[11]Orbe J, Fernandez I, Rodriguez JA. Different expression of MMPs/TIMP-1 in human atherosclerotic lession. Relation to plaque features and vascular bed [J]. Atherosclerosis,2003,170(2):269-276.

[12]梁小萍,戴勇,石丹,等.血清基质金属蛋白酶-9与冠心病相关性的临床研究[J].中国心血管杂志,2002,7(2):94-95.

(收稿日期:2010-01-11)